全 文 ：峨物杖术通银
研 究报 告 召云口2万日阴W 笼刀 G Y B U L L E I讯V 2 洲9 年 增 刊
植物叶绿体与线粒体基因组 DN A 特异性比较研究
张幼芳
(浙江普察学院 ,杭州 31 (X) 53 )
摘 要: 研究不同植物间叶绿体和线杜体基因组 D N A 的差异 ,探讨其在法庭科学中的应用价值根据叶绿体和线粒体
基因组 D N A 核普故序列的特点,分别设计了一系列相应的引物 ,经 Pc R 扩增后 ,电泳鉴别不同的植物结果表明在设计的一
系列引物中,叶绿体基因组 D N A 的 Pc R 产物差异不大,鉴别效果不明显;而线拉体基因组D N A 的 Pc R 产物差异大 ,鉴别效
果明显因此以线拉体 D N A 为模板进行 Pc R 扩增 ,在不同植物间存在良好的差异性 ,适合于不同植物间的鉴别 ,在法庭科学
中具有实际应用价值
关扭词: 叶绿体 D N A 线粒体 D N A 特异性 引物
R esea rch o n PO ly m o rp h 15刃比 o f C h lor oP la st a n d M ito ch o n d ri al
G en o m iC D N A
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植物基因组 D N A 包括染色体基因组 D NA 叶
绿体基因组 D N A 和线粒体基因组 D N A 利用核
DN A 多态性应用于植物法科学检验已有报道 1~51 ,
而叶绿体和线粒体细胞器是半 自主性细胞器 ,二者
均不符合孟德尔遗传定律 本研究利用叶绿体基因
组 D NA 和线粒体基因组 D N A 序列的自身特点l6.刀,
设计了相应的叶绿体基因组 DN A 和线粒体基因组
D N A 的引物 , 经 PC R 扩增后 , 产物用琼脂糖凝胶
电泳和聚丙烯酞胺凝胶电泳检测分析 ,探讨了相应
基因组引物鉴别不同植物的情况 ,为选择合适的基
因组 DN A 用于法科学实践提供参考
1 材料与方法
1.1 样本
选取水稻 玉米 松树 茶树 桑树 桂花树等不
同种属的植物叶子为样本
1.2 主要仪器设备
水平电泳仪 垂直电泳仪 (BIO 一R A n ) PCR 仪
(H ybaid )
收稿日期 :2以为一汉一04
基金项 目:浙江省科技厅科技计划资助重点项 目(编号 0 1 03 237 )
作者简介:张幼芳(19 69 一) ,女 ,浙江绍兴人 ,教授 ,主要从事法医学教学和法庭生物学研究;E 一二 卜zhan 份f6 9@ 12 6. co m
14 生物杖术透银 习勿翻动月城曰 B u肠时加 2 O( 为 年 增 刊
1.3 主要试荆
限制性内切酶 Eco RI 购自Pro m eg a 公司
1.4 方法
L 4.1 基因组 DN A 的提取 用改进的 CTA B 法提
取线粒体基 因组 DN A 将样本碾碎加人 70 闪
0.75 xCTA B 提取缓冲液 ,充分混匀后在 65 中水浴
90 而n ,期间不时轻缓颠倒混匀 加入 7的 闪抓仿 :
异戊醉(24 :l) ,混匀后室温下 12 侧x r/而n 离心 10
而n 至分相 取上清液 , 加人 l ro 体积的 CTA B
提取缓冲液 ,再加人等体积的抓仿 :异戊醇(24 :l) ,
混匀后室温下 12 XX) rl m in 离心 ro m in 取上清
液 ,加等体积的 CTA B 沉淀缓冲液 ,混匀后室温下
12 0以) rl而n 离心 10 而n 倾掉上清 , 将沉淀溶于
10 闪 高盐 TE 缓冲液中 , 同时加人 5 卜L RN A ase
储液 ,使之充分溶解 , 37 下保温 30 m in 然后加人
等体积氛仿 , 12 (X] Or lm in 离心 10 而n ,将上清液转
移到干净的离心管中 , 加人 2 倍体积的冷无水乙
醇 ,于一70 冷置 30 m in 室温解冻后 , 12 0 Or l而n
离心 10 m in , 弃掉上清 , 用 70% 冰乙醇洗沉淀两
