全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
高分辨率熔解曲线及其应用
李旦 1, 2 　王加启 1 　卜登攀 1 　刘开朗 1 　李珊珊 1 　赵圣国 1, 2 　于萍 1
(1 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室 ,北京 100193; 2 甘肃农业大学 ,兰州 730070)
　　摘 　要 : 　饱和荧光染料、未标记探针与实时荧光 PCR结合产生的高分辨率熔解曲线 (HRM )是一种新的实时定量技术 ,
在检测速度、灵敏度和准确性上具有突出的优点 ,近几年来在突变扫描、DNA甲基化和基因分型等医学检测中发展迅速。就
HRM的原理、应用以及在 HRM基础上发展起来的未标记探针 ( unlabled p robe) HMR、弹回探针 ( snap p robe) HMR技术作一
介绍。
关键词 : 　Real2time PCR　高分辨率熔解曲线 　未标记探针 　弹回探针
Study of High Resolution M elting and Applica tion
L i Dan1, 2 　W ang J iaqi1 　Bu Dengpan1 　L iu Kailang1 　L i Shanshan1 　Zhao Shengguo1, 2 　Yu Ping1
(1 S tate Key Laboratory of Anim al N utrition, Institu te of Anim al Science, Chinese Academ y of Agricultural Sciences,
B eijing 100193; 2 Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)
　　Abs trac t: 　H igh resolution Melting is a new real2time PCR technology, which combines saturated dyes, unlabled p robe and real2
time PCR1 The advantage of HRM is rap id detection, high sensitive and accurate1 Recently, the app lication of HRM have involved in
medical mutation scanning and genotyp ing1 The aim was to introduce the p rincip le, app lication of HRM , unlabled p robe HMR and
snap p robe HMR1
Key wo rds: 　Real2time PCR　HRM　Unlabled p robe　Snap p robe
收稿日期 : 2009201204
基金项目 :“十一五”国家奶业科技支撑计划 (2006BAD04A06, 2006BAD12B08) ,行业科技 (Nyhyzx072036)
作者简介 :李旦 (19782) ,女 ,在读博士 ,研究方向 :瘤胃微生物 ; E2mail: xjlidan@ yahoo1com1cn
　　高分辨率熔解曲线 ( high resolution melting,
HRM )是在实时荧光 PCR基础上发展起来的一种新
的实时定量新技术。由于该技术的操作与后期数据
分析简单、易懂 ,因此很快在突变扫描、基因分型、甲
基化检测与序列匹配等医学研究中受到关注并迅速
发展起来 ,高分辨率熔解曲线与快速循环 PCR结合
成为医学上 DNA诊断的最为理想的解决方法。
1　HRM 的原理
常规 Real2time PCR利用 SYBR Green染料标记
DNA双链 ,但是 SYBR Green是一种大分子即不饱
和染料 ,不能保证全部 PCR 产物都嵌合上 SYBR
Green,并且嵌合到产物中的染料如果在扩增过程中
不能及时脱落 ,还会抑制 PCR反应 [ 1 ]。HRM 采用
新型的饱和染料如 LC Green,不仅没有饱和染料的
缺点 ,而且更易于检测单碱基突变、小片段插入或缺
失 [ 2, 3 ]。目前 , LC Green家族又出现了 LC Green I
与 LC Green Plus两种新染料 [ 4, 5 ]。除了需要饱和染
料外 , HRM也要求检测仪器的高分辨率 ,一般检测
率在 011～110°C / s之间。
在利用 HRM 扩增含突变位点基因的过程中 ,
由于突变位点不匹配会导致双链 DNA在升温过程
中会先解开 ,荧光染料从局部解链的 DNA分子上释
放 ,从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在
突变位点。而且不同突变位点、杂合子与否等都会
影响熔解曲线的峰形 ,因此 , HRM分析能够有效区
分不同突变位点与不同基因型 (图 1)。
2　HRM 的应用
211　HRM在突变扫描与甲基化分析中的应用
高分辨率熔解曲线分析在封闭的体系中进行 ,
不仅降低了污染风险、节省时间 ,而且 PCR后不需
要对 PCR产物进行处理与分离 ,因此常用于序列突
变扫描和甲基化修饰检测。例如 , W illmore等 [ 6 ]利
2009年第 7期 李旦等 :高分辨率熔解曲线及其应用
A1原始的熔解曲线图 ; B1熔解曲线衍生图
图 1　高分辨率熔解曲线示意图 [ 27]
用该技术分析证明了与胃肠瘤 ( gastrointestinal stroma
tumors, GIST)相关的人类基因上第 9、11、13、17外显
子上 c2kit活性突变。Holdent等 [ 7 ]通过该技术扫描
到 12号与 18号外显子上的血小板生长因子受体α
基因突变也与 GISTs相关。Sm ith等 [ 8 ]用 HMR诊断
