全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-28
基金项目:广东省科技攻关重大专项(2007A020400006)
作者简介:左珂菁(1982-),研究生,研究方向:基础兽医学、免疫学
通讯作者:谢青梅,Tel:020-85280283,E-mail:qmx@scau.edu.cn
抗微生物肽可由细菌、真菌、以及动植物细胞
产生[1~3]。在单细胞生物体中产生的抗微生物肽,可
以增强其自身的竞争优势[3,4]。在多细胞生物体中,
抗微生物肽是先天性免疫系统极其重要的组成成
分,可以抵抗外来微生物的入侵[2,5]。抗微生物肽一
般为线性螺旋状结构,富含半胱氨基酸残基,含一
个或多个分子内二硫键[2,6]。一般来说,抗微生物肽
作用于微生物有两种作用机理:(1)抑制细菌生长。
具有抑菌活性的抗微生物肽主要通过减少细菌生
长所必需的营养物质或使其新陈代谢停止来抑制
细菌生长;(2)杀灭病原微生物。具有杀菌活性的抗
微生物肽是通过破坏靶细胞的细胞膜或改变膜电
势,导致细胞死亡。
由于抗生素易产生耐药性,人们越来越关注抗
微生物肽的抗菌特性。抗微生物肽对产生耐药性的
病原体和敏感病原体都具有抵抗活性[7,8]。抗微生
物肽对靶细胞有选择性:有些作用于带负电的细胞
膜;有些限制某些特异的金属元素和维生素;有些
抑制蛋白酶作用或水解一些特异的化学键,同时保
持宿主和非靶细胞完好无损[9]。
抗微生物肽已被广泛用作食品添加剂和治疗
性药物。如鸡蛋清溶菌酶可用作食物防腐剂,也
可用于保存奶酪、葡萄酒和豆腐等;还有一种由
乳酸乳球菌产生的抗微生物肽——乳酸链球菌素
(Nisin),常被用作奶酪制品的添加剂[10,11]。有学者
用含有抗微生物合成肽培西加南(pexiganan)的乳
剂来减少皮肤的病毒感染,这种肽是从非洲爪蛙表
皮分离的蛙皮素(magainin)的衍生物。有学者将抗
禽抗微生物肽的结构、分布及活性研究进展
左珂菁 1 张祥斌 2 冀君 2 陈峰 2 杨小梅 2 梁梓森 1 谢青梅 2
(1华南农业大学兽医学院,广州 510642;2华南农业大学动物科学学院,广州 510642)
摘 要: 抗微生物肽是生物体产生的一种具有抗微生物活性的多肽,具有抵抗原生动物、真菌、病毒、革兰氏阳性
菌和革兰氏阴性菌的活性,不易产生耐药性,有取代传统抗生素的发展趋势。众多学者对禽类抗微生物肽进行了大量的
研究,从禽类中陆续分离到20多种新的抗微生物肽,主要综述了禽抗微生物肽的结构、分布及活性研究进展,为禽抗微生
物肽的进一步探索研究奠定基础。
关键词: 禽类 抗微生物肽 结构 分布 活性
AvianAntimicrobialProteins:Structure,DistributionandActivity
ZuoKejing1 ZhangXiangbin2 JiJun2 ChenFeng2 YangXiaomei2 LiangZisen1 XieQingmei2
(1ColegeofVeterinary,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642;2ColegeofAnimalScience,SouthChina
AgriculturalUniversity,Guangzhou510642)
Abstract: Antimicrobialproteinswhichareproducedbylivingbodyareactiveagainstprotozoans,fungi,virusesas
welasgram-positiveandgram-negativebacteriaandarecapableofevadingbacterialresistancemechanisms.Duetothese
characteristics,theseproteinsrepresentanappealingalternativetoconventionalantibioticdrugs.Considerableresearchhas
beenconductedonantimicrobialproteinsandover20novelantimicrobialproteinshavebeenisolatedfromavainsystems.
Inthisreview,thestructure,distributionandactivityofantimicrobialproteinsweresummarized,andaswelasthefuture
ofavianantimicrobialproteinresearch.
