全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):76-83
基因突变已成为当今生命科学研究的热点之
一，其检测方法也随之迅速发展，变性高效液相色
谱分析，单链构象异构多态分析技术，毛细管电泳，
直接测序，变性梯度凝胶电泳与化学或酶促裂解等
突变检测方法中，酶错配切割（ Enzyme mismatch
cleavage，EMC）方法临床应用简单，具有一定的优
越性。酶错配切割的原理为利用错配分辨酶识别错
配，插入和缺失切割错配的 DNA，异源双链 DNA
被识别错配的核酸酶识别并切割成 DNA 片段［1］，
正常 DNA 和突变 DNA 在一起通过聚合酶链反应
收稿日期 ：2015-05-15
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31360276），兵团院士资金专项（2007JC19），兵团国际合作项目（2013BC004），新疆兵团绵羊繁育生
物技术重点实验室项目（2013KLS01），优质转基因肉羊新品种培育项目（2013ZX08008-003）
作者简介 ：李炜杰，女，硕士，研究方向 ：动物临床疾病 ；E-mail ：jie03945879198@163.com
通讯作者 ：皮文辉，男，研究员，研究方向 ：动物遗传育种，E-mail ：wzjpwh@163.com ；周平，男，研究员，研究方向 ：绵羊遗传育种，
E-mail ：zhpxqf@163.com
三种检测内源性基因修饰方法比较
李炜杰1，2  杨娇2  何高明2  王立民1  皮文辉1  周平1
（1. 新疆生产建设兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，石河子 832000 ；2. 石河子大学动物科技学院，石河子 832003）
摘 要 ： 为获得准确的突变信息，除直接测序外，实验初步确定了 3 种人工核酸酶生物学活性检测方法。利用 Surveyor
nuclease、T7E1（T7 Endonuclease 1）和 HRM（High resolution melt），均以变性退火突变型和野生型 DNA 序列形成扭曲的双螺旋
DNA（distorted duplex DNA）为基础的 3 种人工核酸酶生物学活性检测方法，确定目标位点是否发生突变。实验成功检测出作用于
绵羊 MNST 基因第一外显子的 CRISPR/Cas9 和第三外显子的 TALEN 目标位点发生突变，并对 3 种检测方法的结果和特点进行了分
析比较，得出 3 种检测方法的优缺点，为实验室分析确定细胞利用非同源末端连接修复 DNA 双链断裂结果提供参考。
关键词 ： 基因组编辑 ；Surveyor 核酸酶 ；T7 Endonuclease I ；高分辨率熔解曲线（HRM）
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.010
The Comparison of Three Methods of Monitoring Endogenous Gene
Modification
LI Wei-jie1，2 YANG Jiao2 HE Gao-ming2 WANG Li-min1 PI Wen-hui1 ZHOU Ping1
（1. Key Laboratory of Sheep Breeding and Development Technology of Xinjiang Production and Construction Corps，Shihezi 832000 ；
2. College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003）
Abstract: In order to obtain accurate mutation information, 3 methods of monitoring the biological activities of artificial nuclease are
preliminary determined excluding direct sequencing. The 3 methods of Surveyor nuclease, T7E1（T7 Endonuclease 1）and HRM（High
resolution melting）are all based on the principle of forming the twisted duplex DNA from denaturized annealing mutant and wild type DNA
sequence, and whether or not target sites were mutated were determined. The results showed that using the 3 detection methods, the mutations
at the target sites of exon 1s CRISPR/Cas9 and exon 3s TALEN in ovine gene MNST were successfully detected. Analyzing and comparing the
results and characteristics of the 3 methods, the advantages and disadvantages of them were obtained, which provided a reference for the analysis
and identification of results while the cells uses non-homologous ends to join and repair DNA double strand breaks. In conclusion, the results by
Surveyor, T7E1 and HRM show that CRISPR/Cas9 and TALEN’s target sites are mutated.
