全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-14
基金项目:国家高技术研究发展计划(863)项目基金(2003AA214061,2006AA020203)
作者简介:唐玲(1983-),女,硕士研究生,研究方向:分子生物学;E-mail:tangling101499@163.com
通讯作者:闫云君(1969-),男,教授,博士生导师;E-mail:yanyunjun@tom.com;Tel:(027)87792214
酵母种类繁多,不仅作为一种重要的工业微生
物被广泛应用于各个领域,近年来,人们还利用酵
母发酵来生产抗生素,维生素和酶等高附加值的产
品,但酵母也会引发食物、制造物的腐坏变质,从而
给人们带来巨大的经济损失,有的酵母还是人体和
动物的致病菌(如,Candidaalbicans)。近两个世纪
以来,酵母菌分类主要依据形态学鉴定和生理生化
特性。目前,已发展起来各种用于酵母快速检测的
商业化的试剂盒,可实现部分酵母(多是针对导致
疾病的部分致病酵母)的鉴定,但是该类试剂盒对
酵母的检测不仅费时,而且鉴定结果准确性不高。
由于受到环境因素的影响,某些酵母菌属、种在形
态学及生理生化特性方面差异极不显著,在这样的
背景下,以化学为基础的分类法建立起来,通过细
胞壁的成份、生物合成以及同功酶电泳图谱分析来
对酵母进行分类鉴定。现在,随着分子生物学的发
展,DNA-DNA杂交,染色体组型分析(electrophoretic
karyotyping),染色体 DNA的限制性片段长度的多
态性分析(RestrictionFragmentLengthPolymorphisma
ofchromosomalDNA),线粒体 DNA(mitochondrial
DNA)及核糖体 DNA序列分析 (ribosomalDNA
sequencing),实时 PCR(real-timePCR),基因芯片
(genechips)等分子生物学的方法广泛地应用于酵
母的鉴定中。分子生物学的方法不仅能够快速的将
各种酵母鉴定到属或种,而且鉴定的结果精确度更
高。随着数据库中分子信息量的增加,近年来应用
分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛。
1 核糖体 DNA鉴定法
核糖体 DNA普遍存在于生物中,真核生物的
核糖体 RNA中包括 26S、18S、5.8S和 5S4种不同
酵母的分子生物学鉴定
唐玲 刘平 黄瑛 杨江科 闫云君
(华中科技大学生命科学与技术学院 分子生物物理教育部重点实验室,武汉 430074)
摘 要: 酵母种类繁多,与人类的关系极其密切,但目前由于研究方法的不同,对于酵母的分类还存在着不同的分
类体系。而准确快速的对酵母进行鉴定,既可以有效防止食品腐化变质,又可以增加经济效益,同时也为酵母的分类鉴定
奠定一定的理论基础。对常用的核糖体DNA鉴定法、DNA指纹图谱鉴定、脉冲场电泳鉴定、实时PCR和基因芯片等分
子生物学鉴定方法在酵母鉴定工作中的研究情况进行了比较。
关键词: 核糖体DNA DNA指纹图谱 脉冲场凝胶电泳 实时PCR 基因芯片
MolecularBiologyIdentificationforYeast
TangLing LiuPing HuangYing YangJiangke YanYunjun
(KeyLaboratoryofMolecularBiophysics,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430074)
Abstract: Yeastshavewiderangeandareimportanttohumanbeings.Thereexistsomeclasificationsystemsof
yeastsbasedonresearchmethods.Itisnecesarytofindanaccurateandeficientmethodtoidentifyyeasts,thusbeing
abletopreventfoodcoruption,andincreaseeconomiceficiency.Also,informationabouttheclasificationcouldbe
provided.Thispaperdescribedmolecularidentificationmethodsforyeast,includingribosomalDNA,DNAfingerprinting,
pulsedfieldgelelectrophoresis,real-timePCRandgenechips.
