全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第1期
收稿日期:2007-06-10
基金项目:北京自然科学基金(6042004);北京都市农业学科群(XK100190553)资助
作者简介:丁宁(1979-),女,硕士,研究方向:生物化学和分子生物学
通讯作者:秦岭,E-mail:qinlingbac@126.com
细胞程序性死亡 (programmedceldeath,PCD)
是指细胞主动的有序的死亡,是一种生命的现象。
PCD的概念是由 Gluchsman在 1951年首先提出[1],
主要是研究、观察两栖类动物的变态现象。从 20世
纪 80年代以来,关于动物 PCD的研究已取得了许
多进展。人们越来越明确认识到 PCD在动物生长
发育中,特别是在维持动物体内细胞和组织的平
衡、特化、形态建成与防病抗病过程中发挥重要的
作用。有关植物细胞 PCD的研究起步较晚,1985
年,我国学者尤瑞麟[2]首次报道了正常小麦珠心细
胞衰退过程的超微结构变化,1994年 Greenberg等
提出了植物对病原体的防御反应中存在类似动物
细胞的程序性死亡现象[3]。之后,植物学家从组织
学的变化、超微结构、组织化学、细胞化学、生物化
学及分子生物学机理等方面进行了研究,找到了植
物 PCD的证据,认识到植物同动物一样,在各个阶
段的生长发育存在 PCD现象,并在植物的正常生
长和抵御不良环境过程中承担着重要的角色,引起
了人们对其机制的广泛而深入的研究。目前,植物
PCD已成为植物发育生物学研究的一个热点。PCD
之所以能够成为当今生命科学中研究的重要课题,
除了它广泛存在的生物学意义之外,在很大程度上
得益于 PCD检测方法的迅速发展。
1 植物 PCD的特征及其检测技术
1.1 植物 PCD的形态学特征及分子生物学特征
在形态上,近年来研究表明,植物与动物细胞
PCD有许多相似的特征,包括细胞形态和 DNA降
解变化等。典型的细胞程序性死亡的形态学变化过
程是:早期细胞体出现收缩,密度加大,细胞器完整
但紧密压缩,核浓缩,染色质分布于核膜边缘,随后
植物细胞程序性死亡分子机制和信号转导
丁宁 沈元月 冯永庆 秦岭
(北京农学院植物科学技术系,北京 102206)
摘 要: 细胞程序化死亡(PCD)在植物的发育、抗病及植物与环境互作等过程中发挥着极其重要的作用。总结了
植物细胞凋亡发生的特征及其检测技术,概括了植细胞凋亡的分子机制,综述了植物细胞凋亡相关激素种类及其信号转
导机制,并对植物细胞凋亡存在的问题进行分析和展望。
关键词: 程序性死亡 信号传导 分子机制
MoleculeMechanism andSignalTranslationofProgrammedCel
DeathinPlants
DingNing ShenYuanyue FengYongqing QinLing
(DepartmentofPlantScienceandTechnology,BeijingAgriculturalColege,Beijing102206)
Abstract: Programmedceldeath(PCD)playedanimportantfunctiononplantgrowthanddevelopment,disease
resistanceandtheinteractionsbetweenplantanditsenvironment.Thisarticlegivesabriefintroductionofthecharacters
andtestmethodsofprogrammedcelinplantweresummarized.Themoleculemechanism ofplantprogrammedcel,
relatedhormonesandtheirsignaltranslationmechanism werereviewed.Someproblemstobefurtherresolvedinthe
fieldofPCDresearchwerediscused.
