全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（8）：1601–1606 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–05–12；修回日期：2011–07–11
基金项目：山东省自然科学基金项目（Y2008D51）；山东省良种工程项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chwang@qau.edu.cn）
利用高分辨率熔解曲线（HRM）分析梨微卫星
标记
殷 豪，王彩虹*，田义轲，李节法，王 然，戴洪义
（青岛农业大学园林园艺学院，山东青岛 266109）
摘 要：以西洋梨（Pyrus communis L.）‘Nain Vert’的一个矮生型实生系与‘茌梨’（Pyrus bretschneideri
Rehd.）的 F1 杂交群体为试材，对分别源自梨和苹果基因组的 4 个微卫星（即 SSRs）序列多态性进行了
高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）分析。结果显示，在测试群体中，TsuENH042 和 Hi15a13
存在两种分型，TsuENH081 存在 3 种分型，而 Hi08d09 只有 1 种类型。因此，HRM 分析技术可以作为筛
查果树微卫星标记多态性或对其进行基因分型的有效手段在相关研究中加以应用。
关键词：梨；高分辨率熔解曲线（HRM）；微卫星
中图分类号：S 661.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）08-1601-06

Differentiation of Microsatellites in Pear by High Resolution Melting（HRM）
Analysis
YIN Hao，WANG Cai-hong*，TIAN Yi-ke，LI Jie-fa，WANG Ran，and DAI Hong-yi
（College of Landscape and Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qindao，Shandong 266109，China）
Abstract：The polymorphism of four microsatellites（i. e. SSRs）originated from pear or apple
genome，respectively，were tested by high resolution melting（HRM）in the F1 progenies produced by
crossing a dwarf seedling of the European pear（Pyrus communis L.）cultivar‘Nain Vert’with‘Chili’
（Pyrus bretschneideri Rehd.） . The results revealed that there were two genotypes for each of
TsuENH042 and Hi15a13，three genotypes for TsuENH081 and one genotype for Hi08d09 in the testing
population. The results indicated that HRM technique can be used as an effective methodology in fruits
researches for polymorphism detecting or genotype differentiation of microsatellites.
Key words：pear；high resolution melting；microsatellite

高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting analysis，HRM）是国际上近年来发展的一种新
型的检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）及扫描突变的新技术。HRM 无需
使用序列特异性探针，而是利用一种饱和染料对 PCR 反应产物进行分析（Wittwer et al.，2003）。
HRM 的基本原理：双链核苷酸（double strand DNA，dsDNA）的热稳定性受其长度和碱基组成的影
响，序列变化会导致升温过程中 dsDNA 解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到
dsDNA 上，因此利用实时 PCR 技术，通过实时检测 dsDNA 熔解过程中荧光信号值的变化，就能以