Key words: genome editing ；surveyor nuclease ；T7 Endonuclease I ；high resolution melting（HRM）
2016,32(2) 77李炜杰等：三种检测内源性基因修饰方法比较
（PCR） 变 形 后 再 缓 慢 复 性， 同 时 形 成 同 源 双 链
（Homoduplex，HO） 和 异 源 双 链（Heteroduplex，
HE）。EMC 中 Surveyor 核酸酶是 CELI 家族成员，对
DNA 错配部位有高度特异性，识别异源双链 DNA
中的错配碱基的位置并在错配扭曲链两端的 3 处
切断，能准确切割异源双链 DNA 错配位点［2］；T7
Endonuclease I（T7EI）作用于双链 DNA，沿 5 → 3
方向催化去除 5 单核苷酸，它既能从 5 末端起始消
化，也能从双链 DNA 的切刻或缺口处起始消化异源
双链 DNA 序列［3］。高分辨率熔解曲线分析技术（High
resolution melting，HRM）是近年来兴起的一种检测
基因突变、进行基因分型和 SNP 检测的新工具，可
以迅速检测出核酸片段中单碱基的突变［4］。HRM 技
术自 2002 年应用于基因分型、突变扫描、序列匹配
检测以来，受到了高度重视并快速发展。HRM 技术
因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，
对样品无污染等优点而被迅速应用在生命科学、医
学、农学及畜牧业等领域的研究工作中［5，6］。
三种检测方法都以变性退火突变和野生型 DNA
序 列， 形 成 扭 曲 的 双 螺 旋 DNA（Distorted duplex
DNA）为基础。Surveyor nuclease 和 T7EI 利用核酸
内切酶特异性切割扭曲的双螺旋 DNA，经电泳显示
的 DNA 条带图谱，确定是否产生突变。并根据酶切
电泳获得 DNA 条带的光密度值，计算确定突变和野
生型 DNA 序列的比率。HRM 法是利用扭曲的双螺
旋 DNA 影响饱和染料结合量，荧光信号经高灵敏度
信号仪收集后，通过检测荧光信号变化，绘制溶解
曲线，通过熔解曲线变化，确定是否存在突变型基
因。实验采用 3 种人工核酸酶生物学活性检测方法
确定目标位点是否发生突变（图 1），通过比较分析
得出 3 种检测方法的优缺点，旨在为实验室分析确
定细胞利用非同源末端连接修复 DNA 双链断裂结果
提供参考。
图 1 三种检测内源性基因修饰方法的示意图
LightCyclerᇎᰦ㦗ݹᇊ䟿PCRᒦ䘋㹼ケਈᢛ᧿ˈ޽֯⭘สഐ࠶᷀䖟Ԧᆼᡀ࠶᷀
PCRᢙ໎ⴞḷս⛩
PCRӗ⢙㓟ॆਈᙗ઼䘰⚛ ᔲⓀৼ⹵Ⲵᖒᡀ
ᔲⓀৼ⹵࠷ᔰ
ᵚ࠷ᔰᶑᑖ࠷ᔰᶑᑖ
PAGE䢤ᇊSurveyor઼T7E1⎸ॆ༴⨶
T7EISurveyor
HRM PCR価઼ḃᯉケਈⲴৼ⹵DNAо価઼ḃᯉ㔃ਸ˖ᴹケਈս⛩DNAо価઼ḃᯉ㔃ਸ˖
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.278
1 材料与方法
1.1 材料
Surveyor nuclease 试剂盒（SURVEYOR Mutation
Detection For Standard GelElectrophroesis），TRANSG-
ENOMI 公司 ；T7EI 试剂盒，New England Biolabs 公
司；LightCycler®480High Resolution Melting Master，Ro-
che 公司 ；QuickExtract DNA Extraction solutio1.0（基
因组 DNA 快速抽提液），Epicentre 公司 ；Nanophot-
ometer 微量分光光度计，德国 Implen 公司 ；100 bp
DNA Marker，北京全式金生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 Cas9 和 TALEN 作 用 靶 点 确 定 实 验 设 计
Cas9 作用于 MSTN 基因第一外显子，TALEN 作用于
MSTN 基因第三外显子。Cas9 和 TALENs 质粒由广
州复能基因有限公司合成（图 2）。
1.2.2 萨福克绵羊成纤维细胞电转染及细胞基因组
图 2 Cas9（A）和 TALEN（B）作用位点及 Surveyor、T7E1 酶切、HRM 引物序列