Keywords: RibosomalDNA DNAfingerprinting PulsefieldgelelectrophoresisRealtimePCR Genechips
2008年第5期
沉降系数的核糖体 RNA片段,它们分别对应的基
因片段既具有遗传上的相对稳定性,同时由于各种
原因具有一定的突变,使它们作为一种良好的生物
分类鉴定材料得到广泛的重视。早期一般选取大小
适中的 18S序列作为鉴定的标准,随后 26S的 D1/
D2区序列和 ITS序列也被用于应用于鉴定工作中
(图 1)。
1.1 26SrDNA的 D1/D2序列
26SrDNA5末端有一个长约 600bp的 D1/D2
序列,根据 Petercon[1]对核苷酸序列可变区 D2的多
态性分析,发现这一区域在同种间的该区域核苷酸
的差异小于 1%,而不同种之间的差异通常远远大
于这个数据,这一试验结果表明可以利用 26S
rDNA的 D2区域进行引物设计 NL1(5′-GCATATCA
ATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和 NL4(5′-GGTCCGTG
TTTCAAG-3′)扩增 26SrDNAD2区基因片段,根据
同源性序列来对待测酵母进行分类。该方法已经作
为一种酵母分类和鉴定的方法被人们广泛采用。通
过 Kurtzman等[2]在子囊类酵母 26S大亚基的研究
以及 Fel等[3]对担子酵母和类酵母真菌 26S大亚基
的研究,基于 26S的 D1/D2的酵母鉴定数据库初步
形成。目前绝大多数酵母菌种模式菌株的 26S
rDNA大亚基序列已被测定和公布,对于鉴定提供
了很大的帮助。因此,现在广泛采用这种方法进行
酵母菌的鉴定[4]。但是 Kurtzman与 Fel在利用该方
法进行鉴定工作中发现,有的亲缘关系很接近的种
类仍旧没有办法进行明确的鉴定。为此,分别引入
了 DNA杂交和 ITS的方法对鉴定工作中有分歧或
不确定的种类进行进一步的确证。
1.2 18S rDNA基因序列
18SrDNA作为一种经典的鉴定方式在真菌的
鉴定工作中占有重要作用。用于扩增 18S片段的
PCR引物是根据真菌 18S的保守区域设计。常用的
引物:正向引物:5-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAG
TA-3和反向引物:5-CCTTGTTACGACTTCACCTTC
CTCT-3。通过 PCR对酵母 18SrDNA片段特异性
的扩增并测序,把测序结果进行多态性分析,从而
将待测酵母正确的分类[5]。
1.3 5.8S-ITS
ITS1与 ITS2属于间隔区,利用 ITS1和 ITS2的
保守序列设计引物(ITS1:5-TCCGTAGGTGAACCT
GCGG-3,ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3),
扩增 ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列,扩增产物大小在
350~1000bp不等。通过扩增产物多态性分析对酵
母进行分类。Rosa在对 Candidasp.中的各个种的
确定中也也发现了这个缺陷,在将 PCR扩增产物
比对时发现 26SrDNAD1/D2序列的特异性没有
5.8S-ITS的效果好。
1.4 IGSrDNA基因序列
IGSrDNA处于转录间隔区,由于该区段选择
压力相对较小,在进化过程中存在着比表达序列更
为丰富的变异。序列差异较好地反映了种属间的系
统发育关系。根据 IGSrDNA的保守区域设计引物:
(26SF:5-ATCCTTTGCAGACGACT TGA-3,5SR:5-
AGCTTGACTTCGCAGATCGG-3),57℃退火进行扩
增,得到大小各异的 IGS1片段,根据片段的同源性
