全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2007, 19:216-220
文章编号:1001-6880(2007)02-0216-05
　
　
　收稿日期:2006-06-19　　　接受日期:2006-08-28
＊通讯作者 Tel:86-21-62232019;E-mail:wiqn@bio.ecnu.edu.cn
药用真菌金耳的 rDNAITS序列分析与鉴别
刘春卉 ,瞿伟菁＊ ,张　雯 ,焦　磊
华东师范大学生命科学学院 ,上海 200062
摘　要:研究了两个居群的金耳 Tremellaaurantialba以及近似品的 rDNAITS区碱基全序列的特征及其差异 ,首
次报道了金耳的 ITS和 5.8SrDNA完整序列 , 序列总长度为 467 ～ 468, 长度变异较少。聚类分析表明两个居群
金耳亲缘关系非常密切 ,金耳药材和近似品金黄银耳形成一个稳定的独立分支 , 近似品黄金银耳形成另一个分
支。 ITS序列的差异为金耳的鉴别提供了可靠的分子标记 , 为金耳菌类药材基原入药建立了遗传基础。
关键词:金耳;核糖体 DNA;ITS序列;居群;近似品;DNA分子鉴别
中图分类号:R284.5 文献标识码:A
DNAMolecularIdentificationofMedicinalMushroom
TremelaaurantialbaBasedonITSSequences
LIUChun-hui, QUWei-jing＊ , ZHANGWen, JIAOLei
SchoolofLifeScience, EastChinaNormalUniversity, Shanghai200062 , China
Abstract:TherDNAITSsequencesfromtwopopulationsinChinawerestudiedandthreeanalogspecieswerediscussed
together.ThewholesequencesofrDNAITSregions(includingITS-1, 5.8SandITS-2)ofTremellaaurantialbawerere-
portedfirsttime.Theresultsshowedthatlitlediferenceinlengthbetweenthesequenceswasfoundandthelengthwas
467bpand468bp, respectively.TremellaaurantialbaandTremelaaurantiaformedaseparatestablebranchinthetopol-
ogytrees, whileTremelamesentericaclusteredonanotherclade.TherelationshipbetweentwopopulationsofTremela
aurantialbainYunnanandShanxiprovincesandTremelaaurantiaiscloselyrelated, andtheycanreplaceeachotheras
thesamemedicineaccordingtotherDNAITS.ThecharacterofITSsequencescanbeusedforprovidingthemolecular
markersforidentifyingTremelaaurantialbaandexploringitsgeneticbasisoffungalsources.
Keywords:Tremelaaurantialba;rDNA;ITSsequence;population;analogspecies;DNAmolecularidentification
　　金耳来源于担子菌纲银耳科银耳属植物金耳
(Tremelaaurantialba)的金黄色脑状子实体 ,为珍稀
濒危真菌 ,民间对其药用历史悠久 , 《本草纲目》和
陶弘景 《名医别录 》有记载 , 《中国药用真菌 》述其主
治肺热 、痰多 、感冒咳嗽 、气喘 、高血压等症 [ 1-4] 。同
属还有近似种金黄银耳 TremelaaurantiaSchw:Fr、
脑状银耳 TremelaencephalaPers.、黄金银耳 (与橙
黄银耳同物异名)TremelamesentericaRetz.:Fr.。
现代药理研究发现金耳富含水溶性多糖 ,连续服用
金耳子实体能化痰止咳并对四氧嘧啶所致糖尿病大
鼠高血糖模型具有显著的降糖作用[ 5] ,金黄银耳子
实体多糖也能明显降低正常小鼠及链脲霉素致高血
糖小鼠血糖和血浆胆固醇水平 [ 6, 7] ,黄金银耳子实
体有较强的平喘作用 [ 8] ,其多糖也有降低大鼠高血
糖作用的报道 [ 9] 。
由于金耳颜色和外形与几个近似种极为相似且
易混淆 ,金耳种名一直被误定为 Tremelamesenterica