acagatcccgacgacacttgtctcatcaaagttggaatataaaaagccacttggaatacagtataaaagattcactggtgtggcaagttgtctctcagac
tgggcaggcattaacgtttggcttggcgttactcaaaagcaaaagaaaagtaaaaggaagcagtaagagctaaggaaaaagattgtattgattttaaaa
ccatgcaaaaactgcaaatctttgtttatatttacctatttatgctgcttgttgctggcccagtggatctgaatgagaacagcgagcagaaggaaaatgt
ggaaaaaaaggggctgtgtaatgcatgcttgtggagacaaaacaataaatcctcaagactagaagccataaaaatccaaatcctcagtaagcttcgcc
tggaaacagctcctaacatcagcaaagatgctataagacaacttttgcccaaggctcctccactccgggaactgattgatcagtacgatgtccagaga
gatgacagcagcgacggctccttggaagacgatgactaccacgttacgacggaaacggtcattaccatgcccacggagtg
(242+313 575 bp) лࡂ㓯䜘࠶ѪsurveyorǃT7E1䞦࠷Ⲵᕅ⢙ˈ䱤ᖡ䜘࠶ѪHRMⲴᕅ⢙ˈᯩṶ䜘࠶ѪCas9Ⲵⴞḷս⛩
cggtaggagagtgtttggggatctattactaactcttctttcctttccatacagaatccttttttagaagtcaaggtaacagacacaccaaaaagatctagg
agagattttgggcttgattgtgatgagcactccacagaatctcgatgctgtcgttaccctctaactgtggattttgaagcttttggatgggattggattattg
cacctaaaagatataaggccaattactgctctggagaatgtgaatttttatttttgcaaaagtatcctcatacccatcttgtgcaccaagcaaacccc
aaaggttcagccggcccttgctgtactcctacaaagatgtctccaattaatatgctatattttaatggcaaagaacaaataatatatgggaagattccagg
catggtagtagatcgctgtgggtgctcatgagatttatatttggttcatagcttcctaaaacacagaaggtcttcccctcaacaattttgaaactgtgaaatt
atgtaccacgggctataagcctaga
(238+277 532 bp) অࡂ㓯䜘࠶ѪSurveyorǃT7E1䞦ᕅ⢙ᒿࡇˈ䱤ᖡ䜘࠶ѪHRMⲴᕅ⢙ᒿࡇˈᯩṶ䜘࠶ѪTALENⲴᐖਣ㟲ˈৼࡂ㓯䜘࠶TALENⲴⴞḷս⛩
A
B
获得 将萨福克绵羊成纤维细胞电转染，采用自己
配制的电转液 100 μL，CZ-167 电转程序，质粒总浓
度 4 μg，2×106 个细胞，电击后 37℃静置 10 min，
加到 6 孔板内培养，电转 3 组细胞 ：Cas9 质粒作
用于 MSTN 基因第一外显子 ；TALEN 质粒作用于
MSTN 基因第三外显子 ；Pmax 绿色荧光蛋白表达质
粒作用对照组细胞。培养电转染细胞 72 h，收集实
验组及对照组细胞。QuickExtract DNA 提取液裂解
细胞提取细胞基因组，68℃ 15 min ；95℃ 8 min 处
理细胞裂解液，-20℃保存备用。
1.2.3 引物设计 通过 NCBI 查找绵羊 MSTN 基因
全序列（Sequence ID ： gb|DQ530260.1|），设计 MSTN
第一和第三外显子 Surveyor 核酸酶、T7E1 和 HRM
检 测 基 因 突 变 的 PCR 引 物（Surveyor nuclease 和
T7E1 引物为 SVF/R，HRM 引物为 HRMF/R）（表 1）。
表 1 引物序列
引物名称 引物序列（5-3）
MSTNE1-SVF ACAGATCCCGACGACACTTG
MSTNE1-SVR CACTCCGTGGGCATGGTAAT
MSTNE3-SVF CGGTAGGAGAGTGTTTGGGG
MSTNE3-SVR TCTAGGCTTATAGCCCGTGGT
MSTNE1-HRMF CGTTTGGCTTGGCGTTACTC
MSTNE1-HRMR CACATTTTCCTTCTGCTCGCT
MSTNE3-HRMF CGATGCTGTCGTTACCCTCT