Keywords: Avian AntimicrobialproteinsStructure Distribution Activity
2008年第4期
微生物肽,如 α-防御素、天蚕抗菌肽(从巨型丝蛾
Hyalophoracecropia上鉴别得到)和蛙皮素等用于治
疗各种传染性疾病[6]。乳酸链球菌素(Nisin)和蛙皮
素一类的抗菌剂,因为其具有杀精子的作用和抗菌
活性,被认为具有潜在的避孕功能[6,12]。研究还发
现,禽蛋蛋清和蛋壳中存在抗微生物肽[13,14]。
1 禽类防御素
防御素是一类富含半胱氨酸,非糖基化的阳离
子多肽,含有 3束 β片层结构,由 β-发夹转角环连
接起来[1,15]。其分子特征是 6~8个半胱氨酸残基形
成 3~4对二硫键,含有 2~3个反相平行的 β片层,
有些还含有 α-螺旋结构[1,16]。防御素分布于哺乳动
物粒细胞、上皮细胞以及某些分泌物中,具有抗革
兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、原生动物、某些真菌以
及被膜病毒(如疱疹类病毒)的特性[1,17]。防御素是
T淋巴细胞、单核细胞和不成熟树突状细胞的趋化
因子[2]。在微摩尔浓度溶液中,防御素仍然能发挥
活性,但在高盐离子强度条件下,其活性会受到抑
制[2,18]。防御素可分为植物防御素、无脊椎动物防御
素以及脊椎动物 α-、β-、θ-型防御素[16]。
经典防御素,即 α-防御素,是由 3对二硫键连
接组成的阳离子短肽。β-防御素比 α-防御素稍大,
它们具有相似的三维结构,其区别在于分子中半胱
氨酸残基的间隔及二硫键连接方式不同。在 α-防
御素中,二硫键分别存在于 Cys1-Cys6、Cys2-Cys4
和 Cys3-Cys5之间;而在 β-防御素中,二硫键分别
存在于 Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和 Cys3-Cys6之间[19]。
α-防御素和 β-防御素是脊椎动物所特有的,而 θ-
防御素只在灵长类动物中发现。鸟纲动物仅有的防
御素是 β-防御素,它被认为是经典防御素的起源,
而具有环状结构的 θ-防御素是由两个相似的 α-防
御素序列经翻译后的连接作用而产生的[16]。
β-防御素的作用机理尚未完全清楚。研究者们
认为,其作用的机理是 β-防御素暴露的阳离子位
点与细菌细胞膜所带的负电荷相互吸引,将 β-防
御素多肽吸引至细胞膜。此时就形成了 1个二聚
体,该二聚体的 2个 β-防御素单体的 β-链氨基末
端就形成离子通道,使得跨膜电位发生改变,从而
使膜破裂,导致细胞死亡[1,20]。
根据来源不同可将禽 β-防御素分类。禽异嗜
性白细胞肽包括鸡的两种异嗜性白细胞肽(CHP-1
和 CHP-2)、鸡的 3种 β-防御素 (Gal-1,Gal-2和
左珂菁等:禽抗微生物肽的结构、分布及活性研究进展 39
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
Gal-1α)、火鸡的 3种异嗜性白细胞肽(THP-1,
THP-2和 THP-3)以及鸵鸟的 β-防御素(Osp-1)。非
异嗜性白细胞肽包括 Gal-3、galopavin-1(GVP-1)和
sphenicins(Sphe-1和 Sphe-2),前两种肽在鸡和火鸡
的上皮细胞中表达,而 sphenicins则在企鹅的胃内
容物中被发现[1]。表1选择性摘要了禽 β-防御素(包
括异嗜性白细胞肽和非异嗜性白细胞肽)的抗菌谱
和最小抑菌浓度。Gal-1与 CHP-1的基因序列基本
一致,但基因的多态性造成了它们的差异,这与
Gal-1α与 CHP-2的情况相同。Brockus等(1998)建
议将这些肽命名为 Gal-1/CHP-1和 Gal-1α/CHP-2。
不同的研究机构已经鉴别到各种不同的禽 β-防御
素,并建立了他们各自的命名系统[19]。Lynn等(2007)
建议确立一个新的标准化的命名系统,在该系统
中,术语 “galinacin,heterophilpepide,ostricacinand