对酵母进行分类。利用 IGS1来鉴定遗传距离近得
菌株能够更加有效的将其快速便捷的分类,其种间
分辨能力远大于 ITS鉴定。目前,这一方法的应用
仍旧相对较少,在对同源性非常接近的种属研究
中,这一方法有很大的研究前景[6]。
核糖体 DNA多态性分析越来越广泛的应用于
各种微生物的鉴定工作中。其中,研究最为广泛的
是 26SrDNA大亚基。通过 Kurtzman和 Fel的努
力,将子囊菌和担子菌中的大部分酵母的 26SD1/
D2序列测定出来进一步的确证,并在相应数据库
中公布了相关的数据资料,够迅速有效的对未知的
酵母进行快捷的分类鉴定。但是 26SrDNAD1/D2序
列的研究的精确性却不如 5.8S-ITS、IGS方法。由于
IGS是处于转录间隔区,其遗传的稳定性相对较
弱,从而使其在种与种之间的特异性增强,以达到
快速准确鉴定的目的。现在对于 ITS和 IGS的信息
有待进一步的完善。
2 DNA指纹图谱鉴定法
2.1 ITS/RFLP
只利用 5.8S-ITS扩增结果对于酵母进行鉴定,
图 1 真核生物中编码核糖体的序列(5-3)
唐玲等:酵母的分子生物学鉴定 85
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需要了解这段序列的一级结构。如果用 CfoI、HinfI、
HaeII限制性内切酶酶切,通常经过 3种内切酶酶
切后的 DNA片段大小显示出来的电泳结果的多态
性就可以将不同种属的酵母进行归类。Esteve-
Zarzoso[7]利用这种方法对包括子囊菌类酵母和担子
菌类酵母的 25个属中的 132株菌种成功的进行了
鉴定,并提供了一个初级的酵母 ITS/RFLP数据库。
除 Cr.albidus和 K.lactis等少数种类以外,大多数
的酵母都可以利用这个方法进行鉴定。但是有的种
需要用特殊的限制性内切酶进行切割协助鉴定工
作。Rosa[8]采用这个方法将 Candida的 163个种进行
了分类鉴定,初步获得了 ITS/RFLP在酵母分类鉴
定的应用的数据库。这种方法对于研究自然发酵过
程中酵母的有性无性世代及过程中的优势种的研
究有很重要的作用。
现在这一方法已经广泛的用于酵母的鉴定及
其他的真菌的鉴定工作中,并获得了较好的效果。
但是由于已公布的 5.8S/RFLP的序列信息相对还
比较少,尽管限制性图谱可以反映各种属的特异
性,但对于单个的酵母细胞的快速鉴定还有一些困
难。而且凡是可以引起酶切位点变异的突变均可导
致 RFLP的产生,从而影响图谱的特异性,进而影
响鉴定的结果。
2.2 RAPD(random amplifiedpolymorphicDNA)
技术
利用约 10个碱基随机组成的片段作为引物对
基因组的 DNA或者直接用单菌落进行 PCR扩增,
根据基因组 DNA的多态性来检测菌株间基因组
DNA内核苷酸序列存在的微小变异。利用这些差
异的大小来对相应菌种进行分类鉴定。选取合适的
引物是 RAPD技术成功的关键。CX5:5-ACACTGC
TTC-3和 PST:5-CAGTTCTGCAG-3[9]对临床上的
非白色念球菌类假丝酵母快速鉴定有很好的作用。
Gomes等[10]利用 RAPD对从巴西燃料酒精产品和啤
酒产品中分离到 10种具有代表性的酵母菌株进行
了研究,利用 OPB-02(TGATCCCTGG),OPB-10(CT
GCTGGGAC),OPB-11(GTAGACCCGT),OPB-12(C
CTTGACGCA),OPB-13(TTCCCCCGCT),OPB-17(A
GGGAACGAG)和 OPB-20(GGACCCTTAC)作为引
物扩增对酿酒工业酵母种类进行鉴定。RAPD和
KTS(Kilertoxinsensitivity)技术联用在对亲缘关系
较近的酿酒酵母进行分类研究有很重要的作用[11]。
Consuelo等[12]用 RAPD技术对致病性 Candidaspp.