MSTNE3-HRMR ACCTTTGGGGTTTGCTTGGT
1.2.4 Cas9 和 TALEN 靶 点 周 边 DNA 序 列 扩 增 及
纯化 Surveyor 核酸酶和 T7EI 酶切分析的 PCR 产
物需要高保真热启动酶扩增，保证扩增片段的特
异 性。TALEN 和 Cas9 靶 点 周 边 序 列 PCR 扩 增 反
应体系（表 2）。PCR 反应程序 ：95℃ 3 min ；95℃
20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s， 共 35 个 循 环 ；72℃ 5
2016,32(2) 79李炜杰等：三种检测内源性基因修饰方法比较
min ；4℃保存。琼脂糖凝胶纯化 PCR 扩增产物，使
用 Nanopho-tometer 微量分光光度计测胶回收产物
浓度。
表 2 TALEN 和 Cas9 靶点周边序列扩增
组分 体积 /μL
Herculase II reaction buffer，5× 10
dNTP，100 mmol/L（25 mmol/L each） 0.5
上游引物 10 μmol/L 1
下游引物 10 μmol/L 1
电转细胞基因组 DNA 1
Herculase II fusion polymerase 0.5
ddH2O 36
Total 50
1.2.5 Surveyor 核酸酶酶切 PCR 纯化产物 由于非
同源末端连接（NHEJ）修复机制，经 TALEN，Cas9
修饰的基因组 DNA 在 TALEN，Cas9 靶位点附近的
几个碱基序列发生突变。对于 Surveyor 和 T7EI 错
配检测，首先对 PCR 扩增产物再一次变性和退火以
形成 DNA 异源双链。由于样品中同时存在 TALEN，
Cas9 修饰以及未修饰的 DNA，异源双链中可能包括
TALEN，Cas9 修饰过的 DNA 的一条链和未修饰的
DNA 的一条链，也有可能由两个不同的经 TALEN，
CAS9 修饰过的 DNA 再退火形成。变性 DNA 双链
经缓慢退火复性形成异源双链。使用 400 ng 纯化
的 PCR 产物退火处理。PCR 产物退火体系 20 μL ：
Herculase II reaction buffer，5×4 μL；PCR 纯化产物 ×
（400 ng）；ddH2O 补加到 20 μL。样品混匀、离心后，
进行退火处理。使用以下程序（表 3）进行退火反应。
为了确定 CRISPR/Cas9 和 TALEN 的切割效率，
用 Surveyor 核酸酶 S 处理交叉杂交形成的异源双链
和 同 源 双 链。Surveyor 核 酸 酶 S 消 化 体 系 20 μL ：
MgCl2 solution，0.15 mol/L 2 μL ；Surveyor nuclease S
1 μL ；Surveyor enhancer S 1 μL ；退火产物 16 μL。将
PCR 管放在 42℃水浴锅恒温孵育 1 h，然后加入 2
μL Stop solution 终止消化，储存于 -20℃冰箱备用。
1.2.6 T7EI 处 理 PCR 胶 回 收 产 物 400 ng 纯 化 的
PCR 产物退火处理，样品添加同 1.2.5。T7EI 核酸
酶消化退火产物样品混匀、离心后，进行退火处理
同表 4。T7EI 核酸酶处理 PCR 纯化产物 20 μL ：T7
Endonuclease 0.5 μL ；NEBuffer 2 10×0.2 μL ；ddH2O
1.3 μL ；退火产物 18 μL。样品混匀离心后，将 PCR
管放在 37℃水浴锅恒温孵育 1 h，-20℃冰箱备用。
1.2.7 PAGE 检 测 Surveyor nuclease 和 T7EI 酶 的 消
化结果 8% 的 PAGE 检测 Surveyor 核酸酶 S 和 T7EI
消 化 退 火 产 物 Cas9 和 TALEN 切 割 效 果。Surveyor
核酸酶 S 消化产物加 6×Loading buffer 4 μL 上样即
可，T7EI 核酸酶消化产物需要添加 EDTA，使其终
浓度为 45 mmol/L，也可以通过添加 6.94 μL 的混合
物 ：0.5 mol/L 的 EDTA 与 6×xylene cyanol loading
dye 比例 2.45∶4.49［7］。酶切结果使用 quantity one
定量软件分析。
表 4 HRM 的反应体系
Component Volume/μL Final Concentration
Master Mix 2× conc.