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生成不同形状熔解曲线的方式将 PCR 产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分
析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。目前用于 HRM 分析的饱
和型荧光染料主要有 LCGreen I、LCGreen plus、Syto9、EvaGreen 等，这类染料一般不抑制扩增酶
的活性，所以不影响 PCR，在高浓度下可使样品 dsDNA 呈饱和状态。因此，在后续的熔解实验过
程中，即使单一核苷酸的差异也可以导致熔解曲线形状的变化。它的这一特征是实时 PCR 所用的传
统染料（如 SYBR Green I）所不具备的（Mackay et al.，2008；陈斌 等，2009）。
相对于其它基于 PCR 的 DNA 多态性检测技术如单链构象多态性（single strand conformation
polymorphism，SSCP）、变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography，
dHPLC）、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）等，HRM 的优势在于
操作简单，分析时间短，灵敏度和特异性高，PCR 产物无需后处理（如酶切、电泳等），可实现真
正的闭管操作从而降低污染风险。另外 HRM 具有高通量的特点，非常适合大量样品的分析。因此
HRM 检测方法备受关注（Graham et al.，2005；谭昌渊 等，2009），并已发展成为 SNP 基因分型、
点突变筛查等（Liew et al.，2004；Lehmensiek et al.，2008；Ujino-Ihara et al.，2010）的重要手段。
在农作物上近期已有关于 HRM 的少量报道（Dong et al.，2009；Hofinger et al.，2009；Li et al.，
2011）。在苹果和扁桃上已分别用 HRM 实现了对大量基于表达序列（expressed sequence tag，EST）
的 SNP 标记的分型分析（Chagné et al.，2008；Wu et al.，2008），最近又见在扁桃上用 HRM 技术
对 SNP 标记锚定的多个功能基因进行群体分型及遗传图谱定位的研究报道（Wu et al.，2009，2010）。
微卫星标记（即 SSR）是目前果树基因组分子标记研究的重要形式。但是以往以电泳为基础的
SSR 标记检测方法一般程序复杂且耗时长。如果能将 HRM 技术用于 SSR 标记的分析，无疑会大大
地提高工作效率。目前，除 Mackay 等（2008）在葡萄和橄榄，Chagné 等（2008）在苹果以及 Wu
等（2008）在扁桃上的 SSR-HRM 分析外，在其它果树上尚无关于此项技术的报道。本研究中以来
自梨杂交群体的部分实生个体为试材，对利用 HRM 进行 SSR 标记分析的方法及效果进行探讨，目
的是为将此项技术用于梨和其它果树 SSR 标记的多态性检测或快速分型研究提供依据。
1 材料与方法
西洋梨（Pyrus communis L.）矮生型品种‘Nain Vert’的种子是 1992 年从英国东茂林果树实验
站引入，播种后获得了一个具有母本矮生性状的实生系。分析样本为此实生系与中国梨品种‘茌梨’
（Pyrus bretschneideri Rehd.）杂交获得的 24 个 F1 实生后代，种植在青岛农业大学莱阳果树实验站。
于 2010 年 4 月初取春季萌动的幼芽 0.1 g，分离基因组 DNA（田义轲 等，2003）。用紫外分光
光度计（Ultrospec 3300 pro，Amersham Biosciences）测定 DNA 的 OD 值，检测 DNA 的质量并进行
定量，然后将 DNA 稀释至 5 ng · μL-1。测试的微卫星为 TsuENH042、TsuENH081、Hi15a13 和 Hi08d09，
前二者源自梨基因组（Celton et al.，2009），后二者源自苹果基因组（Silfverberg-Dilworth et al.，2006）。
PCR 扩增和高通量熔解曲线分析在 LightCycler® 480 II 荧光定量 PCR 仪（Roche）上进行，采
用 96 孔反应模块。反应试剂来自 LightCycler® 480 High Resolution Melting Master 试剂盒，反应体
系为 10 μL，内含 10 ng 基因组 DNA，1 × Master Mix，2.0 mmol · L-1 MgCl2，引物浓度为 0.2 μmol · L-1。
PCR 扩增采用降落（touchdown）模式：95 ℃预变性 10 min，然后按 95 ℃变性 10 s，55 ~ 50 ℃
退火（每循环下降 0.5 ℃）15 s，72 ℃延伸 12 s 的程序进行 45 个循环。扩增产物的熔解步骤在 PCR