[ 10, 11] ,原产中国的金耳药材主流资源直至二十世纪
九十年代才得以确认并正式定名 Tremelaaurantial-
baBandonietZang[ 12, 13] 。鉴于同属的近似品种较
多 ,依据单纯形态学方法和化学成分难以鉴别 ,同时
近似种已有相似药理作用的报道 ,为防止品种源头
混乱 ,保护种质资源 ,解析其它近似种的种质差异及
可替代性 ,因此对金耳药材基源及其遗传基础进行
准确界定 ,不仅有助于规范资源的生产和保存 ,也可
丰富生药资源库和数据库的基础信息。通过检索
GenBank和 EMBL数据库 ,发现近似种金黄银耳
Tremelaaurantia、脑状银耳 Tremelaencephala、黄金
银耳 Tremelamesenterica的 rDNAITS(核糖体内转
录间隔区)序列均已注册 ,而金耳 Tremelaaurantial-
DOI :10.16333/j .1001 -6880.2007.02.008
ba的 ITS序列尚无录载。真菌核糖体中的内转录
间隔区序列的进化速率较快 ,可以提供较丰富的变
异位点和信息位点 ,不仅广泛用于近缘属间 、属内种
间的分子系统学及鉴别 ,而且也被用于种内居群间
的差异性研究 ,为此研究选择国内两个地域较远的
金耳品种的 rDNAITS区碱基全序列作为分子标记
进行测定 ,并结合 GenBank收载的近似品的 ITS序
列进行分析 ,试图为金耳药材的种质鉴定提供分子
依据。
1　材料和方法
1.1　材料
金耳 Tremelaaurantialba子实体分别为 9901
产地为云南丽江(简称 A13), 9102产地为山西(简
称 A23,以下括号内均为简称),由瞿伟菁教授鉴定 。
GenBank收载本研究引用的其它银耳属真菌及其
GenBank登录号如下:金黄银耳 Tremelaaurantia
AF444315 (Ta)、 脑 状 银 耳 Tremela encephala
AF410474(Te1), AF042404(Te2), AF042402(Te3)、
黄金银耳 TremelamesentericaAF042448(Tm1),
AF042443(Tm2)、银耳(白木耳)Tremelafuciformis
AF444316(Tf)。
1.2　总 DNA提取
总 DNA提取基本依照氯化苄法[ 14]略加改进 ,
步骤如下:收集消毒供试子实体各 0.1 g,加 0.5 mL
提取液(0.1 mol/LTrisHCl, pH9.0和 0.04 mol/L
EDTA, pH8.0)研磨混匀 , 加 0.1 mL10%SDS和
0.3mL氯化苄充分混匀 , 50℃保温 1h,加 0.3 mL3
mol/LNaOAc(pH 5.2)混匀 , 冰水浴 15 min, 6000
rpm室温离心 15 min,取上清加等体积无水乙醇室
温沉淀 20 min,去上清 , 10000rpm室温离心 15min,
沉淀用 70%乙醇洗一次 ,风干后水溶 , 4 ℃保存 ,
1.5% Agrose琼脂糖凝胶电泳 (100 V电压下电泳
30 min)检测纯度和分子量范围。
1.3　rDNAITS区的扩增 、纯化和测序
采用双向 PCR反应扩增 ITS1-5.8SrDNA-ITS2
整个片段 ,用 18SrDNA3′端引物作上游引物 ITS1:
5′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′, 用 28SrDNA5′
端引物作 下游引物 ITS4:5′-TCCTCCGCTTATT-
GATATGC-3′。反应体系 (50 μL)含:模板:5×10-9
g,引物 ITS1和 ITS4(2×10-5 mol/L)各 1μL, 10×
PCR缓冲液(pH8.3)5μL, dNTP(0.01 mol/L)4
μL, Taq酶(5U/μL)0.25 μL(引物和 Marker购自
上海生工 , Taq酶和 dNTP购自大连宝生物公司),
灭菌双蒸水定容至 50 μL, 加好后上盖石蜡油 25
μL。扩增条件:94 ℃预变性 5 min, 94 ℃ 1 min, 55
℃ 45 s, 72 ℃ 1 min,循环 30次 , 72 ℃延伸 5 min,
产物于 4℃保存。 Agrose琼脂糖凝胶电泳检查产物
(Marker分子量范围 100 ～ 1200 bp),产物纯化回收
(北京鼎国公司 PCR产物试剂盒),每样平行重复 5
次 ,纯化后的产物以与 PCR相同的引物双向直接测
序(华大基因上海鼎安公司完成)。
1.4　序列分析
用 DNAStar(DNAStar, Inc.1996)软件包编辑 ,
ClustalW对位排序 ,在线 BLAST检索 ,从 Genbank
中提取其它相关真菌的 ITS序列 ,用 Mega2.0分子
进化遗传分析软件 ,选择药性较近的药用菌木耳