（vial 1，green cap）
10.0 1×conc.
Primer mix 20×conc.
（4 μmol/L）
1.0 0.2 μmol/L（each primer）
MgCl2 25 mmol/L
（vial 1，blue cap）
2.0
Water PCR-grade
（vial 3，colorless cap）
6.5
电转细胞基因组 DNA 0.5
Total volume 20
1.2.8 HRM 检测 根据 DNA 序列的长度，GC 含量
以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对
表 3 DNA 异源双链形成反应程序
循环 反应条件
1 95℃，10 min
2 95-85℃，-2℃/S
3 85℃，1 min
4 85-75℃，-0.3℃/S
5 75℃，1 min
6 75-65℃，-0.3℃/S
7 65℃，1 min
8 65-55℃，-0.3℃/S
9 55℃，1 min
10 55-45℃，-0.3℃/S
11 45℃，1 min
12 45-35℃，-0.3℃/S
13 35℃，1 min
14 35-25℃，-0.3℃/S
15 25℃，1 min
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.280
样品进行分析，其分辨精度可以达到对单个碱基差
异的区分［8］。HRM 利用特定的染料可以插入 DNA
双链中的特性，从而对样品进行检测。基于这种检
测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，
既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知
突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，
所需要的只是在常规 PCR 基础上增加一个饱和染料，
常规 PCR 后不需电泳等后处理。
按照 LightCycler®480High Resolution Melting Mas-
ter 说明书要求每个样品 3 份，每份 20 μL 体系（表 4）
混匀后加到 96 孔板内，LightCycler®480 II 型仪器设
定相应 PCR 反应程序，结果使用 LightCycler®480 基
因分型软件 1.5 版本分析。高分辨率的熔解分析方
法分析方便，因为不需要处理步骤和分离步骤［9］。
1.3 非同源末端连接百分比计算公式
ƒcut=（Cleavage Band1+Cleavage Band2）/（Uncl-
eaved Band+Cleavage Band1+Cleavage Band2）
%NHEJ=100×（1- cutf−1 ）
2 结果
2.1 Cas9和TALEN作用位点及引物设计结果
Cas9 和 TALEN 分别作用于 MSTN 基因的第一
外显子和第三外显子，在作用位点处设计 Surveyor，
T7EI 核酸酶检测以及 HRM 检测的引物（图 3）。
2.2 电转染结果
电转染 9 h 细胞换液，72 h 荧光显微镜下观察
电转染的效率（图 4）。
2.3 PAGE检测Surveyor和T7EI酶切及定量分析
结果
PAGE 胶检测 Surveyor 和 T7EI 酶切效果，并使
用 quantity one 定量软件分析，定量结果使用非同源
末端连接百分比计算公式计算 NHEJ 百分比（图 5）。
第一外显子 Surveyor 和 T7EI 检测引物扩增长
度 为 575 bp，Cas9 的 作 用 靶 点 在 243-262 bp 处，
Surveyor 和 T7EI 在作用靶点发生酶切作用，切开的
条带大小为 243 bp 和 313 bp 左右，但是在 MSTN 第
一外显子的 161 bp 处产生一个突变位点，实验将未
电转染的萨福克绵羊成纤维细胞和电转染 CRISPR/
Cas9 的细胞提取基因组，分别使用 MSTNE1-F/R 引