Keywords: Programmedceldeath Signaltranslation Moleculemechanism
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
由膜包围 DNA片断而形成凋亡小体。细胞核在细
胞 PCD过程中起核心作用,但在不同细胞 PCD过
程中,细胞核的形态学变化并不完全相同,其原因
可能是 PCD细胞的状态不同以及所处的分化阶段
不同所致。在生化上,PCD细胞表现为核酸内切酶
活性增加,是染色质降解,核 DNA从核小体间降解
断裂,产生带有 3′-OH末端的、大小不同的寡聚核
小体片段,其片断大小为 180~200bp的倍数,经琼
脂糖凝胶电泳,可见 “梯形 ”DNA条带(DNA
ladder)。
1.2 植物 PCD检测方法
PCD的形态学特征是判断有无发生 PCD的基
础,经历 PCD的植物细胞呈现一些典型的形态学
特征。细胞形态学观察常用的方法有:普通光镜观
察法、荧光显微镜观察法、透射电镜观察法和激光
共聚焦显微镜观察法。细胞膜完整与否是区分
PCD与坏死的重要指标之一,除了电镜能反映细胞
膜完整性外,还可用染料排斥法,细胞膜完整的活
细胞对阳离子染料如台盼蓝(trypanblue)、碘化丙
啶 (PI)、溴化乙锭 (EB)、7-氨基放线菌素 D(7-
aminoactinomycin)(7-ADD)等有拒染能力,但死细
胞可被染料标记。但在体外培养的细胞最终也会发
生继发性坏死,因此,此法不能单独用来判断 PCD。
DNA断裂是由于内源性 Mg2+、Ca2+依赖性内切酶被
激活而使 DNA在核小体之间断裂,出现 180bp～
200bp及其不同倍数的 DNA片断 (核小体片断)。
由于 DNA降解先于凋亡细胞形态学的变化,使众
多研究者致力于寻求检测 DNA降解敏感、特异、快
速的方法。PCD过程中,DNA有规律地断裂可以通
过下述方法检测出来:琼脂糖凝胶电泳法[4];流式细
胞计数法;原位 DNA标记检测法[5];酶联免疫法[6];
彗星电泳法[7]。目前,在板栗雄花短雄花序的亚细
胞中已经清楚观察到植物细胞程序性死亡的典型
症状,并且从分子水平也进一步证实了板栗短雄花
序属于植物细胞程序性死亡现象[8]。
2 植物 PCD的分子机制
近年来随着动物中 PCD研究的深入,植物
PCD亦得到相应的研究。研究发现,植物 PCD与动
物的细胞凋亡有许多相似的特征[9]。在遗传上,植物
PCD与动物的细胞凋亡同样受到基因有序活动的
控制,目前发现与植物程序性死亡有关的因子有:
caspase、CED、蛋白激酶和核酸内切酶。
2.1 Caspase
Caspase蛋白酶 (cysteineasparticacidspecific
protease)是一类半胱氨基酸蛋白酶,它在动物细胞
程序性死亡(PCD)中既是水解蛋白质的参与者,也
是细胞程序性死亡的启动因素。它是动物 PCD执
行阶段的核心酶,它的活化直接导致凋亡细胞的解
体。在植物衰老的早期,一些衰老相关基因的表达
产物与 Caspase有一定的同源性。例如,拟南芥中
SAG2[10]、SAG12编码的半胱氨酸蛋白酶[11],番茄中
SENU2和 SENU3编码的半胱氨酸蛋白酶[12],在衰
老的甘薯叶片[13]中和茄子[14]的成熟过程中,半胱氨
酸蛋白酶大量特异表达。在衰老过程中,植物半胱
氨酸蛋白酶在蛋白质的水解和氮的重复方面可能
起着重要的作用,植物半胱氨酸蛋白酶参与了植物
的衰老、生物[15]和非生物[16]胁迫引起的细胞程序性
死亡,植物半胱氨酸蛋白酶在功能上均类似于动物
细胞中的 Caspase家族蛋白酶[17]。
2.2 CED
CED基因能提高植物抗逆境能力。Mitsuhara等
