全 文 ：象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）是近
几年引起广泛关注和重视的一个热带根结线虫新
种， 在亚洲、 非洲、 欧洲以及北美热带和亚热带地
区均有发生分布 [1]。 该线虫具有极其广泛的寄主范
围， 包括豆科、 茄科、 葫芦科中的多种蔬菜， 以及
大豆、 玉米、 棉花、 烟草、 番石榴和荔枝等重要粮
食和经济作物 [2-3]。 与南方根结线虫（M. incognita）
和爪哇根结线虫（M. javanica）等主要根结线虫种类
不同的是， 象耳豆根结线虫能够克服 Mi、 N 和 Rk
等抗线虫基因介导的抗性反应， 在抗性番茄、 辣椒
和豇豆等蔬菜上寄生繁殖， 造成的产量损失可达到
65％以上[1，4]。 此外， 象耳豆根结线虫被证实与在欧
洲和美国广泛发生的玛雅古根结线虫（M. mayaguensis）
为同种异名 [5]。 目前， 象耳豆根结线虫已被国际上
公认为最具危害性的植物病原线虫之一， 欧洲和地
中海植物保护组织将其列入了 A2 警报名录[6]。
象耳豆根结线虫最早在海南儋州象耳豆树上发
现， 自 1983 年首次报道后的 20多年时间内一直被
认为是少数种或次要种而受到长期忽视 [7]。 近年来，
陆续有报道象耳豆根结线虫在海南儋州、 三亚、 琼海、
澄迈、 陵水等市县的蔬菜和水果上发生为害 [8-10]。
刘昊等[8]对儋州、 琼海和澄迈三地的番石榴上分离
的 9个根结线虫种群进行鉴定， 结果表明全部为象
耳豆根结线虫。 卓侃等 [9]在海南海口和定安的木豆
上分离到象耳豆根结线虫， 并且首次在广东发现该
线虫为害南瓜和辣椒。 随后， 海南文昌、 陵水、 东
热带作物学报 2015， 36（2）： 371-376
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2014-08-14 修回日期 2014-10-22
基金项目 海南省自然科学基金项目（No. 314103）； 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（No. 20131J001）。
作者简介 龙海波（1984年—）， 男， 博士， 助理研究员； 研究方向： 植物线虫学。 *通讯作者（Corresponding author）： 白 成（BAI Cheng），
E-mail: chengbai2001@163.com。
海南省象耳豆根结线虫的鉴定研究
龙海波， 孙艳芳， 白 成 *， 郭建荣， 曾凡云
中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室
海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室
海南海口 571101
摘 要 象耳豆根结线虫寄主范围广、 致病力强以及能在携带 Mi抗性基因的作物上寄生繁殖， 是热区最具危害
性的病原根结线虫种类之一。 应用比较形态学， 结合 mtDNA 序列分析、 IGS 序列分析和进化发育树等分子生物
学方法对海南省 18 个市县的根结线虫进行鉴定， 确定象耳豆根结线虫在蔬菜、 番石榴、 哈密瓜和枣树等作物上
广泛发生为害， 其中枣树为首次发现的象耳豆根结线虫新寄主。 研究结果表明， 象耳豆根结线虫已成为海南省
蔬菜作物上重要的病原根结线虫种， 并有进一步扩散加重为害的趋势。
关键词 象耳豆根结线虫； 鉴定； 会阴花纹； 线粒体 DNA； 进化分析
中图分类号 S436.3 文献标识码 A
Identification of the Root Knot Nematode Meloidogyne
enterolobii in Hainan Province
LONG Haibo, SUN Yanfang, BAI Cheng*, GUO Jianrong, ZENG Fanyun
Key Laboratory of Pests Comprehensive Gov ernance for Tropical crops, Ministry of Agriculture / Hainan Key Laboratory for
Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests / Hainan Engineering Research Center for Biological Control of Tropical
Crops Diseases and Insect Pests, Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,
Haikou, Hainan 571101, China
Abstract Meloidogyne enterolobii is one of the most damaging root-knot nematode species in tropical regions due
to its wide host range, pathogenicity and ability to develop and reproduce on several crops carrying resistance
genes. In the study, we used morphological methods combined with mtDNA and IGS sequences analysis and
phylogenesis for identifying the root knot nematode M. enterolobii occurring in Hainan. Based on both of
morphological and molecular characteristics, we confirmed that M. enterolobii is widely distributed in most of cities
and counties of Hainan, and its host crops include vegetables, hami melon, guava and jujube. The results
indicated that M. enterolobii is now become a major parasite on vegetable crops in Hainan showing a tendency of
further spreading.