物扩增，将其胶回收产物测序，结果均为在 161 bp
处存在 SNP 位点（图 6）。Surveyor 核酸酶检测到这
一突变位点并将其切开，两个突变位点可产生条带
大小 243 bp 和 313 bp，161 bp 和 414 bp 左右，但是
414 bp 这个中间产物中还存在 Cas9 的突变位点，会
产生 100 bp 和 314 bp 左右的条带，酶切产生 6 条带，
分别为 100 bp，161 bp，243 bp，313 bp，314 bp 和
414 bp，313 bp 和 314 bp 左右的条带在酶切图上只
产生了一条带，所以酶切图上只产生了 5 条带切开
的条带 ；T7EI 只切开了 Cas9 的酶切位点，产生了两
条切开的条带。MSTN 第三外显子 Surveyor 和 T7EI
检测引物扩增长度为 532 bp，TALEN 的作用靶点在
239-255 bp 处，Surveyor 和 T7EI 在作用靶点发生酶
切作用，切开的条带大小为 277 bp 和 293 bp 左右。
2.4 HRM检测结果
样品基因型的分析结果见图 7。
3 讨论
在基因组编辑技术的推动下，建立动物和细胞
模型的速度也越来越快。在这种情况下，基因分型
过程成为了新的瓶颈［10，11］。目前，检测基因靶位点
突变的技术主要有 Surveyor 核酸酶、T7E1 分析和高
Cas9 targeting
C/A 161MSTNE1-SVF
1 MSTNE1-HRMF MSTNE1-HRMR
MSTNE1 sequence
MSTNE1-SVR
575
50 bp
TALENs targetingMSTNE3-SVF
1 MSTNE3-HRMF MSTNE3-HRMR
MSTNE3 sequence
MSTNE3-SVR
532
50 bp
A
B
图 3 PCR 扩增 Cas9（A）、TALEN（B）作用于 MSTN 基因示意图
2016,32(2) 81李炜杰等：三种检测内源性基因修饰方法比较
分辨率熔解分析（HRMA）3 种，这 3 种检测方法简
单、方便、分析更快，为最常用的检测突变方法。
Surveyor 和 T7E1 能有效地切开不匹配的位点，
切割的片段大小可提示突变位点的位置，切割产物
的数量能够提示突变数量。在设计 PCR 引物一般要
求在 500 bp 左右，目标位点不要设计在中央，酶切
产生两条大小不同的条带。Surveyor 和 T7EI 酶切的
条带可以利用软件分析计算 NHEJ 百分比。
电转染的 Cas9 和 TALEN 质粒对细胞基因组产
生切割作用，则由于 Surveyor 和 T7EI 核酸酶对基因
组扩增子错配位点的切割作用，会产生较小的条带；
若没有对细胞基因组产生切割作用，则会有较大的、
完整无缺的基因组扩增条带。阳性对照组只会产生
较大的、完整无缺的基因组扩增条带（图 5）。
对于 T7EI 和 Surveyor 酶切条带不同的原因分析：
对不同的不匹配类型有着不同的切割偏好，T7EI
对 HE 删除和插入位点的偏好要比 Survery 强 ；而
Survery 超越 T7EI 的优越性是在异位替换和转换［12］。
Survery 能切割所有类型的不匹配位点，所以有些
不是所要的切割位点，Survery 也把它切开，另外，
Surveyor 还对酶切的中间产物有很强的偏好性，100
bp 的条带属于酶切的中间产物经 Surveyor 再次切割
产生，因此 Surveyor 酶切产生了 5 条带。
HRM 的特点是高特异性和高灵敏度，检测灵敏
度可以达到 1%-0.1%，在大量样本、多个突变位点
的筛查上，比传统的非均一性方法更方便、性价比
更高［13，14］。HRM 可对任何扩增子上的未知突变进
行筛查，不需要识别不同等位形式的引物或探针，
不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突
变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析。