将 ced-9基因转入烟草中,与野生型相比,过量表
达 CED-9的转基因烟草植株对 UV-B、百草枯
(paraquat,接触性除草剂)的抗性明显提高。被
TMV感染的转基因烟草能够抑制病毒引起超敏反
应(hypersensitiveresponse,HR),从而抑制病毒在植
物中的进一步扩散。另外,转基因烟草具有对一些
坏死营养型真菌和滤过性病毒的抗性。与野生型烟
草相比,ced-9转基因烟草种子能在 0.2mol/LNaCl
或者 10℃条件下萌发,并且与 CED-9表达量相关。
分别将生长 1个月后的野生型和转基因烟草小苗
移到含不同浓度的盐溶液中,转基因烟草小苗对盐
的抗性较强。ced-9基因能提高切割烟草叶片和根
部的再生能力除烟草外,CED转基因番茄能抑制
CMV/DsatRNA (cucumbermosaicvirusDsatelite
RNA)低温诱导下的程序性细胞死亡,提高番茄的
存活率,并与其表达量成正比。CED基因对植物的
生长发育也有一定的影响。与非转基因植物相比,
转 ced-9基因烟草和番茄植株较矮小,果实较少或
者几乎不结果实。
26
2008年第1期
2.3 蛋白激酶
蛋白激酶主要有蛋白激酶 A(PKA),蛋白激酶
C(PKC),钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶),酪
氨酸蛋白激酶(TPK)等。近年来的研究表明,蛋白
激酶参与了多种多样细胞凋亡的信号转导,并戏剧
性地调节着细胞凋亡,有时加速凋亡,有时却可延
迟凋亡。
与细胞的其他生命现象(如增殖,分化)一样,
诱导凋亡的细胞外信号必须通过细胞内信号的转
导,才能激发自主凋亡程序。目前关于凋亡时细胞
内信号的研究涉及细胞内蛋白激酶系统、Ca2+.
cAMP及蛋白磷酸化和去磷酸化等。许多研究表明
PKA、PKC、PKG、TPK、CaM参与了多种多样细胞凋
亡的信号转导,并戏剧性地调节着细胞凋亡,有些
时候加速凋亡,有些时候延迟凋亡[18]蛋白激酶对
Caspase蛋白酶的激活研究表明 PMA可诱导胃腺
癌细胞 SUN216凋亡,进一步研究表明 PMA是通过
活化 PKC,活化后的 PKC再经一定的信号转导途
径激活 Caspase-3,最终导致 SUN216细胞凋亡[19]。
HaanenC[20]的研究表明,激活 PKG可诱导 Caspase
基因转录,结果导致肿瘤细胞凋亡,提示我们 PKG
也是通过激活 Caspase家族成员来介导细胞凋亡
的。PiaoZ等[21]研究发现 PKA、PKC、PKG均参与了
S2细胞凋亡的信号传导,PKA、PKC、PKG皆作用在
Caspase蛋白酶的上游,并最终激活 Caspase家族成
员导致 S2细胞凋亡。蛋白激酶对 Caspase家族成员
的活性具有双重作用,有些蛋白激酶的活化可以激
活 Caspase家族成员还有一些蛋白激酶的活化则可
抑制 Caspase家族成员的活性,进一步抑制细胞凋
亡。研究证实,PKA激活后作用于 Caspase-3的上
游,并且可抑制 Caspase-3的活性,阻止血管平滑肌
细胞凋亡[22]。进一步研究表明 PKA-RI型的激活可
抑制 Caspase家族成员的活性并阻止细胞凋亡,
PKA-RI型的活化则可激活 Caspase家族成员,进
而诱导细胞凋亡。
2.4 核酸内切酶调控
核酸内切酶是植物 PCD中核酸降解最重要的
调控者和执行者,参与这一过程的核酸内切酶主要
分为两大类,即 Zn2+依赖核酸内切酶和 Ca2+依赖核
酸内切酶。前者以 RNA、ssDNA和 dsDNA为底物,
具有 3末端酶切活性。ZENI和 BENI是 Zn2+依赖核
酸内切酶的两个典型例子,前者从鱼尾菊叶片导管
发育组织中得到分子量为 43kD,其活性与导管分