进行了快速有效的检测。目前,这种方法常用于酿
酒工业酵母以及临床早期的感染源的检测。
2.3 基于 DNA重组探针的指纹图谱
利用重复性的微卫星 DNA作为单一探针进行
PCR反应,扩增产物形成特异的指纹图谱,通过指
纹图谱的特异性来鉴定酵母。这种方法所得到的反
应产物较之普通的探测菌种 DNA多态性的方法具
有更丰富的多态性;检测容易、重复性较好,适合于
进行自动化分析。可以用于这种方法的重组序列包
括 (GTG)5、(GACA)4、M13核 心 序 列 (GAGGGT
GGXGGXTCT)[13]、(CA)8、(CT)8等。Wieland[14]利用
此法勒获得 Cryptococcusneoformans的指纹图谱。
该方法适合于数量少,退化严重的流行病相关微生
物的分类研究。
3 其它
3.1 脉冲电场凝胶电泳(pulsedfieldgelelectrop
horesis,PFGE)鉴定法
依靠有规律地改变电场的方向而使大分子
DNA得以分离。目前,已能分辨出高达 6000kb乃
至 10000kb以上的 DNA片段[15]。染色体条数及其
大小代表了一个生物所含有的遗传物质的多少及
其组织形态的特征随物种的分化而改变,因而具有
特定的系统分类学意义。遗传学上的连锁群分析技
术曾被用来研究一些有性型真菌,包括一些酵母菌
的染色体条数。白逢彦[16]利用这个方法对利用形态
和生理生化形状没有办法鉴定的部分疑难酿酒酵
母菌株进行了脉冲电泳核型比较分析,发现这些菌
株的电泳核型有明显的不同。但 PFGE不能应用于
无性型真菌或难以进行有性生殖的种类。染色体组
成多态性的存在虽然使脉冲电泳核型分析在种内
菌株间遗传差异的显示上具有一定价值,但却影响
了其作为种间鉴别特征的直观性。而且无论是
RAPD还是核糖体 DNA都比核型图谱的分辨能力
要高。
3.2 实时 PCR
实时 PCR是近 10年发展起来的技术,通过在
PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累
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实时监测整个 PCR进程的定量分析方法。该方法
被认为是现在检验低丰度的 DNA病原体的临床样
本的最灵敏的方法,故在流行病的早期探测和分类
有很重要的作用。利用实时 PCR系统和种属特异
酶来对 candidasp.和果汁腐坏酵母进行检测和鉴
定中应用前景广阔[17,18]。为了使检测更加有效,在
探测和鉴定的过程中研究者通常利用特异性的基
因序列的表达情况来帮助判断,Trama[19]首次通过
实时 PCR与焦磷酸测序联用的方法来对 Candida
vaginitis相关 candidasp.进行探测和研究,并证实
了 2种方法联用在对 Candidavaginitis相关 candida
sp.的研究中的重要作用。
3.3 基因芯片
随着人们对酵母基因组全序列的信息的掌握,
研究者搜集到大量的探针并将其固定在一定的介
质上,这些探针能够扩增出基因组上的 ORF或者
原位表达一些序列以达到检测和鉴定的目的。目前
Candidaalbicans的基因芯片的研究已经初见成效[20]。
4 展望
随着分子生物学的发展,越来越多的方法被广
泛应用于酵母分类鉴定的工作中,大多数的酵母可
以通过其中的一些方法快速准确的鉴定出来,但是
对于一些通过一种方法难于鉴定的种类,可以利用
两种或多种技术联用以达到鉴定的目的。对致病性
酵母(如 Candidasp.)的检测和鉴定研究则多利用
灵敏度更高、检测更加快捷的方法。如实时 PCR、基
因芯片等方法。随着技术的进步,用于酵母鉴定的
数据、资料在不断的更新和完善,酵母的分类和鉴
定将会更加快速精确。
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