AuriculariaauricularAF291268 (Aa)作 为 外 类
群[ 1, 15] ,统计和分析序列的变异情况 ,采用系统学分
析软件 PAUP4.0中的邻接法 (neighbor- joining
method, NJ),最大简约法(maximumparsimonymeth-
od, MP)和最大似然法(maximumlikelihoodmethod,
ML)推测系统关系 。采用启发式 TBR(tree-bisec-
tion-reconnection)搜索运算 ,依据转换与颠换比值推
测距离 ,自展检验 bootstrap重复 10000次构建 NJ拓
扑树;每个碱基作为无序排列位点 ,并具有相等的权
重 ,自展检验 bootstrap重复 1000次构建 MP拓扑
树;应用 Modeltest3-06选择 GTR作为最适进化模型
参数进行 ML法分析 ,对建立的进化树自展检验
bootstrap进行可靠性评价 。
2　结果
2.1　测序得到金耳 2个来源的各自 ITS1-5.8S-
ITS2完整序列 ,结果已提交至 GenBank,长度 、G+C
含量和 GenBank序列登记号见表 1。金耳 ITS1的
长度范围 、GC含量与金黄银耳和脑状银耳十分接
近 ,与黄金银耳有比较大的差异;ITS2的长度范围 、
GC含量与金黄银耳相同 ,与脑状银耳和黄金银耳差
异较大。
2.2　排列后的 ITS序列见图 1,根据 Kimura-2参数
遗传距离模型计算得到的序列间遗传距离见表 2,
内群物种核苷酸变异位点 250个 , 简约信息位点
143个;在内群和外群之间的遗传距离范围为 1.107
(黄金银耳与木耳)-1.230(金黄银耳与木耳),平均
种间遗传距离为 0.526;在内群种间的遗传距离范
围为 0.023 (金耳与金黄银耳)-0.710(黄金银耳与
217Vol.19 刘春卉等:药用真菌金耳的 rDNAITS序列分析与鉴别
表 1　金耳和其它近似品的 ITS1-5.8S-ITS2序列长度和 G+C含量比较
Table1　Lengths(bp)andG+CcontentsofITS1-5.8S-ITS2fromT.aurantialbaanditsanalogstrains
材料 ITS1 ITS2 ITS1-5.8S-ITS2 ACCESSION
Material Size/bp G+C/% Size/bp G+C/% Size/bp G+C/% No.(GenBank)
A13 110 41.8 199 49.3 467 45.6 DQ400104
A23 112 41.1 198 48.0 468 44.9 DQ404321
Ta 110 42.7 199 48.2 467 45.5 AF444315
Te1 110 40.9 200 49.3 470 45.3 AF410474
Te2 112 37.5 188 50.5 459 45.0 AF042404
Te3 112 36.6 188 44.3 458 45.0 AF042402
Tm1 106 48.1 176 62.2 440 53.9 AF042448
Tm2 105 47.6 176 62.7 439 54.0 AF042443
Tf 126 54.8 188 57.5 472 52.7 AF444316
脑状银耳),平均种间遗传距离为 0.370,金耳与金
黄银耳之间的遗传距离十分接近 ,两两间差异最大
仅为 3%,与脑状银耳的遗传距离也大大小于与黄
金银耳的遗传距离 ,与银耳和黄金银耳的距离接近。
图 1　2个不同来源金耳的 ITS1和 ITS2序列比较
Fig.1　SequencealignmentoftheITS1andITS2 ofTremellaaurantialbafromtwopopulations
“.”表示碱基相同 Equal;“-”表示碱基缺失 Missing
2.3　以木耳为外类群 ,用 NJ、MP及 ML三种方法
分析所得系统进化树的拓扑结构完全一致。MP法
仅产生一棵最简约树 (图 2),树长为 376, CI值为
0.8803,去除非简约信息位点的 CI值为 0.8207, RI
值为 0.8327。内群分支的自展检验值很高 ,均可达
到 90%以上。 2个来源的金耳与金黄银耳首先形成
一个高度稳定 95%的分支 ,再与脑状银耳形成支持
率为 100%的分支 ,黄金银耳单独形成 1个支持率
为 100%的分支 ,再和银耳聚为一个 91%分支 。
3　讨论
3.1　金耳药材基源的分子鉴别和亲缘关系探讨
植物核糖体中的内转录间隔区(rDNAITS区)
序列的进化速率较快 ,可以提供较丰富的变异位点
和信息位点[ 16] 。研究结果显示金耳 2个基原 ITS
序列的总长度为 309 ～ 310 bp,居群间有 11个碱基
218 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.19