spheniscin”将统一使用“禽 β-防御素”(AvBD)来代
替,并使用一个系统的方法将基因和肽的编码相互
对应起来[21]。由于新的命名有时会将几种概念混淆,
还是采用了与文献一致的命名。
2 异嗜性白细胞肽
鸡异嗜性白细胞肽(Chickenheterophilpeptide,
CHP)中的 CHP-1、CHP-2和 THP-1具有相似的一
级结构和抗菌谱。CHP-1由 39个氨基酸组成,包括
6个半胱氨酸和 6个精氨酸,分子量为 5.183±2kD。
THP-3与 CHP-1、CHP-2在一级结构上同源性较
低,THP-3抗微生物效果也不及 CHP-1、CHP-2[18]。
THP-1和 THP-2,与 Gal-1和 Gal-2一样,缺少长的
带负电荷的前片段。
Gal-1,Gal-1α和Gal-2在健康鸡的骨髓中表达水
平高,而在肺脏中表达水平较低[17]。Harwig等(1994)
报道,经测定 Gal-1α,Gal-1和 Gal-2的分子量分别
是 4.582kD,4.505kD和 3.916kD。Gal-1和 Gal-2,与
非异嗜性白细胞肽 Gal-3一样,首先在家禽生殖道
粘膜中被发现,而且在成鸟中表达量多,并在有肠
炎沙门氏菌(S.Enteritidis)或脂多糖的刺激下表达
量增加。与产卵期相比,非产卵期和输卵管萎缩的
禽的生殖道粘膜中的表达减弱[22]。
在鸡和火鸡中,已经鉴别到异嗜性白细胞肽。
据 Yu等(2001)报道,鸵鸟 β-防御素-1(Osp-1)是
鸵鸟粒性白细胞所特有的。该肽含有 36个氨基酸
残基,分子量为 4.011kD,具有抗大肠杆菌(E.coli)
和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的活性[23]。Sugiarto等
(2006)从鸵鸟异嗜性白细胞中纯化到 3种新 β-防
御素,它们由 36~42个氨基酸组成,分子量在 4.70-
4.98kD之间。Osp-2、Osp-3和 Osp-4都具有抗大肠
杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的活性,
但只有 Osp-2对白色念球菌(C.albicans)表现出抗
菌活性[24]。
3 非异嗜性白细胞肽
Gal-3在鸡的舌、法氏囊和气管中分布特别显
著,在皮肤、食管、气囊、大肠和肾脏等组织器官中
也有分布[17]。据报道,在鸡的动脉圆锥和生殖道中
检测到高水平表达的 Gal-3,而在头状骨、峡部和子
宫、大肠、骨髓、肾、结肠和卵巢等组织器官中检测
到表达较弱的 Gal-3[25,26]。在人工感染试验中,Gal-3
在气管中的表达水平显著提高,但其在舌头、食管
和法氏囊等组织器官中的表达并未受到影响。在火
鸡的气管组织中发现了一种与 Gal-3同源的上皮
组织 β防御素,命名为 galopavin(GVP-1)。经计算
GVP-1的阳离子前多肽原的分子量为 6.598kD,等
电点为 9.49[17]。
Sphe-1(别名 pBD-1)和 Sphe-2(别名 pBD-2)含
有 38个氨基酸残基,分子量分别是 4.482kD和
4.501kD。这两种肽是从王企鹅的胃内容物中分离
到的。学者们认为,在漫长的孵育期企鹅不能离巢,
但需要食物来维持生命,这两种肽能防止胃中储存
的食物腐败。Spheniscins具有抗革兰氏阳性菌、革
兰氏阴性菌以及真菌的活性[27]。Sphe-2对革兰氏阳
性菌属的金黄色葡萄球菌(S.aureus)表现出杀菌活
性,同时对革兰氏阴性菌属的大肠杆菌(E.coil)也
表现出抑菌活性[20]。Sphe-1的残基 14是一个组氨
酸,而在 Sphe-2中是一个精氨酸[27]。Sphe-2在企鹅
胃的高盐环境中仍具有很强的活性,因为该肽有一
个大的正电荷[20]。
鸡体内的另外两种 β-防御素 Gal-11和 Gal-12
是在使用 hiddenMarkovmodel程序探索鸡的基因
组时鉴别到的。Gal-11分子量约为 4.5kD,其在小
肠、肝、胆囊和脾脏等组织器官中表达水平高,而在