表皮生长因子受体 ( EGFR)突变 ,并证实肺癌病人微
细胞中的 EGFR突变发生在第 4号 EGFR外显子上。
杂合子与纯合子中的缺失、错义突变与沉默突变均可
以通过 HMR进行检测。Montgomery等 [ 9 ]通过 HMR
扫描了囊肿性纤维化跨膜调控基因 (CFTR )的 27个
外显子 ,在 96个血液捐献者中证实 22个不同序列差
异 ,这些差异包括 F508缺失与 4个异常突变。
212　HRM在基因分型中的应用
高分辨率熔解曲线能够在没有标记荧光探针的
情况下分析单个碱基的变化。假如碱基 A 突变为
碱基 C,则可能出现的基因型为 A /A、A /C与 C /C,如
果 PCR引物包括突变位点 ,那么这 3种基因型很容
易被检测到。A /A与 C /C熔解曲线具有相同的图
形 , C /C的 Tm 值约大于 A /A的 Tm 值 1℃。而 A /C
杂合子熔解曲线的图形则不同 ,并且下降温度的变化
范围略广。对于单碱基的基因型 ,杂合型很容易在曲
线峰上被检测出来。运用常规实时定量 PCR技术 ,
并不能通过 Tm 值将所有纯合体检测出来 [ 10 ]。大约
84%的人类单碱基突变中 , A∶T与 G∶C的突变导致
Tm 值仅存在 1℃的差异 ,而 HMR的 Tm 检测灵敏度
在 011～1℃之间。HMR的熔解曲线分析还可以将
21个随机配对的杂合体区分 [ 11 ]。
此外 , HMR还用于人类 (双倍染色体 )与微生物
(单倍染色体 )的基因分型。人类β2球蛋白的 HbS,
HbC与 HbE 3个基因型在 113 bp区域中 ,运用以往
的技术很难将它们区分开 , 2003年首次报道了通过
HMR可以将 β2球蛋白的 3个基因型分别检测出
来 [ 3 ]。目前 ,可以通过 HMR检测人类基因中与疾病
相关的β2球蛋白 [ 3, 4, 10 ] ,囊肿性纤维化 [ 3～5, 11 ] , V因
子 [ 5, 10 ] ,凝血素 [ 10 ] , 5, 102亚甲基 methylenetrtrahydro2
folate还原酶 [ 10, 12 ] ,与血色沉着病蛋白 [ 10, 13 ] ,血小板
抗原 [ 13, 14 ] ,乳糖分解酵素 [ 13 ] ,细胞色素 P450 2C9与
MGMT启动子区域的甲基化分型 [ 15 ]。并对微生物基
因包括 hsp65分型的 mycobacterial[ 16 ] , 16S rDNA分型
的细菌物种 [ 17 ] ,对 Salm onella[ 18 ]和 Aspergillus specia2
tion[ 19 ]引起抗对苯二酚的 gyrA突变鉴定。
213　HRM在序列差异中的应用
序列差异常用的分析方法包括单链构象多态性
( SSCP) [ 20 ]、变性梯度凝胶电泳 (DGGE) [ 21 ] ,变性高
效液相色谱 (DHPLC ) [ 22 ] ,温度梯度毛细管电泳
( TGCE) [ 23 ]和质谱分析 (MS) [ 24 ] ,这些方法都需要分
离样品 ,甚至有些需要多步骤的酶反应和化学反应 ,
使得 PCR 产物暴露在环境中 ,增加污染的风险。
HMR技术不需要对 PCR产物进行处理 ,因此就减少
了污染的机率。在医学研究的一些案例中 ,靶基因的
基因型分析与 DNA序列的完全匹配同样重要。在组
织移植中 ,需要人类白细胞抗原系统 ( human leuco2
cyte antigen, HLA)的最佳匹配 ,包括血清型与基因型
匹配 ,通常为 HLA A, B, C与 DR,这就需要找到同胞
中 HLA序列的一致性。采用 HMR证实了 HLA序列
中 HLA2A在两个个体中的等位基因中多态型最高 [25 ]。
94
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
3　HRM 新技术的介绍
311　未标记探针 HMR
碱基变化的类型、纯合子的变化、无义突变使得熔
解曲线的分析变得比较复杂。为了简化复杂性 ,在
HMR的基础上发明一种不带荧光标记的探针 ,由原来
的单一扩增产物的熔解曲线模式转变为由扩增产物与
探针两部分组成的模式。例如图 2中 ,用未标记探针
检测 V 因子 Leiden SNP 的 3 种基因型 :野生型、
R506OHet与 R506QHom[ 5 ]。未标记探针是一段 3′端被
封闭的小片段核苷酸 ,涵盖了与靶基因上的突变、缺
失、错配区域互补部分 [26 ]。虽然 HMR改进了原来熔
解曲线的精确性 ,能分辨出不同个体间的差异 ,但是在
一些分辨率较低的仪器 ,如 L ightTyper和 L ightCycler中
却不能使用 ,但熔解曲线的分析软件能够弥补这一缺
点 [ 27, 28 ]。
B未标记探针基因型图
图 2　高分辨率熔解曲线图 ( A)与 B高分辨率熔解
曲线的衍生 (导数 )图 [ 5]
312　弹回探针
弹回探针 ( snapback p rimer)是在引物末端加一
个与靶片段的突变区域互补的尾巴序列 ,反应体系
是不对称 PCR ( asymmetric PCR ) ,带有弹回探针的
引物为过剩引物 ( excess p rimer, EP) ,另一条引物为
限制引物 ( lim iting p rimer, LP)。扩增反应前几个循
环为双链扩增 , 15个循环左右后为单链扩增。熔解
曲线区域包括 PCR产物区与探针区 ,通过对探针区
的熔解曲线进行基因分型、突变等分析 (图 3 )。
Zhou[ 29 ]针对 CFTR第 10号外显子设计了 2对弹回
探针 ,采用饱和染料 LGGreen的 HMR对 100个人的
血液进行盲测 ,检测出第 10号外显子的 2个区域有
7个基因型。
过量弹回探针 ,限量引物 ,不对称 PCR,探针熔解曲线 ,扩增产物熔
解曲线 , 2dF /dT荧光信号值
图 3　弹回探针 HM R示意图 [ 29]
4　展望
高分辨率熔解曲线在基因分型、突变扫描与序
05