次 , 12 (X ) rl 而n 离心 10 m in ,弃掉上清 ,将沉淀溶
于50 闪 几 缓冲液中 ,一20 保存备用
1.4. 2 引物设计 在互联网上分别搜索相关植物
叶绿体 线粒体基因组 D N A 保守引物序列 ,以叶绿
体 线粒体和引物为关键词进行搜索 ,分别找到叶
绿体和线粒体基因组 D NA 扩增的保守序列 (表 1
表2)
裹 1 植物叶绿体 O N A 扩增的保守引物序列
正向引物 反向引物
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衰 2 植物经位体 O N A 扩增的保守引物序列
正向引物 反向引物
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2 (X 旧 年 增 刊 张幼芳 :植物叶绿体与线粒体基因组 D N A 特异性比较研究 14 5
1.4. 3 PC R 扩增 用表 1 表 2 中的引物扩增不同
样本植物 D N A , 在 50 闪 反应体系中 ,各种试剂浓
度分别为 M gCI: 2.5 m M , dN Tps 0.2 m M , 引物 0.5
林M , Ta q 酶 0.025 U午l, D NA 模板 5 ng单l, IX pCR
缓冲液 ,其余用水补足 反应条件为 95 预变性 5
m in , 再进行 36 次扩增反应循环 (95 变性 30 5
55 退火 45 5 72 延伸 90 5) , 然后 72 延伸 7
m ln o
1.4. 4 限制性内切酶酶切 对不能区别种属的电
泳谱带 ,进一步用限制性内切酶 Ec oR I 酶切 ,酶切
反应:5 卜g DNA 样品,5 林1 10x缓冲裤 ,5 林1 10x
BSA , 2 林l限制性内切酶 , 补 ddH ZO 至 50 卜l, 37
酶切 4 h 后 ,电泳
1.4. 5 扩增产物的检测 配制 2% 琼脂糖凝胶 ,电
压为 S V/em ,电泳 20 m in ;配制 12% 聚丙烯酞胺凝
胶 ,电泳 30 V ,电泳 Z h
2 结果
利用表 2 .6 对特异引物对线粒体基因组 DN A
的扩增产物,经琼脂糖电泳 ,均出现大小不等的谱带
(图 1一3 ) ,谱带大小从几百 bp 到几 kb 之间 ,差异
明显 ,即不同品种间同一引物扩增的谱带大小基本
不同 表 1. 所设计的叶绿体引物在叶绿体基因组
D N A 的扩增中 ,出现的条带大小差异不明显 (图 4-
6 ) , 特别是在 tm T/trn F 和 甲oCZ/甲oC I 引物中更不
明显 , 并且在 trn T/psbC 和 o R FS 12/psal 引物中 ,水
稻和茶树的样品中均未得到扩增
l一5 为 甲514/eob 引物的 pC R 扩增产物 ;6一11 为 ISSrR N A /55r-
R N A 引物的 PC R 扩增产物 ;M 为分子 M arker; 1.6 为水稻 ;2 .7
为玉米;3 , 8 为松树 ;4 , 9 为茶树 ;5 .10 为桑树 ;1 为桂花树
图 2 rP s14/eob 和 18S rR N A /SS rR N A 分别对水稻 玉米
松树 茶树 桑树 桂花树线粒体基因组的 尸C R 扩增结果
]一5 为 nad 4一 exonl 1 nad4一exonZ 引 物 的 PC R 扩 J曾产二物 ;6一 为
nad4 一exonZ / :lad4 一exon3 引 物 的 I,e R 打一增 产物 ;M 为 分 f
M ar ker;1 .6 为水稻 ;2 , 7 为玉米 ;3 .8 为松树 ;4 , 9 为茶树 ;5 .10
为桑树 ;1 为桂花树
图 3 n叫 4 一6x o n l / na d 4 一e x o nZ 和 na d4 一ex o nZ /n a d 4一
ex on 3 分别对水稻 玉米 松树 茶树 桑树线粒体基因组
的 P C R 扩增结果
l一5 为 lrn T /psbC 引物的 PC R 扩增产物 ;6一11 为 O R卜5 12 /I,, I引