舌头、腺胃、法氏囊、气管、肺脏、气囊、肾以及胰腺
等组织器官中表达水平中等。Gal-11具有抗单核细
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胞增多性李氏杆菌(L.monocytogenes)、鼠伤寒肠炎
沙门氏菌(S.enteritidisserovarTyphimurium)、大肠杆
菌(E.coli)和化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)
的活性,但不具有抗金黄色葡萄球菌(S.aureus)的
作用。Gal-12具有比较严格的表达方式,并且在肝
脏和胆囊中高水平表达[28]。
据 Xiao等(2004)报道,鸡的 β防御素基因(包
括 Galinacin1-Galinacin13)结构相当紧凑,大小只
有 86kb,位于鸡的第 3号染色体 q3.5~3.7上,编码
防御素的成熟肽长度从 63~104个氨基酸不等。
Galinacin1-Galinacin7在骨髓和呼吸道中有表达,
而 Galinacin8-Galinacin13在肝脏和泌尿生殖道中
表达[16]。同时,据 Lynn等(2004)报道,在使用生物
信息学寻找鸡已表达的基因序列的附属物时,发现
了 7种新的鸡 β防御素(Gal-4到 Gal-10),一种新
的 cathelicidin以及一种新的肝脏表达的抗微生物
肽(LEAP-2)。鸡肝脏表达的抗微生物肽(LEAP-2)
在小肠、肝脏、肺脏和肾脏等组织器官中都有表达。
预计该肽的前肽和成熟肽的分子量分别为 6.074kD
和 4.593kD。当鸡感染沙门氏菌(Salmonela)时,可
检测到 LEAP-2在肠道和肝脏中的表达显著增强。
编码 LEAP-2的基因位于第 13号染色体上,该基因
在上皮组织、肝脏、肺脏、肾脏和小肠等组织器官中
都有表达[25]。沙门氏菌感染时,LEAP-2可在肝脏和
小肠中被诱导表达,而不同菌种的肠炎沙门氏菌
(S.Enteritidis)感染时,LEAP-2肽产生的情况也不
同。
4 Cathelicidins抗菌肽
Cathelicidins抗菌肽是一类在结构上存在很大差
异的阳离子抗微生物肽,但编码抗菌肽的前多肽原在
N端都具有一个高度保守的cathelin原序列[29,30]。前多
肽原经蛋白水解酶水解得到长度为 12~97个氨基
酸的肽。成熟肽抗微生物谱广,具有抗革兰氏阳性
菌和革兰氏阴性菌以及真菌、原生动物和被膜病毒
的活性。成熟的抗菌肽还具有结合并中和内毒素的
能力,可诱导嗜中性粒细胞、T细胞和单核细胞的
趋化性[31]。抗菌肽是化学引诱剂,可作用于各种免
疫细胞,抑制 NADPH氧化酶,干扰脂多糖,杀死活
化后的淋巴细胞,还有诱导血管生成、溶解细胞以
及促进创伤修复的功能[30,32]。
一般认为,Cathelicidins抗菌肽的作用机理与
防御素的作用机理相似,该肽通过物理作用,与带
负电荷的微生物细胞膜上的磷脂和脂多糖结合,膜
通透性增加,细胞破裂,最终导致死亡[30]。Cathelicidins
抗菌肽广泛存在于哺乳动物体内,而最近在大西洋
八目鳗类鱼和普通家鸡体内也鉴别到该肽的存在。
Cathelicidins在不同组织中的表达水平也不一样。
嗜中性粒细胞类的吞噬细胞中含有丰富的Cathelici-
dins,而在粘膜上皮细胞和皮肤角质化细胞中表达
水平较低[30,31]。
Xiao等(2006)鉴别到 3种新的杀菌肽(fowlici-
din-1,fowlicidin-2和 fowlicidin-3),它们结构相当紧
凑,位于第 2号染色体的 p臂上,大小不超过 7.5kb,
到邻近端的距离小于 3.5Mb。这 3种fowlicidins的编
码基因具有哺乳动物典型的杀菌肽结构,即由4个外
显子和3个内含子组成。Fowlicidin-2和与 fowlicidin-
3头对头的定位,从各自的终止密码子开始仅相距
736bp,而 fowlicidin-1和 fowlicidin-2相距 2.4kb。由