循环结束后立即进行，程序为：升温至 95 ℃ 1 min，然后降温至 40 ℃ 1 min，再升温至 65 ℃ 1 s。
从 65 ℃连续升温至 95 ℃的过程中进行荧光收集（25 次/℃）。最后，降温至 40 ℃。
高分辨率熔解曲线分析用 LightCycler® 480 的 Gene Scanning 软件（1.5 version）进行。
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2 结果与分析
2.1 来自梨基因组的微卫星标记在梨 F1 群体的 HRM 分型
以来自梨基因组的两个微卫星标记 TsuENH042 和 TsuENH081 为例，用 HRM 分析技术对来自
同一组合的杂种群体上的分型效果进行了测试。SSR-HRM 分析结果见图 1。
对于 TsuENH042 位点来说，HRM 分析结果显示了两种不同形状的熔解曲线，分别为红色曲线
组和蓝色曲线组（图 1，A1），即揭示了在所分析的杂种群体中该 SSR 位点有两种分型。其中红色
曲线组包含 10 个杂种，蓝色曲线组含 14 个杂种。

图 1 来自梨基因组的微卫星 TsuENH042 和 TsuENH081 在‘Nain Vert’（Pyrus communis L.）矮生实生系与‘茌梨’
（Pyrus bretschneideri Rehd.）杂种群体中多态性的 HRM 检测结果
A1、A2：分别为 TsuENH042 和 TsuENH081 的标准化的随温度变化的熔解曲线图；B1、B2：分别为 A1、A2 的派生图；A1、B1 中的红、
蓝曲线分别代表 TsuENH042 的两种分型；A2、B2 中的红、绿、蓝曲线分别代表 TsuENH081 的 3 种分型；图中显示的测试杂种为 24 个。
Fig. 1 Detection of polymorphism of microsatellite TsuENH042 and TsuENH081 originated from pear in the progenies produced from the
cross of a dwarf seedling of‘Nain Vert’（Pyrus communis L.）with ‘Chili’（Pyrus bretschneideri Rehd.）
A1，A2：Normalized and shifted melting curve of TsuENH042 and TsuENH081，respectively. B1，B2：Normalized and temp-shifted difference plot
of A1 and A2，respectively. The red and blue curves displayed in A1 and B1 indicate 2 genotypes of TsuENH042，respectively. The red，green and
blue curves displayed in A2 and B2 indicate 3 genotype of TsuENH081，respectively. Twenty-four progenies were showed.
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对于 TsuENH081 位点来说，在相同的群体中检测出了 3 种分型，即由红、绿、蓝 3 种颜色显示
的不同形状的熔解曲线（图 1，A2），分别包含杂种 8 个、3 个和 13 个。分型间的差异视图除可以
通过标准化的随温度变化的熔解曲线（即 normalized and shifted melting curve）形式来展示外（图 1，
A1、A2）（温度相同），也可用其派生的曲线形式（即 normalized and temp-shifted difference plot）来
表示（图 1，B1、B2）（以同一样品为基线，与其它样品相对荧光值的差值为纵坐标而生成的）。尽
管从前者的形状变化可以明显地看出组型的差异，但其派生的图形可以使这种差异放大，从而更方
便组型间的鉴别。
2.2 来自苹果基因组的微卫星标记在梨 F1 群体的 HRM 分型
由于微卫星标记在梨和苹果基因组中具有高度的保守性，本研究中也测试了源自苹果基因组的
Hi15a13 和 Hi08d09 在此梨杂种群体上的 HRM 分型效果。结果表明，Hi15a13 扩增子的熔解曲线呈
现两种显著不同的形状，即对应两种分型（图 2，A1），从其派生图（图 2，B1）中也可以看到这两
种分型的明显差异；而 Hi08d09 在所分析的所有样本上扩增子的熔解曲线形状一致（图 2，A2），其
派生图（图 2，B2）上也没有可识别的变化模式，即不能进行适当的分组或归类，说明所有扩增子
序列相同，没有多态性差异。
3 讨论
传统的 SSR 检测方法是在 PCR 反应结束后，对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳或高浓度琼
脂糖凝胶电泳。这类方法耗时费力，效率低。后来发展为可以通过毛细管电泳的方法在自动分析仪