Key words Meloidogyne enterolobii; Identification; Perineal patterns; MtDNA; Phylogenetic analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.02.025
第 36 卷热 带 作 物 学 报
方等地的多种瓜果蔬菜和沉香、 丁香上均发现象耳
豆根结线虫寄生为害 [10-11]。 越来越多的研究结果表
明， 象耳豆根结线虫在海南岛快速扩散蔓延， 并有
可能成为海南当地作物尤其是瓜果蔬菜上的重要根
结线虫种类。
海南省地处热带， 根结线虫病害发生严重， 且
存在的根结线虫种类繁多。 对根结线虫的鉴定， 传
统的方法主要是依据会阴花纹的形态特征， 但根结
线虫不同种群之间具有较大变异[12]。 此外， 热带根
结线虫种类尤其一些少数种如西班牙根结线虫（M.
hispanica）、 埃塞俄比亚根结线虫（M. ethiopica）在
会阴花纹特征上往往与常见种具有高度的相似性，
很难区分而容易导致鉴定结果不够准确[13-14]。 例如，
象耳豆根结线虫会阴花纹部分形态与南方根结线虫
相似， 曾被错误鉴定为南方根结线虫 [15]。 鉴于象耳
豆根结线虫毒性强、 危害大的特点， 2011~2014 年
笔者对采自海南省 18 个市县的根结线虫群体进行
分离， 并利用比较形态学与分子生物学相结合的方
法对象耳豆根结线虫进行鉴定， 旨在明确象耳豆根
结线虫是否已扩散至海南省全岛分布， 同时也为准
确鉴定及防治该线虫提供依据和理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
2011~2014 年在海南省 18 个市县采集具有明
显 “根结” 症状的作物病根， 带回实验室内编号后
分离根结线虫。 所获病根样品用清水轻轻冲洗干
净， 经 1％食用色素亮蓝染色后在解剖镜下挑取单
卵囊， 并接种于感病番茄（cv. 特级大明星）上进行
种群纯化培养和活体保存。
1.2 方法
1.2.1 线虫形态学观察与测定 取接种单卵囊
40 d左右的病土和番茄病根， 采用浅盆法从病土中
分离获得根结线虫二龄幼虫， 雌虫用挑针和镊子从
病根组织中直接分离获得。 参照刘维志[16]所描述的
方法进行线虫的杀死、 固定以及制作临时玻片。 显
微镜下进行观察、 测量并记录二龄幼虫体长、 最大体
宽、 DGO、 口针长度、 尾长等形态指标， 每个种群
观察样本数为 20 头幼虫。 参照张绍升 [17]所描述的
方法制作雌虫会阴花纹， 在显微镜下观察拍照保存。
1.2.2 线虫 DNA 提取 参照万新龙 [18]所描述的
方法， 略有修改。 显微镜下挑取单头二龄幼虫置于
含有 10 μL 灭菌双蒸水的 PCR 管中， 点动离心后
放入液氮中速冻 30 s， 随后 37 ℃水浴 30 s 进行虫
体冻融破碎， 重复 3次。 加入 8 μL 10×PCR Buffer
（TaKaRa）， 2 μL蛋白酶K（20 mg/mL）， 轻弹混匀后
PCR仪中 65℃温育 90 min， 接着 95℃保温 10 min。
样品于 13 000 r/min 离心 1 min， 取其上清液用于
PCR扩增或者于-20 ℃保存备用。
1.2.3 mtDNA 序列扩增 利用 Powers 等 [19]设计的
上下游引物对 #C2F3（GGTCAATGTTCAGAAATTT
GTGG）和#1108（TACCTTTGACCAATCACGCT）扩增
根结线虫线粒体DNA（mtDNA）coⅡ（细胞色素氧
化酶亚基Ⅱ ）与 lrRNA 基因间序列。 PCR 反应使
用Ex Taq 酶 PCR 扩增试剂盒（TaKaRa）， 总体系
为 50 μL， 其中 10×PCR Buffer 5 μL， dNTPs 4 μL，
Mg2+ 3μL， 上下游引物各 1 μL， Ex Taq酶 0.25 μL，
DNA 模板 5 μL， 灭菌双蒸水 30.75 μL。 PCR 扩增
褪火温度为 53 ℃ ， 共 35 个循环 。 PCR 产物经
1.8％琼脂糖凝胶电泳检测观察， 并对目的条带进
行切胶回收、 连接、 转化， 最后挑取阳性克隆送华
大基因公司测序。
1.2.4 rDNA- IGS2 序列扩增 利用 Long 等 [20]设
计的象耳豆根结线虫特异引物对MeF（AACTTTTGT
GAAAGTGCCGCTG）和MeR（TCAGTTCAGGCAGGA