于大量精氨酸和赖氨酸的存在,这 3种肽的 C端都
带正电荷。Fowlicidin-1由 26个氨基酸残基组成,带
8单位正电荷;fowlicidin-2由 32个氨基酸残基组成,
带10单位正电荷;fowlicidin-3由29个氨基酸残基组
成,带 7单位正电荷,与 fowlicidin-1的基因序列有
很高的同源性,这可能是基因重迭的结果[30]。
据 Xiao等(2006)报道,人工合成的 fowlicidin-
1和 fowlicidin-2能有效的抑制革兰氏阳性和阴性
菌等微生物,在浓度高达 100mM的氯化钠溶液中
仍可保持活性。fowlicidin-1和 fowlicidin-2肽的 MIC
(最小抑菌浓度)不同,一般位于 0.4~2.0μM之间。
还发现 fowlicidin-1和 fowlicidin-2的浓度在 6~40μM
时会对哺乳动物的红细胞和上皮细胞产生细胞毒性
作用[30]。经发现,fowlicidin-1的活性比fowlicidin-2稍
强。Fowlicidin-1和 fowlicidin-2是发现的最有效的
cathelicidins,它们作为治疗剂具有很好的开发前
景。
Lynn等(2004)和 VanDijk等(2005)分别报道
了对应的 fowlicidin-1和 fowlicidin-2的基因序列完
全一致[29,31]。Lynn等(2004)发现,一类在鸡的法氏
囊、睾丸、砂胃和骨髓等组织器官中有表达的
cathelicidin(fowlicidin-1)[29]。VanDijk等(2005)报
左珂菁等:禽抗微生物肽的结构、分布及活性研究进展 41
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
道,鸡骨髓抗微生物肽 27(CMAP27又称 fowlicidin-
2),是禽的另一种 cathelicidin,由 27个残基组成,
并预测其形成了一个具有疏水尾端的 α螺旋结构。
CMAP27在骨髓、法氏囊、睾丸、脾脏、肾脏、肝脏、
胸腺、盲肠的扁桃体及周围的淋巴组织等组织器官
中有表达,该肽的表达还遍及余下的肠道部分,但
表达水平较低。CMAP27在皮肤组织中表达水平
低,而在尾脂腺组织中的表达水平很高。这种皮脂
腺位于鸟类的尾部,并分泌一种全浆分泌液,是一
种具有抗菌特性的蜡和油的混合物,这些分泌物在
孵化期时与蛋表面接触,很可能给蛋提供某些保护
作用[31]。
5 具有抗微生物活性的禽大分子蛋白质
具有抗微生物特性的蛋白质通常指分子量低
的小分子蛋白质,但作者将结合分子量较大的抗微
生物肽一起阐述,由于该类蛋白质具有高效的活性
并普遍存在于禽免疫系统中。在鸟纲动物中,溶菌
酶和转铁蛋白就是一类较高分子量的抗微生物肽,
它们和抗微生物多肽具有相同的特性。
5.1 溶菌酶
溶菌酶又称 N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,可破
坏革兰氏阳性菌肽聚糖结构中的 N-乙酰胞壁酸
(NAM)与 N-乙酰氨基葡糖(NAG)之间的 β-1,4糖
苷键,对某些革兰氏阴性菌的作用较弱[33,34]。溶菌
酶广泛存在于真核细胞及原核细胞内,在病毒、细
菌、植物和动物中都鉴别到。溶菌酶是具有自我防
御功能的酶,主要分布在蛋清、眼泪以及真核细胞
各种分泌物中[35]。
溶菌酶主要有 3种类型:噬菌体溶菌酶(T4
型)、鸡蛋清溶菌酶(c型)和鹅卵清溶菌酶(g型)。
噬菌体溶菌酶(T4型)是一种病毒性溶菌酶,而 c
型和 g型最初从禽蛋清中分离到。不同类型的溶菌
酶尽管其氨基酸序列不完全相同,但它们的三级结
构相似[36,37]。在 NCBI数据库中可看到,普通家鸡的
c型溶菌酶基因(基因 ID:396218)和 g型溶菌酶基
因(基因 ID:418700)都位于第 1号染色体上,但相
距较远。在家禽中,g型溶菌酶在骨髓和肺脏组织
中有表达;而 c型溶菌酶在多种组织中有表达,包
括禽输卵管峡部和子宫、禽蛋蛋壳和壳膜[38,39]。G型
溶菌酶已经在鹅的不同组织和鹅蛋蛋清中鉴别到[37]。
已经发现,鸡和北京鸭的蛋清中仅含有 c型溶菌