化过程中细胞自溶进程有关,后者从发育的大麦胚
乳中分离得到分子量为 35kD,可能与胚乳降解过
程中发生的 PCD有关。Mitehe和 Lam[23]报道,百口
菊分离细胞中,分子量为 43kD的核酸内切酶活性
变化与核 DAN分解一致。用 4,6-二氨基-2-苯基吲
哚(DAPI)对百日草培养细胞染色。发现细胞壁加
厚几小时后,导管前体细胞核的 DAPI荧光消失,
叶绿体中 DNA同时分解。
3 植物 PCD的信号转导分子机制
3.1 Ca2+的调控
Ca2+和钙调素作为信号分子对许多植物 PCD
起着十分重要的作用。研究发现,Ca2+的升高能直
接激活依赖钙的核酸内切酶,使之作用于 DNA,产
生 DNA降解。大豆细胞被病原菌侵染后,胞质 Ca2+
水平增加发生 PCD。钙离子通道阻断剂 La3+可阻止
病原菌诱发的大豆超敏反应(HR)。胚珠中助细胞
的消亡是典型的 PCD过程,研究发现 Ca2+参与了这
一过程。液泡破裂是许多植物 PCD过程的重要事
件,液泡膜完整性破坏是 PCD的早期表现,研究发
现液泡膜破坏也与细胞 Ca2+浓度有关。最近的研究
表明,大豆的 ScaM4和 ScaM5(钙调蛋白基因家族
成员)在烟草细胞中过量表达,可引起类 HR的反
应特征和细胞死亡。HR中 O2-.和 H2O2的聚集引起
胞 Ca2+的升高,激发一个蛋白激酶介导的细胞死亡
过程[24];花瓣衰老中的 RNase和 DNase活性受 Ca2+
促进,而被 EDTA抑制,但较高浓度的 Ca2+并不能
进一步增强核酸酶活性[25]。植物细胞在病原菌侵染
后,该粒子流向胞内和液泡,从而增加了胞内钙水
平,结果引起野炮破裂,细胞质流动变慢,并最终在
野炮崩溃前停止,这一过程可被该螯合剂和钙离子
通道阻断剂如冈田酸(OA)所抑制。当用 GA处理
谷类作物种子时,发现湖分层细胞中钙离子水平明
显提高,从而加速发生细胞死亡过程。
3.2 活性氧调控
植物被病原菌感染后,活性氧(Reactiveoxygen
species,ROS)在植物被侵染位点急剧增加,称为氧
爆发,这种氧爆发现象在对病原菌敏感或抗性的植
丁宁等:植物细胞程序性死亡分子机制和信号转导 27
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
物体内都存在。但在抗性植物体内,植物被感染后
一定时间内活性氧持续增加,并伴随超敏反应
(HR)和细胞凋亡现象[26]。另外,当植物生长的环境
条件如温度、湿度、土壤中的水分、盐浓度等发生急
剧变化,或当大气污染、紫外线辐射等,均会使植物
体内产生大量的活性氧,形成氧化损伤,在某一特
定条件下产生细胞凋亡[27]。这些比氧活泼的含氧化
合物包括:超氧阴离子(O2-)、氢氧根离子(OH-)、羟
自由基(·OH)、H2O2等[28]。许多资料表明,O2-是引
发细胞死亡的关键性活性氧,其在细胞死亡之前和
死亡区域的周围细胞中大量积累[29]。O2-在细胞死亡
之前先在某一位点积累,随后向相邻的活细胞扩
散,引起周边 HR细胞损伤。用超氧化物歧化酶处
理 TMV感染的烟草叶片能抑制 HR的发展,则进
一步证明了 O2-的清除作用[30],这与动物中巨噬细
胞通过吞噬泡中高浓度的活性氧杀死入侵细菌的
方式相似。还有研究报道,水杨酸通过抑制植物体
内过氧化物酶活性,而增加过氧化氢含量,引起细
胞死亡,因此过氧化氢含量的增加很可能是细胞凋
亡所必需的[31]。目前,人们普遍认为,ROS与植物细
胞的程序性死亡有关;在植物的 PCD过程中 ROS
可能起到三方面的作用:一是低浓度时作为信号分
子传递环境胁迫信号;二是中等浓度时能诱导细胞
发生 PCD;三是高浓度时细胞发生坏死[32]。