TCAACC）扩增 rDNA 的基因间隔区 IGS2。 PCR 反
应使用 Ex Taq 酶 PCR 扩增试剂盒（TaKaRa）， 总
体系为 25 μL， 其中 10×PCR Buffer 2.5 μL， dNTPs
2 μL， Mg2+ 1.5 μL， 上下游引物各 1 μL， Ex Taq酶
0.25 μL， DNA 模板 5 μL， 灭菌双蒸水 11.75 μL。
PCR扩增褪火温度为 54 ℃， 共 35 个循环。 PCR 产
物经 1.8％琼脂糖凝胶电泳检测观察。
1.2.5 序列分析与系统发育树构建 所获序列利
用 BlastN程序在 NCBI 网站（http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov/Blast.cgi）上进行序列同源性搜索比对分析； 基于
mtDNA序列的系统发育树使用 MEGA6.0软件的最大
似然法进行构建[21]， 选取松材线虫（Bursaphelenchus
xylophilus）为外群序列（outgroup）， 建树步长重复数
为 1 000 次（bootstrap replicates=1 000）。
2 结果与分析
通过对采自海南省各市县根结线虫样本纯化种
群的形态学观察和分子鉴定， 确定在海南省海口、
三亚、 澄迈等 15 市县均有象耳豆根结线虫的发生，
寄主作物包括多种蔬菜以及胡椒、 番石榴、 枣树等
（表 1）。
2.1 形态学特征
显微镜下对二龄幼虫和雌虫会阴花纹进行观
察， 表1 所列的各种群具有相似的形态特征。 二龄
幼虫线形， 体环小而清晰； 头冠明显， 侧唇大呈三
372- -
第 2 期
表1 象耳豆根结线虫在海南的分布地点和寄主作物
Table 1 Distribution and hosts of Meloidogyne enterolobii in Hainan
序号 种群代号 采集地 寄主
1 HKC1 海口长流镇 辣椒 Capsicum annuum
2 HKC2 海口长流镇 丝瓜 Luffa cylindrica
3 WCT1 文昌潭牛镇 红薯 Ipomoea batatas
4 WCT2 文昌潭牛镇 胡椒 Piper nigrum
5 SYY1 三亚崖城镇 豇豆 Vigna unguiculata
6 SYY2 三亚崖城镇 黄瓜 Cucumis sativus
7 SYY5 三亚崖城镇 南瓜 Cucurbita moschata
8 SYH1 三亚海棠湾 枣树 Ziziphus jujuba
9 SYH2 三亚海棠湾 哈密瓜 Cucumis melo
10 DZC1 儋州长坡镇 茄子 Solanum melongena
11 DZL1 儋州两院 辣椒 C. annuum
12 DZL2 儋州两院 番石榴 Psidium gugjava
13 LDF1 乐东佛罗镇 辣椒 C. annuum
14 LDF2 乐东佛罗镇 豇豆 V. unguiculata
15 LDJ1 乐东尖峰镇 辣椒 C. annuum
16 LDJ2 乐东九所镇 红薯 I. batatas
17 CJC1 昌江叉河镇 辣椒 C. annuum
18 QHP1 琼海坡心镇 辣椒 C. annuum
19 QHP2 琼海坡心镇 豇豆 V. unguiculata
20 DFG1 东方感城镇 南瓜 C. moschata
21 DFB1 东方板桥镇 辣椒 C. annuum
22 DFB2 东方板桥镇 菜豆 Phaseolus vulgaris
23 DFB3 东方八所镇 番茄 Lycopersicon esculentum
24 DFD1 东方大田镇 菜豆 P. vulgaris
25 WNC1 万宁长丰镇 辣椒 C. annuum
26 WNC2 万宁长丰镇 丝瓜 L. cylindrica
27 BSB1 白沙邦溪镇 菜豆 P. vulgaris
28 BSB2 白沙邦溪镇 豇豆 V. unguiculata
29 LGL1 临高临城镇 番茄 L. esculentum
30 CMY1 澄迈永发镇 辣椒 C. annuum
31 CYM2 澄迈永发镇 茄子 S. melongena
32 CYM3 澄迈永发镇 菜豆 P. vulgaris
33 CYM4 澄迈永发镇 黄瓜 C. sativus
34 LSS1 陵水三才镇 丝瓜 L. cylindrica
35 BTX1 保亭新政镇 黄瓜 C. sativus