所以，相比定量探针法的突变分析和其他类型的快
速突变分析法，应用面大大拓展，操作简便、快速，
结果准确，成本也大大降低，成为近年来国外新兴
的遗传学、方法学研究和应用热门。
HRM 技术在 PCR 扩增后即可直接被用来对样
品进行分析，不需要样品的分离纯化。因而可以降
低分离纯化过程中所带来的样品污染的可能性，同
时，也能大大减少工作量。HRM 技术在 PCR 扩增时，
一定要确保样品混匀，避免饱和染料混合不均，但
是 HRM 技术对硬件的要求严格，对温度分辨率和仪
器温度的均一性要求非常高，仪器需要高能量的激
发光源以监测熔解曲线的微小变化，这种技术受限
于仪器的使用。另外，HRM 的引物最好在 100-250
bp，扩增片段越小，检测特异性 SNP 的可能性越大，
但是，小片段法也存在明显的缺陷，不能检测所有
类 型 的 SNP［15］。HRM 技 术 与 Surveyor nuclease 和
T7EI 相比的缺点是不能得知突变位点的位置也不能
能计算 NHEJ 百分比。
4 结论
实 验 采 用 了 3 种 检 测 基 因 靶 位 点 突 变 技 术
HRM、Surveyor nuclease 和 T7EI 核 酸 酶，3 种 检 测
方法的结果都表明作用于绵羊 MSTN 基因第一外显
子和第三外显子的 CRISPR/Cas9 和 TALEN 人工核酸
酶的生物活性有明显的作用。

图 4 Pmax 绿色荧光蛋白表达质粒电转染结果图
1，6 ：Marker ；2 ：surveyor 酶切电转染 TALEN 质粒细胞 ；3 ：surveyor 酶切
正常细胞；4：surveyor 酶切电转染 Cas9 质粒细胞；5：surveyor 酶切正常细胞；
7 ：T7E1 酶切电转染 TALEN 质粒细胞 ；8 ：T7E1 酶切正常细胞 ；9 ：T7E1
酶切电转染 Cas9 质粒细胞 ；10 ：T7E1 酶切正常细胞
Surveyor 酶切 %NHEJ ：2 ：ƒcut= 20.81%，4 ：ƒcut= 22.75%
T7EI 酶切 %NHEJ ：7 ：ƒcut=30.02%，9 ：ƒcut= ：26.48%
图 5 CRISPR/Cas 9 和 TALEN 的活性酶切鉴定图
1500
bp
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.282
参 考 文 献
［1］Huang MC, Cheong WC, Lim LS, et al. A simple, high sensitivity
mutation screening using Ampligase mediated T7 endonuclease I and
Surveyor nuclease with microfluidic capillary electrophoresis［J］.
Electrophoresis, 2012, 33（5）：788-796.
［2］Qiu P, Shandilya H, DAlessio JM, et al. Mutation detection using Su
rveyor nuclease［J］. Biotechniques, 2004, 36（4）：702-707.
［3］Kim HJ, Lee HJ, Kim H, et al. Targeted genome editing in
human cells with zinc finger nucleases constructed via modular
assembly［J］. Genome Res, 2009, 19（7）：1279-1288.
［4］Zhou L, Wang L, Palais R. High-resolution DNA melting analysis
for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin
Chem, 2005, 51（10）：1770-1777.