3.3 植物 PCD相关激素的调控
激素与植物 PCD也密切相关(图 1)发育中的
植物细胞受调控信号——激素影响产生程序性死
亡现象并伴随基因表达。在某些具体研究中,这些
植物激素作为信号也可以调控生长和分化。对
ACC氧化酶进行反义抑制或用乙烯拮抗剂处理,
均可延缓植物细胞的衰老与死亡,乙烯能促进细胞
中 Ca2+流动,而 Ca2+的变化可影响蛋白质磷酸化,
激活核酸内切酶,导致 DNA降解,因此乙烯诱导
Ca2+重新分布可能是诱发植物 PCD的机制之一。另
外,由于 GA也能刺激 PCD,乙烯和 GA的联合效应
又可被 CTK及 ABA所逆转,因此,乙烯很可能与
其他信号分子协同作用来控制 PCD发生。一氧化
氮(NO)和水杨酸(SA)亦表现类似植物激素活性,
在植物 PCD调控中均有重要作用,这一点得到许
多实验结果的支持。NO可以通过参与乙烯的释放
而诱导植物衰老。水杨酸(SA)也是植物天然的生
长调节物质之一,已有研究表明,水杨酸水解酶基
因的过量表达可抑制拟南芥的病斑模拟突变体的
细胞死亡。NO可以作为信号诱导 SA合成,而 SA
也可以激活植物 NO的合成途径。
4 植物 PCD的研究展望
综上所述,PCD伴随着植物的一生,在植物的
生长发育、形态建成及抵御不良环境伤害中都发挥
十分重要的作用。大量的研究结果证明,植物体的
各部分,如根、茎、叶、花、果等的死亡,注定会在生
活史的特定阶段发生,这对植物体有着重要的生物
学意义。植物 PCD不但是保证植物正常发育成熟
和维持正常生理过程所必需的,而且是植物的一种
重要防卫功能,在超敏反应中,必须破坏被病原体
感染的宿主细胞才能根除隐患,这是一种以牺牲少
数细胞而保存整体的重要防卫机制。近年来,有关
植物 PCD的研究逐渐增多,研究内容涉及 PCD现
象的发生、PCD的调控以及 PCD检测方法等方面,
得到了许多重要结果,但还有许多问题等待深入研
究。尤其是从分子水平搞清植物 PCD的机理,植物
细胞中与 PCD有关的基因研究还远没有动物深
入。尽管许多实验表明植物 PCD与动物是相似的,
但分子水平共同特征少,目前仅发现少数几个基因
参与植物 PCD的过程[35]。研究过程中常局限于某一
特定现象,很少有将这些现象和植物发育的具体过
程联系起来,加上植物生长周期较长,给研究带来
一定困难。植物 PCD的研究如果能与植物的经济
利用联系起来,将具有重要实践价值。某些坚果类
果树,如板栗在发育过程中大量的葇荑雄花序消耗
了树体的大量营养并影响雌花序的比例,是板栗低
产的重要原因之一。现有的研究结果表明,板栗雄
花序缩短与 PCD有关,如能发现诱导板栗雄花序
PCD发生的因子如植物激素信号、调控的关键酶
图 1 植物激素信号在调控细胞生长分化与
死亡的可能途径[34]
28
2008年第1期
等,通过人为调控,有利于减少雄花数量,提高雌花
序比例和提高板栗产量。
参考 文献
1 JonesAM.PlantPhysiol,2001,125:94~97.
2 尤瑞麟.植物学报,1985,1:346~353.
3 GreenbergJT,GuoA,KlessigDF,etal.Cel,1994,77:551~563.
4 BowenID,MorganSM,MularbyK.CelBiolInter,1993,17(1):
13~33.
5 WangYQ,CuiKM.ActaBotSin,1998,40(12):1102~1107.
6 LeistM,GanterF,Bohlimgerl,etal.JImmunol,1994,18(3):125~
130.
7 姜晓芳,朱海珍,周军,等.植物学报,1998,40(10):928~932.
8 张婧,董清华,杨凯,等.园艺学报,2007,34(3):605~608.