36 BTX2 保亭新政镇 苦瓜 Momordica charantia
37 TCX1 屯昌西昌镇 辣椒 C. annuum
38 TCX2 屯昌西昌镇 豇豆 V. unguiculata
角形； 口针纤细， 基部球清楚、 大、 圆， 与口针基
杆分界明显； 中食道球呈椭圆形， 直肠膨大； 透明
尾区界限明显， 尾尖钝圆（图 1-a、 b）。 具体测量
值为（n=20）： 体长（L）为 392～453 μm， 体宽（W）为
15.3～16.7 μm， 口针长 （ST）为 10.5～12.8 μm， 背
食道腺开口到口针基球附近的距离（DGO）为 3.9～
5.0 μm， 尾长（Tail）为 47.4～60.1 μm。
雌虫会阴花纹种群内个体之间存在轻微变异，
但种群之间变异程度相近。 主要特征表现为花纹呈
椭圆形或近圆形， 背弓通常较高， 线纹紧密且细，
呈波浪形（图 1-c、 d）。 大多数会阴花纹无侧线，
少数具 1条或 2条不明显的侧线。
龙海波等： 海南省象耳豆根结线虫的鉴定研究 373- -
第 36 卷热 带 作 物 学 报
2.2 分子鉴定
应用根结线虫通用引物 #C2F3 和 #1108 扩增
表 1 中 38 个种群的 mtDNA coⅡ与 lrRNA 基因间
序列， 均获得了大小约 700 bp的电泳条带（图 2）。 通
过对随机选取的 HKC2、 WCT2、 CJC1、 DZL1、 WNC1、
LGL1、 CMY2、 TCX1、 LSS1 和 SYH1 等 10 个种群
mtDNA扩增产物进行测序， 片段长度均为 705 bp，
且各种群之间的序列一致性为 100％。 BlastN 同源
性搜索比对显示 SYH1 种群与 NCBI 数据库中的玛
雅古根结线虫（M. mayaguensis）（与M. enterolobii同
种异名）一致性为100％（AY446969， E-value=0）。
应用象耳豆根结线虫特异引物对 MeF和 MeR扩
增表 1 各种群的 IGS2 序列， 均获得长度约 300 bp
的特异条带， 对照南方根结线虫无扩增条带（图 3）。
a： 二龄幼虫头部； b： 二龄幼虫尾部； c、 d： 雌虫会阴花纹。 标尺： 10 μm。
a: the head of second stage juvenile; b: the tail of second stage juvenile; c, d: the perineal patten of female. Scar bar: 10 μm.
图1 象耳豆根结线虫形态学特征
Fig. 1 Morphological character of Meloidogyne enterolobii
a b c d
泳道1～10： 象耳豆根结线虫种群HKC2、 WCT2、 CJC1、 DZL1、 WNC1、 LGL1、
CMY2、 TCX1、 LSS1和SYH1； 泳道11： 南方根结线虫对照； M： DL2000DNAMarker。
Lane 1-10: Meloidogyne enterolobii isolates HKC2, WCT2, CJC1, DZL1, WNC1, LGL1,
CMY2, TCX1, LSS1 and SYH1; Lane 11: M. incognita control; M: DL 2 000 DNA Marker.
图2 象耳豆根结线虫mtDNA扩增片段电泳检测结果
Fig. 2 PCR on single juvenile with mtDNA primers
2 000
750
300
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
2 000
750
300
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
泳道1～10： 象耳豆根结线虫种群HKC2、 WCT2、 CJC1、 DZL1、 WNC1、 LGL1、
CMY2、 TCX1、 LSS1和SYH1； 泳道11： 南方根结线虫对照； M： DL 2 000 DNAMarker。
Lane 1-10: Meloidogyne enterolobii isolates HKC2, WCT2, CJC1, DZL1, WNC1, LGL1,
CMY2, TCX1, LSS1 and SYH1; Lane 11: M. incognita control; M: DL 2 000 DNA Marker.