［5］ Cui G, Zhang L, Xu Y, et al . Development of ahigh resolution melt-
R
el
at
iv
e
Si
gn
al
/%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Pmax
⑙ᓖć
Cas9
77
.5
78
.0
78
.5
79
.0
79
.5
80
.0
80
.5
81
.0
81
.5
82
.0
82
.5
83
.0
83
.5
84
.0
84
.5
85
.0
85
.5
86
.0
R
el
at
iv
e
Si
gn
al
D
iff
er
en
ce 6.077
1.077
-..923
-8.923
-13.923
-18.923
-23.923
-28.923
-33.923
-38.923
-43.923 ⑙ᓖć
Pmax Cas9
77
.5
78
.0
78
.5
79
.0
79
.5
80
.0
80
.5
81
.0
81
.5
82
.0
82
.5
83
.0
83
.5
84
.0
84
.5
85
.0
85
.5
86
.0
R
el
at
iv
e
Si
gn
al
/%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0 ⑙ᓖćTALEN
Pmax
77
.5
77
.0
78
.0
78
.5
75
.0
75
.5
76
.0
76
.5
79
.0
79
.5
80
.0
80
.5
81
.0
81
.5
82
.0
82
.5
83
.0
83
.5
84
.0
84
.5
85
.0
R
el
at
iv
e
Si
gn
al
D
iff
er
en
ce 20.89518.895
16.895
14.895
12.895
10.895
8.895
6.895
4.895
2.895
0.895
-1.105
-3.105 ⑙ᓖć
TALEN
Pmax
77
.5
77
.0
78
.0
78
.5
75
.0
75
.5
76
.0
76
.5
79
.0
79
.5
80
.0
80
.5
81
.0
81
.5
82
.0
82
.5
83
.0
83
.5
84
.0
84
.5
85
.0
Cas9⟄䀓ᴢ㓯Ⲵᖂаॆ઼⑙ᓖ┲〫 㓿ᖂаॆ઼⑙ᓖ┲〫ਾ⟄䀓ᴢ㓯Ⲵᐞ߿ᴢ㓯
TALEN⟄䀓ᴢ㓯Ⲵᖂаॆ઼⑙ᓖ┲〫 㓿ᖂаॆ઼⑙ᓖ┲〫ਾ⟄䀓ᴢ㓯Ⲵᐞ߿ᴢ㓯
图 7 HRM 检测 Cas9 和 TALEN 基因分型图
图 6 MSTN 第一外显子基因突变位点测序结果图
2016,32(2) 83李炜杰等：三种检测内源性基因修饰方法比较
ing Development of a high resolution melting method for genotyping
of risk HLA-DQA1 and PLA2R1 alleles and ethnicdistribution of
these risk alleles［J］. Gene, 2013, 514（2）：125-130.
［6］ Er TK, Kan TM, Su YF, et al. High-resolution melting（HRM）
analysis as a feasible method for detecting spinal muscular atrophy
via dried bloodspots. ［J］Clin Chim Acta, 2012, 413（21-22）：
1781-1785.
［7］Lin Y, Cradick TJ, Bao G. Designing and testing the activities of TA
L effector nucleases［J］. Methods Mol Biol, 2014, 1114 ：203-219.
［8］Tricarico R, Crucianelli F, Alvau A. High resolution melting an
alysis for a rapid identification of heterozygous and homozygous
sequence changes in the MUTYH gene［J］. BMC Cancer, 2011,
11 ：305.
［9］Wittwer CT, Reed GH, Gundry CN. High-resolution genotyping by
amplicon melting analysis using LCGreen［J］. Clin Chem, 2003,
49（6 Pt 1）：853-860.
［10］Zhou Y, Zhu S, Cai C, et al. High-throughput screening of a
CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells［J］.
Nature, 2014, 509（7501）：487-491.
［11］Shalem O, Sanjana NE, Hartenian E, et al. Genome-scale CRISPR-
Cas9 knockout screening in human cells［J］. Science, 2014, 343
（6166）：84-87.
［12］Tsuji T, Niida Y. Development of a simple and highly sensitive
mutation screening system by enzyme mismatch cleavage
with optimized conditions for standard laboratories［J］.
Electrophoresis, 2008, 29（7）：1473-1483.
［13］Reed GH, Wittwer CT. Sensitivity and specificity of single-
nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting
analysis［J］. Clin Chem, 2004, 50（10）：1748-1754.
［14］Liew M, Pryor R, Palais R. Genotyping of single-nucleotide
polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons［J］.
Clin Chem, 2004, 50（7）：1156-1164.
［15］张建佚 , 冯洁 , 杨泽 , 等 . 高分辨率熔解曲线小扩增子法结合
混样法在线粒体 13928G > C 突变分析中的应用［J］. 中国医
药生物技术 , 2009, 6 ：445-448.
（责任编辑 李楠）