物的 PC R 扩 增 产物 ;M 为分 子 M ar ke r; 1 .6 为 水稻 ;2 , 7 为 狡米 ;
3 , 8 为松树 ;4 , 9 为茶树 ;5 , 10 为桑树 ;1 为桂花树
图 4 trnT/PsbC 和 O R F5 12/Psal分别对水稻 玉米 松
树 茶树 桑树 桂花树叶绿体基因组的 P C R 扩增结果
l一5 为 nad IB /nadIC 引物的 PC R 扩增产物 ;6一11 为 co n (5 )/
eo 1 (3 )引物 的 PC R 扩增产物 ;M 为分子 M ark er;z , 6 为水稻;
2 , 7 为玉 米 ;3 , 8 为松树 ;4 , 9 为茶 树 :5 , 10 为桑树 :11 为桂花树
图 1 nad1B /nad1C 和 cox ll(5 )/eox ll(3 )分别对水稻
玉米 松树 茶树 桑树 桂花树线粒体墓因组
的尸C R 扩 增结 果
图 5 tm 下jt m F 分别对水稻 玉米 松树 茶树 桑树叶绿体
基因组的 P C R 扩增结果
图 6 POC Z/ rP OC I 分别对水稻 玉米 松树 茶树 桑树叶
绿体基因组的 P C R 扩增结果
14 6 生物杖 术通报 B to te ch n口勿盯 2 O( 为 年 增 刊
针又寸甲,C Z/甲oC I 和 trnr一trnF 引物 中大小相rdj
的谱带用聚丙烯酞胺凝胶电泳加以区分 .条带大小
仍一致(图 7 图 8 ) 进一 步对这些大小相同的谱带
J月EcoR I 进行限制性内切酶酶切分析 , 电泳结果
显示能够区分出部分片段 ,在 长米 松树的结果 中 ,
分别酶切出大小不同的谱带
图 7 rP OC Z/币C , 分别对水稻 玉米 松树 茶树 桑树 桂
花树叶绿体基因组 户C R 扩增的聚丙烯酸胺凝胶电泳结果
图 s tr n下一tm F 分别对水稻 玉米 松树 茶树 桑树 桂花
树叶绿体基因组 PC R 扩 增的 聚丙烯酞胺凝胶电泳结果
3 讨论
叶绿体和线粒体是植物体内存在的半 自主细
胞器 ,二者都含有相对独立的基因组 DN A ,但二者
在遗传方式上却存在很大的差异I8] ,植物线粒体基
因组序列变化相 对较大 结构复杂多样 (基因组 呈
现环状 线状 点突变 缺失 置换 倒位 D N A 漂
移 以及质粒和类质粒等 ) , 这对线粒体基因组
DN A 的测序带来困难 ,因而 ,迄今在互联网上公开
的植物线粒体基因组很少 (h ttP ://wo .nc hi .nl m .nih .
go v) 相对植物线粒体基因组 D NA 而言 ,植物叶绿
体基因组 D NA 中的基因则相对保守 , 具有稳定的
D N A 序列和结构
本研究根据植物线粒体基因组 D NA 的特异
性 ,设计了一系列的引物 ,经 PCR 扩增并电泳分离
进行鉴别 ,对植物的不 同植物品种间鉴定取得 了理
想的效果 , 即可用同一引物对植物线粒体 D N A 扩
增谱带的区别来鉴别不同植物物种 ,如图 1一3 中同
一引物的不同品种间条带大小基本不同 但是利用
叶绿体基因组 D NA 进行植物品种间的鉴别(图 4-
6 ) ,即使运用限制性内切 酶对 PCR 产物酶切鉴定 ,
也不 能 到达理 想 的鉴定 结 果 , 如在 图 9 中水 稻
D NA 的 PC R 产物酶切后仍不能分开
因此, 通过对植物线粒体基因组 D N A 和植物
叶绿体基因组 DN A 的检测结果比较 , 根据植物线
粒体基因组 DN A 的特点 ,设计出一套相应的引物 ,
以区分植物 的不 同品种的方法是 可行的 , 为法庭
科学的应用提供了依据
M 为分 于标记 ; l一3 为水稻 玉米 松树 PC R 产物 (t m T一tm F 引 7
物 );4 ~ 6 为水稻 玉米 松树 PC R 产物 (tm T一tm F 引物 )的 Ec oR
I 酶切 片段 8
图 9 水稻 玉米 松树 户C R 产物 (tm 下一tm F 引物 )EC OR !
酶切结果
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