酶,而黑天鹅和加拿大鹅的蛋清中含有 c型和 g型
2种溶菌酶[40]。
5.1.1 C型溶菌酶 鸡型溶菌酶,又称 c型溶菌酶
或蛋 清 溶 菌 酶 (HEWL),最 初 由 SirAlexander
Flemming在 20世纪初从普通家鸡的蛋清中分离到
c型溶菌酶,现已在多种不同的真核细胞分泌物中
鉴别到该溶菌酶。该蛋白质分子量为 14.4kD,占鸡
蛋清蛋白比例的 3.5%,其具有很高的抗细菌属
(Microccus)和芽孢杆菌属(Bacilus)微生物活性,抗
革兰氏阴性菌的活性较低[33]。溶菌酶除了有溶菌作
用外,还具有其它的生物活性,如抗病毒、抗菌、消
炎、抗组胺、抗肝素、抗肿瘤以及融合活性,此外还
具有凝集作用和刺激免疫细胞增值活性作用[10]。溶
菌酶在抗肿瘤作用中起着一定作用,可杀灭病毒,
增强吞噬细胞的活性。溶菌酶主要存在于鸡形目和
雁形目的动物中。Hermann等(1971)也报道了在
Kaki鸭蛋清中有两种 c型溶菌酶。这些溶菌酶是最
早的 c型溶菌酶多态性的具体表现,其多态性是由
一个单一的基因座上多重等位基因造成的[38]。
鸡蛋清溶菌酶在医学上和商业上应用广泛。据
估计每年有超过 100t的溶菌酶应用于医药和医
疗,此外还被用于蔬菜、鱼、肉、海产品、黄油、奶酪
和葡萄酒等食品的防腐保鲜。奥地利、澳大利亚、比
利时、丹麦、芬兰、德国、意大利、日本、西班牙以及
美国等国已经认可溶菌酶的医药和医疗用途[10]。溶
菌酶被用于抑制口腔和体表的病毒感染,如疱疹病
毒感染等[41]。Lee-Huang等(1999)报道,溶菌酶还具
有对抗 I型 HIV的活性。鸡蛋清溶菌酶的作用范围
广,是最有效的溶菌酶,也是目前惟一被广泛应用
于商业生产的溶菌酶[42]。
溶菌酶是通过肽聚糖水解起作用,同时也表现
出非溶解性的杀菌作用机制(包括非水解性的杀菌
作用)。Ibrahim等(2001)做过一个定向诱变实验,
该实验通过置换鸡蛋清溶菌酶中一个具有催化作
用的残基,使肽聚糖丧失水解能力。经诱变的蛋白质
保留抗革兰氏阳性菌的活性,这表明该溶菌酶的抗菌
活性与催化活性是相互独立的[43]。该肽具有抗革兰氏
阳性菌、阴性菌及白色念球菌(C.albicans)的活性[44]。
5.1.2 G型溶菌酶 鹅卵清溶菌酶又称 g型溶菌
42
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酶,最早是在家鹅的蛋清中分离到的[45]。G型溶菌
酶分布广泛,已经在包括雁形目的 9个目动物中鉴
别到,但鸡蛋清中并不含有该型溶菌酶[46,47]。这类
溶菌酶的活性比 c型溶菌酶高 3~6倍,但是缺少 c
型溶菌酶所特有的壳多糖酶活性[40]。据报道,在 pH
值为 6.2时,鹅卵清溶菌酶的酶活性比等摩尔的鸡
蛋卵清溶菌酶高 3倍。研究表明这两种类型的溶菌
酶具有相同的二级域结构,但是它们的氨基酸同源
性很低。另外,还发现作用于 c型鸡蛋卵清溶菌酶
的抗体不与 g型溶菌酶反应,反之亦然[46]。鹅和鸵
鸟的 g型溶菌酶的最适 pH值在 5.5~6.0之间,而
三趾鸵鸟的 g型溶菌酶的最适 pH值为 6.0,其活
性强于其它 g型溶菌酶[36]。三趾鸵鸟、鹅、鸵鸟和鹤
鸵中的 g型溶菌酶在 pH值低于 3.0或高于 8.0时
会失去活性。母鸡蛋清溶菌酶的活性 pH值范围
广,最大可从 5.5~7.5,与其相比,鹤鸵 g型溶菌酶
的活性 pH值范围狭窄,其酸性最适 pH值为 5.0,
但在 pH为 5.5时它的活性比母鸡蛋清溶菌酶大 3
倍。鹤鸵 g型溶菌酶的最适温度为 30℃,而母鸡蛋
清溶菌酶最适温度范围为 40℃~60℃[48]。
5.2 转铁蛋白
转铁蛋白属于糖蛋白,相对分子量为 80kD,由
两个结构域组成,每个结构域都能可逆地结合一分
子的铁离子。这类蛋白质以不同的浓度分布于哺乳
动物和鸟类的细胞及体液中。转铁蛋白在铁离子的
运输中起到重要的作用,在 pH值为 6~10时,转铁
蛋白可通过限制微生物利用其生命活动所需的铁
离子而抑制微生物生长[49]。转铁蛋白也可结合一些