9 DanglJL,DietrichRA,RichbergMH.PlantCel,1996,18:1793~
1807.
10 HenselLL,GrbicV,etal.PlantCel,1993,5:553~564.
11 LohomanKN,GanSS,etal.Science,1997,267:1445~1499.
12 DrakeR,JohnI,etal.PlantMolBiol,1996,30:755~767.
13 ChenY,SlivaH,KlessingDF.Science,1993,263:183~188.
14 XuFX,ChyeML.PlantJ,1999,17(3):321~328.
15 AbramovitchRB,KimYJ,etal.EMBOJ,2003,22:60~69.
16 SolomonM,BelenghiB,etal.PlantCel,1999,2:431~443.
17 ErnstJW,ArievanderB,FrankAH.PlantPhysiol,2002,130:1764~
1769.
18 Cho-ChungYS.NewapproachestotherapyCancerRes,1990,50:
7093~7100.
19 ParkIC,ParkMJ,etal.IntJOncol,2001,18(5):1077~1083.
20 HaanenC.CurOpinInvestigDrugs,2001,2(5):677~683.
21 PiaoZ,UiTeiK,NaganoI.MolCelBiolResCommun,2001,4
(5):307~312.
22 SuzukiA,KawanoH,HayashiaM,etal.CelDeathDifer,2000,
7(8):721~728.
23 崔克明.植物学通报,2000,17(2):97~107.
24 HeathMC.PlantMolBiol,2000,44(3):321~334.
25 WuH,CheungAY.PlantMolBiol,2000,44(3):267~281.
26 DempseyDA,KlessingF.BulinstPasteur,1995,93:167~18.
27 RyersonDE,HeathMC.Plantcel,1996,8:393~402.
28 杜秀敏.生物工程学报,2001,17(2):121~125.
29 KinalH,ParkCM,BeryJO,etal.PlantCel,1995,7:677~685.
30 DokeN,OhashiY.PhysiolMolPlantPathol,1985,32:163~175.
31 ChenGH,HuangLT,YapMN,etal.PlantCelPhysiol,2002,43
(9):984~991.
32 NeilSJ,DesikanR,etal.JExpBot,2002,53:1237~
1247.
33 GunawardenaAHLAN,PearceDM,JacksonMB,etal.inrootsof
maize(ZeamaysL).Planta,2001,212:205~214.
34 HideoKuriyama,HirooFukuda.CurentOpinioninPlantBiology,
2002,5:568~573.
35 HuaZM,ChenMC,ShenMS.AdvancesonBioengineering,1998,
18(3):32~36.
DDRT-PCR技术在研究附植前胚胎基因表达中的应用
甘肃农业大学动物医学院张进隆等5位科研工作者根据哺乳动物附植前胚胎的发育受相应基因的控制,在
不同阶段(发育阶段)有不同的差异基因,他们分离并克隆此差异表达基因,以了解胚胎发育的分子机理。他们应
用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)的基本原理、特点,即一对细胞的总RNA反转录而成的cDNA模板、PCR高
效扩增、合理设计和组合,找出表达差异的cDNA片段,又根据多数真核细胞mRNA3′端具有多聚腺苷酸(polyA)
结构设计引物,3′一端有12种锚定引物(通式:5′-T11MN(M=A,C,G,N=A、C、G、T),5端有 20种 10bp长的随机引
物以后5′端引物8条,每条由13bp组成,3′引物3条,每条由16bp组成。引物变长,使cDNA扩增有效、PCR循环
参数保持了扩增效率,增加了差异条带的重复性;同时DDRT-PCR具有操作简便、周期短、灵敏度高、所需RNA量
少、重现性好,重复率达90%~95%,实验结果可靠;还有单胚差异显示技术(SPEDDRT-PCR)在研究动物特定发育
阶段表达的基因优点。对不同种类动物早期胚胎基因表达、细胞分化和胚胎干细胞的研究有进一步了解和得到广
泛地应用。 秦春圃
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丁宁等:植物细胞程序性死亡分子机制和信号转导 29