表 2　Kimura-2参数模型得到的 9种金耳及近似种的 ITS序
列遗传距离
Table2　Thegeneticdistancesbetweenpairedspeciesanalyzed
(Kimura2-parameter)ofITSsequencevariation
Taxa A13 A23 TA TE1 TE2 TE3 TF TM1 TM2
A13
A23 0.027
Ta 0.030 0.023
Te1 0.094 0.083 0.095
Te2 0.082 0.075 0.075 0.056
Te3 0.078 0.071 0.071 0.067 0.010
Tf 0.575 0.549 0.595 0.600 0.626 0.626
Tm1 0.625 0.620 0.621 0.702 0.688 0.710 0.437
Tm2 0.629 0.623 0.625 0.706 0.681 0.704 0.446 0.004
Aa 1.107 1.183 1.230 1.116 1.165 1.187 1.149 1.104 1.119
图 2　银耳属 5种(9个种群)的 MP系统进化树分支上的数
值为 Bootstrap1000次的自展支持值
Fig.2　PhylogenetictreeofTremela5species(9taxa)deduced
fromITS1 +ITS2 sequenceBootstrapvalues(1000 repli-
cates)abovethebranch.Valuesarecalculatedbymaxi-
mumparsimonymethod
的差异 ,它们各自与金黄银耳仅存在 10 ～ 12个碱基
的差异 ,据此结果基本可以认为两个居群的金耳与
金黄银耳有相互代替入药的遗传基础 。本文涉及的
其他银耳属菌类仅金黄银耳为 309 bp,金耳和近似
品有较大差异 ,其中金耳和脑状银耳有 24 ～ 28个碱
基的差异 ,金耳和银耳碱基差异为 127bp,金耳和黄
金银耳碱基差异高达 145 bp,表 1结果显示 ITS序
列分子鉴别可准确反应金耳和近似品之间的差异。
由于 rDNAITS区为高变区 ,使得其在各类生物
属种间表现出明显的差异 ,目前国际上多采用 ITS
区作为各种生物类群属种间分类与系统学研究 。真
菌 rDNAITS的分子分类标准种间的距离值一般从
0.00 ～ 0.05,大于 0.05的认为是不同的种。从研究
获得的遗传距离来看 , ,金耳和金黄银耳之间的遗传
距离为 0.023 ～ 0.03,远低于银耳属种间平均遗传
距离(0.37),也在种的遗传距离范围 0.05之内 ,邻
接树的拓扑结构显示 ,金耳和金黄银耳最先聚合 ,形
态学特征 ,表示二者的亲缘关系最近 。金耳与脑状
银耳之间的遗传距离均大于 0.05,表明各自为不同
物种 ,与形态学分类相符 ,此结果也验证了 ITS序列
用于鉴别正品金耳和近似品药材的可靠性。
3.2　金耳药材基源分类位置探讨
研究结果显示金耳 2个不同居群来源药材和金
黄银耳在拓扑树上形成稳定的分支 ,支持率高达
95%,而且 GC含量 、ITS序列的长度也支持该分支
为亲缘关系很近的稳定类群 ,和银耳属其他药用真
菌具有明显的区别。金耳学名定名为 Tremelaau-
rantialba前曾存在长期误区 ,国产金耳学名多源于
邓叔群 《中国的真菌 》而定名为黄金银耳 Tremela
mesenterica[ 11] 。后经多位学者纠正 ,初由刘波更名
为金黄银耳 Tremelaaurantia[ 10] , 后被 BandoniRJ
和臧穆更名为金耳 Tremelaaurantialba,以示二者形
态上的细微差别:金黄银耳 Tremelaaurantia子实体
裂片薄 ,剖面为金黄色 ,金耳 Tremelaaurantialba子
实体裂片厚 ,剖面外层金黄色内部白色[ 7] 。从构建
的 ITS系统进化树来看 ,金耳 Tremelaaurantialba和
金黄银耳最先聚为一支 ,再与脑状银耳聚为一个大
的分支 ,遗传距离提示金黄银耳与金耳亲缘关系密
切 ,脑状银耳为一个独立的种 ,而黄金银耳 Tremela
mesenterica却与银耳 Tremelafuciformis聚为另一个
分支 。屈良鹄等 [ 16]依据不同生物类群的特点制定
了 ITS序列差异百分比值用作为某类生物种间划分
的分子标准:被子植物大多数科属其 ITS序列的种
间差异值为 1.2%～ 10.2%;真菌和藻类中 ,种间差
异值一般大于 14.0%,据此标准判定金耳 Tremela
aurantialba与黄金银耳 Tremelamesenterica确属不
同的种 ,尽管有相似的药理活性报道 ,但遗传基础差
异较大 ,因而其可替代性还有待生药学和药理学的
进一步研究。
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