其它的过渡金属离子,但其对铁离子的亲和力高于
对其它金属离子的亲和力。所有转铁蛋白的氨基酸
组成都相似,不同的转铁蛋白与其相连的碳水化合
物的数量和组成不同[50]。转铁蛋白在哺乳动物中的
存在形式为血清转铁蛋白和乳转铁蛋白,而在鸟类
中的存在形式为卵转铁蛋白和血清转铁蛋白。血清
转铁蛋白,也称铁传递蛋白,在包脊椎动物(包括
鸟)的血浆中,担任铁离子的转运功能[51]。在鸡体
内,血清转铁蛋白和卵转铁蛋白的蛋白质部分呈现
一致,但各自结合的碳水化合物部分不同。
卵转铁蛋白是鸡蛋清蛋白中的一种主要成分,
其所占比重为 10%。在鸡蛋蛋清中,卵转铁蛋白抑
制细菌生长的原理是通过螯合作用使细菌不能利
用铁离子[52]。在大肠杆菌及其它革兰氏阴性菌中具
有一个铁离子的转运系统,该系统可被柠檬酸盐终
止。研究证明,重碳酸盐可增强卵转铁蛋白抗微生
物的活性[53]。在卵转铁蛋白中添加柠檬酸盐和重碳
酸盐可抑制 50%的金黄色葡萄球菌的生长 [54]。
Valenti等(1983)研究表明,假单胞菌属(Pseudomonas
sp.)、大肠杆菌(E.coli)和变形链球菌(Streptococcus
mutans)对卵转铁蛋白最敏感,而金黄色葡萄球菌
(S.aureus)、变形菌属(Proteussp.)和克雷伯氏杆菌
属(Klebsielasp.)对它的抵抗力很强[55]。而 VonHuno
lstein等(1992)的进一步研究指出,卵转铁蛋白和
乳转铁蛋白对链球菌属没有活性,如牛链球菌(S.
bovis)、变形链球菌 (S.mutans)和粪肠球菌(E.
faecalis)[56];同时 Valenti等(1981b)发现,即使卵转
铁蛋白浓度达到 5mg/ml,几乎 100%的变形菌属类
菌都能繁殖[57]。
卵转铁蛋白也具有抗病毒和抗真菌活性。
Giansanti等(2002)报道了卵转铁蛋白具有抗马立
克氏病毒(MareksDisease)感染的活性[58]。Valenti
等 (1985)报道了卵转铁蛋白抗白色念珠菌(C.
albicans)的抗真菌活性,其作用机理比较复杂,不
仅包括卵转铁蛋白对铁离子的螯合作用,还包括蛋
白质与真菌细胞间的相互作用等。其试验表明,在
念珠菌属 100种菌中,只有克罗氏念珠菌(C.krusei)
表现出明显的抗卵转铁蛋白活性的能力。与细菌相
比,真菌对卵转铁蛋白更敏感,这可能是由于卵转
铁蛋白直接作用于真菌细胞的结果[53]。
最近,在卵转铁蛋白的基因序列中鉴别到一种
卵转铁蛋白抗微生物肽 92(OTAP-92)的抗微生物
区域,该序列与在牛乳铁蛋白分离到的抗微生物序
列类似。这种阳离子抗微生物序列由 92个残基组
成,是位于卵转铁蛋白 N端区域的 109~200的区
域,它还含有 3个链内的二硫键,其中两个是表面
暴露的索眼状键,这与昆虫的抗微生物肽相似。该
序列相对分子量为 9.9kD,可用胰蛋白酶切割分离
到,具有抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌 K12等的活
性[54,59]。一般认为,该肽的作用方式包括穿透细菌
膜和逸散膜电位两种[60]。
5.3 其它蛋白质
左珂菁等:禽抗微生物肽的结构、分布及活性研究进展 43
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
最近,从鸡肠道粘膜和上皮细胞中纯化得到一
种大小为 3.5kD的肽,并证明其具有抗沙门氏菌的
活性[61]。肽AWAPIV与大小为81kD的蛋白质AWAK
的 C端 WAP域相连,其中 AWAK包括禽 WAP(乳
清酸性蛋白)域和 Kunitz域。AWAPIV的表达在感
染沙门氏菌的 5日龄小鸡的肠道和肾脏等组织中
检测到。AWAPIV细胞溶解产物可抑制枯草杆菌
蛋白酶和蛋白水解酶 K,同时还具有抗沙门氏菌、
链球菌以及葡萄球菌的活性[62]。
众所周知,禽蛋清中含有蛋白酶抑制剂,它可
能也在抗菌防御中起作用。鸡蛋清中的卵巨球蛋
白,是一种广谱的蛋白酶抑制因子,可抑制细菌的
生长,并可抑制粘质沙霉菌(Seratiamarcescens)和
绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的蛋白酶的
活性[63]。鸡蛋清卵粘蛋白可结合牛轮状病毒、鸡新
城疫病毒和人流感病毒[64]。Pelegrini等(2004)发
现,经胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶蛋白水解消化的卵
清蛋白可产生具有抗微生物活性的片段,其抗枯草
芽孢杆菌 (B.subtilis)作用强,而抗白色念珠菌
(Candidaalbicans)作用弱。蛋清具有粘稠性是由于
其含有蛋清蛋白—卵粘蛋白,该蛋白也可经胰蛋白
酶和胰凝乳蛋白酶蛋白水解消化产生具有抗微生
物活性的片段[65,66]。
6 禽蛋和蛋壳中的抗微生物肽
禽蛋蛋清具有抗微生物特性,Guerin-Dubiard
等(2006)用双向电泳和质谱分析蛋清中的蛋白成
分,发现蛋清由多达 69种蛋白质组成,并提示可能
存在新型的潜在抗微生物肽[67]。Mann等(2006)最
近使用质谱检测技术在鸡蛋壳的酸溶性的有机基
质中检测到 520种蛋白质,这更强化这样一个概
念:禽蛋是寻找新型的潜在抗微生物肽的一种未充
分开发的资源[68]。
Mann等(2006)使用质谱检测技术在蛋壳基质成
分中鉴别到少量gal-8和β-防御素11[68]。Silphaduang
等(2006)最近在鸡的卵巢和输卵管中鉴别到 2种
抗微生物组氨酸蛋白(H1和 H2B)的表达,这表明
这些抗微生物肽可能是在鸡蛋形成的过程中进入
蛋内的[69]。Xiao等(2004)报道了鸡生殖系统中的
Gal-10到 Gal-13基因的表达[16]。Yoshimura等(2006)
报道了鸡的生殖道粘膜中的 Gal-1、Gal-2和 Gal-3
的表达[22]。
Ovocalyxin-36是一种新型的鸡蛋壳基质蛋白,
与脂多糖结合蛋白、杀菌通透性增加蛋白和 Plunc
族蛋白等表现出同源性,同时被认为在抗微生物防
御中在起作用[70]。Ovocalyxin-32是一种在蛋壳的角
质层和钙化带发现的鸡蛋壳基质蛋白,它与 TIG1
表现出同源性,TIG1是一种皮肤蛋白和 latexin蛋
白,也是老鼠的羧肽酶抑制剂[70,71]。最近,已经证明
Ovocalyxin-32可抑制枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的生
长,并具有羧肽酶抑制活性[72]。基因重组的 OCX-32
可能与天然的 OCX-32表现出不同的抗微生物活
性。
禽尾脂腺的全浆分泌物含有抗微生物剂,在孵
育期时会与蛋壳的最外层接触。Deeming(1987)报
道,番鸭(Muscovyduck)和大多数的鸭子一样,经常
用梳理羽毛用的油脂涂抹鸭蛋。CMAP-27已经被
报道在鸡的尾脂腺中有表达,它有可能包含在梳理
油中[73]。Martin-Platero等(2006)报道,在 hoopoe和
Upupaepops的尾脂腺分泌物中分离到抗微生物
肽。各学者研究指出指出,鸡的尾脂分泌物可抑制
真菌和细菌的生长。当除去母鸡的尾脂腺时,可加速
由细菌和真菌引起的皮肤感染[74]。Shawkey等(2003)
报道,家养雀类和 CarpodacusMexicanus的尾脂油
可抑制细菌的生长[75]。
7 展望
研究表明,从蛋清中分离的某些肽具有抗微生
物活性[44,76,77]。蛋白组学、转录组学和生物信息学的
发展将促进潜在的新抗菌剂的识别。如溶菌酶和转
铁蛋白一类的蛋类抗微生物肽,是食品工业中理想
的防腐剂,并已经被用于食品的保存和防腐。在不
远的将来,相似蛋白的抗微生物成分有可能被鉴别
与发现,并在经济学和医学分子领域突显其重要
性。
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具有更大的意义。可以肯定这项造福全人类的科学
研究将会继续进行下去,研究者们任重而道远。
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