全 文 ：5省裂叶荆芥 18S rDNA全序列测定与系统发育分析
刘红彬， 张丹参
（河北北方学院药学系，河北 张家口 075000）
摘 要：采用 PCR 法从 5 省栽培裂叶荆芥种子 DNA 中扩增 18S rDNA 全序列并测序，采用 DNASTAR 软件对 5 省裂叶荆芥进
行遗传距离分析；采用 ClustalX 及 MEGA 软件进行系统发育分析，NJ 法绘制系统发育树。研究结果表明，裂叶荆芥 18S rDNA 全序
列长 1 807 bp，5 省裂叶荆芥 18S rDNA 序列一致性达 100%。 河北裂叶荆芥 18S rDNA 序列 GenBank 登录号为 JN802671。 系统发
育树显示，5 省裂叶荆芥 18S rDNA 序列形成单系群。 首次获得国内 5 省裂叶荆芥 18S rDNA 全序列，一致性及系统发育分析显示
5 省裂叶荆芥为同一个品种。
关键词：裂叶荆芥； 18S 核糖体 DNA； 测序； 系统发育分析
中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1004－874X（2012）18－0170-02
Sequencing and phylogenetic analysis of 18S rDNA
of Schizonepeta tenuifolia from five provinces
LIU Hong-bin， ZHANG Dan-shen
(School of Pharmacy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China)
Abstract: This experiment was conducted to ascertain the phylogenetic relationship of Schizonepeta tenuifolia from 5 provinces. 18S
rDNA sequences were amplified from genomic DNA of seeds from 5 provinces by PCR. Sequence features were compared and analyzed
using Clustal X, MEGA and DNASTAR softwares. The phylogenetic tree was constructed by the NJ method. 18S rDNA were 1 807 bp.
The 18S rDNA sequences of S. tenuifolia from 5 provinces had the same identities. Monophyly of S. tenuifolia was revealed based on the
18S rDNA sequence data. Phylogeny and identity analysis showed that S. tenuifolia from 5 provinces were the same specie.
Key words：Schizonepeta tenuifolia; 18S rDNA; sequence; phylogenetic analysis
中药荆芥为唇形科植物裂叶荆芥 （Schizonepeta
tenuifolia ） 的干燥地上部分， 是一味应用广泛的传统药
物。 《本草纲目》记载，荆芥能“祛风解表，清热散瘀，破结
块，消痈毒”。 现代药理研究证明，荆芥还具有抗菌消炎和
解热镇痛的作用 [1-2]。 裂叶荆芥在我国大部分地区均有分
布，多系栽培，主产安徽、江苏、浙江、江西、湖北、河北等
地。 目前， 关于荆芥的分子分类学研究在国内尚未见报
道。 利用 18S rDNA序列对中草药进行分类以及分子系统
学研究 [3-4]，已成为中草药分类学的热点。 本研究提取河
北、湖北、山西、江苏及安徽的裂叶荆芥种子 DNA，PCR 扩
增其 18S rDNA 序列并测序，以探讨 5 省裂叶荆芥的亲缘
关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料裂叶荆芥种子分别采自河北安国、 湖北随
州、安徽阜阳、山西临汾、江苏江都，均为当地主栽品种。
裂叶荆芥种子经河北北方学院马淑兰教授鉴定。
琼脂糖凝胶 DNA纯化试剂盒 Ver.3.0、 克隆载体 pMD
18-T、大肠杆菌感受态细胞 JM109均购自大连宝生物公司。
1.2 试验方法
1.2.1 裂叶荆芥种子 DNA 提取 称取 100 mg 裂叶荆芥
穗中的种子，经液氮冷冻研磨后采用 CTAB法提取 DNA。
1.2.2 PCR 扩增及测序 根据 Sogin 等 [5]报道的唇形科
18S rDNA 序列通用引物设计而成 。 上游引物 P1：5-
CAACCTGGTTGATCCTGCCAGT -3， 下游引物 P2：5 -
CTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3；PCR 扩增体系：10
× PCR Buffer (Mg2+)5 μL、dNTP mixture (10 pmol/μL) 4
μL， 上下游引物 (10 pmol/μL) 各 2 μL、Taq DNA 聚合酶
0.3 μL、模板 DNA 1 μL，灭菌 ddH2O补至总体积 50 μL。
PCR扩增程序：94℃预变性 4 min；94℃变性 30 s，56℃
退火 30 s，72℃延伸 2 min，共 30个循环；72℃延伸 10 min。
PCR 产物经 3%琼脂糖凝胶电泳，通过紫外透射仪观
察并记录结果。 PCR产物送北京奥科鼎盛生物公司测序。
1.2.3 序列分析 用 DNASTAR 软件对 5 省裂叶荆芥 18S
rDNA序列进行比对和遗传距离分析。 河北裂叶荆芥 18S
rDNA序列经 BLAST搜索， 下载相似性高的中药 18S rDNA
序列， 分别为： 广藿香 18S rDNA序列 （GenBank登录号：
EF529588）、 宝盖草 18S rDNA 序列 （GenBank 登录号 ：
L49287）、地黄 18S rDNA序列（GenBank登录号 FJ598595）、
芝麻 18S rDNA 序列（GenBank 登录号 AJ236041）、马缨丹
18S rDNA序列（GenBank登录号 AJ236049）。以 5省裂叶荆
芥 18S rDNA序列为内群，以广藿香、宝盖草、地黄、芝麻、马
缨丹 18S rDNA序列为外群，共 10条序列，用 ClustalX（2.0）
收稿日期：2012-03-27
基金项目：河北省中医药管理局课题(2011100)；河北省教育厅
课题(Z2010117)
作者简介：刘红彬 lhb（1978-），女，硕士，讲师，E-mail: snowwhite_
@163.com
通讯作者：张丹参 (1961-)，博士 ，教授 ，E-mail: ds2011@yahoo.