上完成，极大提高了工作效率，但在电泳前仍然要求进行 PCR 产物的后续处理（如脱盐）。SSR 的
PCR 扩增产物也可以在自动测序仪上进行电泳分析，但要求 PCR 后续处理，另外 PCR 所用引物需
要分别进行荧光标记。相对来说，这些方法在时间和成本的投入上较高。所以，寻求操作简单、高
效的 SSR 标记检测方法具有重要意义。
HRM 分析具有快速、闭管操作、PCR 反应和熔解曲线生成在同一系统中同时完成的特点。在
LightCycler®480 分析仪上一次就可以完成对 96 个或 348 个样本的分析，从反应开始到数据生成仅
需 90 ~ 100 min。通常 HRM 分析的核酸片段大小不应超过 300 bp，200 bp 以内的片段分析效果最佳，
大于 300 bp 的片段往往难以用此方法获得准确的检测结果（Reed & Wittwer，2004；Hofinger et al.，
2009）。一般来说，从植物基因组中开发的 SSR 标记扩增片段大小在 100 ~ 300 bp，此范围适合于进
行 HRM 分析。因此，在不需要了解序列的详细信息的情况下，HRM 可以作为快速检测 SSR 标记
多态性的选择手段加以应用。最近，在水稻上的研究表明，PCR 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测与
HRM 分析结果间有很好的吻合性（Li et al.，2011）。在本研究中，发现这两种办法的分析结果完全
符合。除了在葡萄、橄榄、苹果和扁桃上的报道（Chagné et al.，2008；Mackay et al.，2008；Wu et
al.，2008）外，本试验在梨上的研究结果又一次证明了 HRM 作为果树 SSR 标记分型手段的有效性。
植物遗传作图往往涉及的群体样本数量大，缺乏高效的 SSR 标记检测方法已成为影响作图效率
的主要问题。如果将 SSR/HRM 方法用于遗传图谱构建，将大大提高此项工作的效率（Li et al.，2011）。
但在本试验中发现，对于某些 SSR，扩增产物生成的熔解曲线复杂，无法进行有效的归类，究其原
因可能是 PCR 扩增子类型复杂，除了 SSR 重复位点外，在序列的其它位置也可能存在一些差异，
或者是所采用的退火温度不合适而导致了一些非特异性片段的扩增，关于这一问题，还需要进一步
的研究。另外，如果是将 SSR 标记用于遗传作图研究，就要同时考虑亲本的表现。因此，HRM 虽
可作为 SSR 标记群体快速分型的一种手段，但此方法并非适用所有 SSR 标记的遗传作图分析。
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目前，SSR/HRM 分析需要借助于昂贵的荧光定量 PCR 仪来完成。但总体来看，HRM 不失为
一种简单、快速、低成本和高通量的 SSR 标记分析手段，可在果树的基因组相关研究中发挥重要作
用。


图 2 来自苹果基因组的微卫星 Hi15a13 和 Hi08d09 在‘Nain Vert‘（Pyrus communis L.）矮生实生系与‘茌梨’
（Pyrus bretschneideri Rehd.）杂种群体中多态性的 HRM 检测结果
A1、A2：分别为 Hi15a13 和 Hi08d09 的标准化的随温度变化的熔解曲线图；B1、B2：分别为 A1、A2 的派生图；
A1、B1 中的红、蓝曲线分别代表 Hi15a13 的两种分型；A2、B2 中的蓝色曲线代表 Hi08d09 仅有 1 种类型；
图中显示的测试杂种为 11 个。
Fig. 2 Detection of polymorphism of microsatellite HI15a13 and HI08d09 originated from apple in the progenies produced from
the cross of a dwarf seedling of‘Nain Vert’（Pyrus communis L.）with‘Chili’（Pyrus bretschneideri Rehd.）
A1，A2：Normalized and shifted melting curve of Hi15a13 and Hi08d09，respectively. B1，B2：Normalized and temp-shifted difference plot of
A1 and A2，respectively. The red and blue curves displayed in A1 and B1 indicate 2 genotypes of Hi15a13，respectively.
The blue curves displayed in A2 and B2 indicate the only one genotype of Hi08d09.
Eleven progenies were showed.


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