图3 象耳豆根结线虫IGS特异片段电泳检测结果
Fig. 3 PCR on single juvenile with IGS specific primers
374- -
第 2 期
图4 基于根结线虫mtDNA序列的进化发育分析
Fig. 4 Phylogenetic tree of the root knot nematode Meloidogyne spp. mtDNA sequences
AY942850 M. hapla
AY672412 M. partityla
JN241928 M. minor
AY757884 M. graminicola
JN241902 M. chitwoodi
JN241954 M. fallax
JX100439 M. Javanica
AY942849 M. morocciensis
GQ266685 M. arenaria
AY942851 M. paranaensis
AY635609 M. fioridensis
0.05
96
81
99
89
100
76
99
70
84
100
JX100439 M. incognita
SYH1
AY446969 M. mayaguensis
GQ870255 M. enterolobii
JQ514068 B. xylophilus
3 讨论与结论
植物病原线虫种类的准确鉴定是治理线虫病害
的基础， 通过鉴定， 依据线虫发生种类的为害特点
和生物学特性， 从而可制定出相应的防治策略。 本研
究结果二龄幼虫的测量值和雌虫会阴花纹的形态特征
与 yang等[7]首次描述的象耳豆根结线虫的二龄幼虫
观测值和雌虫会阴花纹类型相符合。 而根据 mtDNA
扩增片段的大小和归类分析比对更是将象耳豆根结
线虫（~700 bp）与南方根结线虫（~1 700 bp）、 爪哇
根结线虫（~1 700 bp）和花生根结线虫（~500 bp）区
分的一种快速、 简单有效的方法[19]。 同时， 本研究
所扩增的象耳豆根结线虫 IGS2 特异序列大小与
Long等[20]所描述的一致。 因此， 以上的形态学特征
和 DNA 序列结果表明了本研究耳豆根结线虫鉴定
结果的准确性。
本轮鉴定研究在海南海口、 儋州、 三亚等 15
个市县的蔬菜等作物上鉴定出象耳豆根结线虫的寄
生为害， 其中枣树、 胡椒、 红薯、 胡椒和哈密瓜为
首次在海南发现的新寄主。 结合有研究报道象耳豆
根结线虫在定安和琼中的蔬菜上亦有发生 [10，22]， 至
此， 海南省 18 个市县除五指山市未见报道以外，
其余 17个市县已均有象耳豆根结线虫的发生分布。
值得注意的是， 贾本凯等 [22]在海南省茄果类蔬菜根
结线虫的调查鉴定中， 14 个根结线虫种群中有 6
个为象耳豆根结线虫， 还有 2个为象耳豆根结线虫
和南方根结线虫的混合侵染种群。 黄伟明等[11]对海
南 5 个市县的葫芦科蔬菜上根结线虫种群进行鉴
定， 结果发现 10 个纯化系中， 8 个为象耳豆根结
线虫。 越来越多的研究表明， 象耳豆根结线虫已成
为海南省蔬菜作物上一个主要的根结线虫病原种，
而且其快速扩散的趋势很有可能取代南方根结线虫
成为海南当地的优势种。
目前， 我国华南热区除海南省以外， 广东、 广
西和福建的一些市县也先后报道有象耳豆根结线虫
的发生[9，23-24]， 而随着全球气候变暖以及温室农业的
发展， 象耳豆根结线虫病害更有向温带地区蔓延的
趋势。 然而， 象耳豆根结线虫广泛的寄主范围、 高
度的侵染致病能力以及一些高毒化学杀线剂的禁用
等现状， 使传统的防治措施面临着严峻的挑战。 因
此， 提高农户防治意识、 加强象耳豆根结线虫的早
期鉴定研究以及建立绿色综合防控技术体系是当前
保障海南热区农业可持续发展的迫切需求。
2.3 基于 mtDNA序列的进化分析
通过对 GenBank 数据库中注册的各根结线虫
种群的 mtDNA 序列进行聚类分析， 进化树图结果
显示 SYH1 与数据库中的象耳豆根结线虫和玛雅古
根结线虫序列一致， 其步长值（bootstrap value）达
到100％（图 4）。 同时， 进化树显示象耳豆根结线
虫与南方根结线虫（M. incognita）、 爪哇根结线虫
（M. javanica）、 花生根结线虫（M. arenaria）等热带
根结线虫种聚为一个较大分支， 并且具有高置信度
（bootstrap value=84％）。
龙海波等： 海南省象耳豆根结线虫的鉴定研究 375- -
第 36 卷热 带 作 物 学 报
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