2009年第 7期 李旦等 :高分辨率熔解曲线及其应用
列匹配研究中非常简便 ,近几年来在医学领域中发
展迅速。饱和荧光染料的普及、未标记探针与实时
定量 PCR的结合 ,使得该技术无论在速度、灵敏度、
准确性 ,还是在经济上都很符合检测要求。高分辨
率熔解曲线技术不仅将在医学领域被广泛应用 ,还
会广泛应用于动物基因检测、植物病理、微生物分型
和食品安全检测等方面。
参 考 文 献
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2　 Graham R, L iew M, Meadows C, Lyon E, W ittwer CT1 Clin Chem,
2005, 51: 1295～12981
3　 W ittwer CT, Reed GH, Gundry CN, et al1Clin Chem, 2003, 49:
853～8601
4　 Gundry CN, Vandersteen JG, Reed GH, et al1Clin Chem, 2003,
49: 396～4061
5　 Zhou L,W ang L, Palais R, et al1Clin Chem, 2005, 51: 1770～17771
6　 W illmore C, Holden JA, Zhou L, et al1Am J Clin Pathol, 2004,
122: 206～2161
7　 Holden JA, W illmore2Payne C, Coppola D, Garrett CR, Layfield
LJ1 Am J Clin Pathol, 2007, 128: 230～2381
8　 Sm ith GD, Chadwick BE, W illmore2Payne C, Bentz JS1 J Clin
Pathol, 2007, 61: 487～4931
9　 Montgomery J, W ittwer CT, Kent JO, Zhou L1 Clin Chem, 2007,
53: 1891～18981
10　L iew M, Pryor R, Palais R1 Clin Chem, 2004, 50: 1156～11641
11　Chou LS,Lyon E,W ittwer CT1Am J Clin Pathol, 2005, 124: 330～3381
12　Seipp MT, Durtschi JD, L iew MA 1 J Mol D iagn, 2007, ( Epub a2
head of p rint) 1
13　Palais RA, L iew MA, W ittwer CT1 Anal B iochem, 2005, 346: 167
～1751
14　L iew M, Nelson L, Margraf R1 J Mol D iagn, 2006, 8: 97～1041
15　Wojdacz TK, Dobrovic A1 Nucleic Acids Res, 2007, 35: 1～71
16　Odell ID, Cloud JL, Seipp M, W ittwer CT1 Am J Clin Pathol,
2005, 123: 96～1011
17　Odell ID, Cloud JL, Seipp M, W ittwer CT1 Am J Clin Pathol,
2005, 123: 96～1011
18　Slinger R, Bellfoy D, DesjardinsM, Chan F1 M icrobiol Infect D is,
2007, 57: 455～4581
19　EraliM, Pounder J I,Woods GL, et al1Clin Chem, 2006, 52: 1443～14451
20　O rita M, Iwahana H, Kanazawa H, et al1Proc Natl Acad Sci, 1989,
86: 2766～27701
21　Lerman LS, Silverstein K1Methods Enzymol, 1987, 155: 482～5011
22　Xiao W , Oefner PJ1Hum Mutat, 2001, 17: 439～4741
23　L i Q, L iu Z, Monroe H, Culiat CT1 Electrophoresis, 2002, 23:
1499～15111
24　Bocker S1 B ioinformatics, 2007, 23: 5～121
25　Zhou L,Vandersteen J,WangL1Tissue Antigens, 2004, 64: 156～1641
26　Margraf RL,Mao R,W ittwer CT1Hum Mutat, 2006, 27: 269～2781
27　EraliM, Palais B , W ittwer C1 SNP Genotyp ing by Unlabeled Probe
Melting Analysis1 In: Molecular Beacons2Signaling Nucleic Acid
Probes1 Seitz O, Marx A ( Eds) 1 Totowa, NJ, USA: Humana
Press, 2007, 199～2061
28　Poulson MD, W ittwer CT1 B iotechniques, 2007, 43: 87～911
29　Zhou L, Errigo RJ,Lu H, et al1Clin Chem, 2008, 54 (10) : 1648～16561
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学与材料科学的交叉 (翻译版 )
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