com.cn
广东农业科学 2012 年第 18 期170
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2012.18.057
表 1 裂叶荆芥 18S rRNA 序列遗传距离分析
省份
河北
湖北
江苏
山西
安徽
河北
0.0
0.0
0.0
0.0
湖北
100.0
0.0
0.0
0.0
江苏
100.0
100.0
0.0
0.0
山西
100.0
100.0
100.0
0.0
安徽
100.0
100.0
100.0
100.0
芝麻
马樱丹
地黄
广藿香
宝盖草
山西裂叶荆芥
河北裂叶荆芥
江苏裂叶荆芥
安徽裂叶荆芥
湖北裂叶荆芥
自引导值 bootstrap 设为 1 000
图 2 裂叶荆芥 18S rDNA 系统发育树
软件进行多序列比对，比对参数为：空位开放罚分 15；空位
延伸罚分 6.66；DNA转换权重 0.5；延迟趋异序列 30%。比对
结果用 MEGA 4.1软件邻接法（Neighbor-Joining）进行系统
发育分析，绘制系统发育树。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增产物分析
PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果（图 1）显示，5 省栽培
荆芥样品均获得单一清晰目的条带， 无非特异性条带出
现，表明该对引物（P1/P2）对裂叶荆芥样品基因组 DNA有
很好的扩增效果。
2.2 遗传距离分析
使用 DNASTAR软件对 5省裂叶荆芥 18S rDNA 序列
进行遗传距离分析，结果（表 1）显示：河北、湖北、江苏、山西、
安徽 5省裂叶荆芥 18S rDNA序列一致性为 100%。
2.3 裂叶荆芥 18S rDNA基因系统发育分析
采用 MEGA 4.1 软件的邻接法 （Neighbor-Joining）进
行系统发育分析，绘制系统发育树。 从图 2 可以看出，进
化树以藿香、宝盖草、地黄、芝麻、马缨丹为树根，由树根
分出 2个分支。 5省裂叶荆芥以 100%置信度聚为一支，形
成单系群。
3 结论与讨论
裂叶荆芥属植物共 3 个种，分别是裂叶荆芥、多裂叶
荆芥和小裂叶荆芥。 由于 GenBank中没有裂叶荆芥、多裂
叶荆芥和小裂叶荆芥 18S rDNA 序列， 故在选择外群时，
以唇形科其他属中药材植物为外群， 包括广藿香、 宝盖
草、地黄、芝麻、马缨丹等。
18S rDNA序列为高度保守序列， 尽管在同一科属植
物内有很高相似性，但不同种植物的 18S rDNA 序列仍有
差异。 半夏与其伪品虎掌南星同属天南星科，刘玉萍等 [6]
扩增半夏原植物与商品药材的 18S rDNA 序列后发现二
者序列完全相同， 而半夏与其伪品虎掌南星间则存在序
列差异，有 4个变异位点。梁江等[7]扩增 3个品种栽培大豆
的 18S rDNA基因片段后发现，3个品种的相似性在 97%～
98%之间。 来自 5个省的裂叶荆芥 18S rDNA 序列一致性
为 100.0%，说明 5省栽培裂叶荆芥属于同一个种，出现该
种情况的原因为地区间的相互引种。 刘月廉等[8]利用 18S
rDNA的基因间区 ITS的序列对广东河源的野生和栽培两
个灵芝菌株进行扩增， 分别得到 644 bp 和 627 bp 的片
段。 申彦晶等 [9]利用 18S rDNA 的基因间区 ITS 的序列测
定了来自广东、广西和海南三省共 6 个地方的白木香 ITS
序列，发现 6个地方白木香 ITS序列一致性为 100%。本研
究若结合 ITS序列进行 5省裂叶荆芥的系统发育分析，则
将对研究裂叶荆芥的引种以及研究裂叶荆芥的地理演化
更具有指导意义。
参考文献：
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2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
1807bp
M：DL2000；1~5：PCR 产物
图 1 裂叶荆芥 18S rDNA 扩增结果
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