全 文 ：收稿日期:2007-11-09
作者简介:张根良(1983-),男,硕士研究生,研究方向:木薯转基因检测;E-mail:zhang330521@sinacom
通讯作者:王文泉,E-mail:wquanw@hainan.net。
叶片衰老是一种典型的细胞程序性死亡,它表
现在叶绿素、脂类、蛋白质和 RNA的减少,有助于
提高植物的适应性;它可以作为作物选择的一个重
要指标来增加作物的遗传改良潜力。目前,对于叶
片衰老的机制已经在生理生化、分子水平得到一定
的阐明,获得了一些与衰老有关的基因。并且发现
在衰老进程中,植物激素,包括生长素、赤霉素、乙
烯、脱落酸和细胞分裂素起着非常重要的作用。其
中,细胞分裂素作为植物衰老过程中的一个关键因
子得到了广泛的关注。
已有研究通过转化 ipt基因增加植物内源的细
胞分裂素,可以延缓植物叶片的衰老,增强植物对
非生物逆境的抗性。ipt基因来源于土壤农杆菌
(Agrobacteriumtumefaciens)的 Ti质粒,编码一种异
戊烯基转移酶,催化和调控细胞分裂素的合成。
Medford(1989)等[1]利用 ipt基因转化烟草和拟
南芥,用来源于玉米的 hsp70作为热诱导启动子,
调控 ipt基因的表达,受热激诱导后的转基因植物
表现出叶片衰老的延迟,细胞分裂素显著增加,但
没有诱导的转基因植物在细胞分裂素增加后,出现
了许多影响生长和发育的有害症状,如侧芽的脱
落,茎杆和叶面积的减少,根生长的停止等。Gan和
Amasino(1995)[2]采用了一种全新的策略来转化 ipt
基因,利用细胞分裂素的自调控来减缓转基因烟草
叶片的衰老,而不改变其它的表型性状;转化的 ipt
基因处于高度特异的-与衰老相关启动子 SAG12的
控制之下,融合的 PSAG12-ipt基因只在衰老的底部成
熟叶片中表达。
简要介绍了 ipt基因编码特性和 SAG12启动子
在 ipt表达中的作用,以及表达基因在转化植株中
PSAG12-ipt基因转化植株研究进展
张根良 1,2 王文泉 2
(1华南热带农业大学农学院,儋州 571737;2中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口 571101)
摘 要: 叶片衰老是一种程序性死亡过程;ipt(isopentenyltransferas)基因转化植株,可以催化调控内源细胞分裂
素合成,延缓转化株叶片衰老。SAG12基因启动子能够控制ipt基因在植株下部衰老叶片中表达。介绍了 ipt基因和
SAG12基因启动子的来源和应用,以及PSAG12-ipt基因的产生和转化植株在国内的研究概况。
关键词: SAG12 ipt 细胞分裂素 叶片衰老
AViewofAdvantageinTransferenceofGene
PSAG12-iptintoPlant
ZhangGenliang1,2 WangWenquan2
(1ColageofAgronomy,SouthChinaUniversityofTropicalAgriculture,Danzhou571737;2TheInstituteofTropical
BioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgricultureAgriculturalSciences,Haikou571101)
Abstract: Leafsenescenceisatypeofprogrammedceldeath;Theintroductionoftheiptgeneintotheplant
genomeresultsinelevatedlevelsofcytokinininthetransformedtisueanddelayedleafsenescence.TheSAG12
promoterletsiptgeneactivateonlyattheonsetofsenescenceinthelowermatureleavesofplant.Theoriginand
applicationofiptgeneandSAG12promoterarereviewed.AndprogresonPSAG12-ipttransferedintoplantisstudied.
Keywords: SAG12 iptCytokinin Leafsenescence
2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
的应用。
1 叶片抗衰老基因 ipt的产生和作用
植物激素在植株生长和发育中具有重要的作
用,其中细胞分裂素参与了细胞分裂的调控、延缓
衰老和促进侧芽的生长;这使研究学者试图通过改
变内源细胞分裂素含量来控制这些过程。但是植物
本身的细胞分裂素合成相关基因并没有分离得到,
使得根癌农杆菌中的 ipt基因得到了广泛的关注。
1984年 Akiyoshi等[3]从根癌农杆菌中将编码异
戊烯基转移酶(ipt)的基因分离了出来,并阐明了异
戊烯基转移酶是细胞分裂素生物合成步骤中的一
个关键限速酶,它促使△2-磷酸 PPi与 AMP结合形
成磷酸 AMP,接着被快速转化成异戊烯基腺苷和
异戊烯基腺嘌呤;经过细胞分裂素氧化酶作用最终
分别形成玉米素核苷和玉米素。
ipt基因从农杆菌中分离,导入植物基因组中
所产生转基因植株,观察发现组织细胞分裂素含量
增加,叶片衰老延迟[4,5]。但是植株形态也发生了变
化;例如转基因植株芽不萌发,没有顶端优势,叶片
小而圆,不形成根等[6,7]。引起这些变化的主要原因
就是 ipt基因在植株中的表达没有控制,使细胞分
裂素合成过剩,从而影响了植株的生长。
为了解决植物组织中细胞分裂素过量表达的
问题,研究学者用了许多组织特异性启动子和可诱
导启动子来表达外源 ipt基因,如热激启动子、铜诱
导启动子等[8,9],均获得了相应的抗衰老植株;这些
转基因植株能够产生正常的根系,但植株通常矮
小,并且有大量腋生芽。激素分析显示,转基因植株
内的激素水平仍高于对照植株的激素水平。这些研
究仅局限于实验室,限制了抗衰老遗传转化工程在
农业生产上的应用。
2 SAG12启动子在转 ipt植株中的应用
1994年 Lohman等[10]从拟南芥中分离得到一组
衰老相关基因(SAGs),研究证明其中编码半胱氨
酸蛋白酶的 SAG12基因表达产物只存在植物下部
衰老叶片中,在嫩叶中并没有发现。说明 SAG12具
有高度的衰老特异表达特性。
SAG12基因启动子(PSAG12)活性受到叶片衰老
过程和细胞分裂素含量的调控。当叶片开始衰老、
细胞分裂素含量下降时,PSAG12被激活,SAG12基因
表达;随着叶片细胞分裂素含量的增加,叶片衰老
进程被抑制,PSAG12又逐渐被抑制。因此,人们开始
利用 PSAG12来控制 ipt基因的表达。根据 PSAG12衰老
特异表达特性,使 ipt基因在 PSAG12驱动下在植物衰
老叶片中表达,有效调控内源细胞分裂素含量,在
不影响植株正常发育的前提下,达到延缓叶片衰老
的目的。
1995年 Gan等[2]把 SAG12特异启动子与 ipt构
建形成 PSAG12-ipt嵌合基因,通过根癌农杆菌介导转
化烟草获得转基因植株。经研究发现这种新型转基
因植株与野生型相比,叶片衰老明显延迟,花数和
生物量也有所增加;但形态方面无明显差别,根系
发育完全,顶端优势得到保持,在生理方面也表现
出光合作用延长。同时,还对 PSAG12-ipt和 PSAG12-gus
转化株的 GUS活性进行了比较。结果表明,前者的
GUS活性的提高明显比后者缓慢,说明 PSAG12-ipt自
调控系统确实起到了自动调节的作用。
PSAG12-ipt自调控系统具有低水平表达、自动调
节表达的优点,不需要耗费巨大的人力物力,就可
能实现延缓作物衰老,提高产量。这些都为转基因
植株农业推广奠定了基础。
3 PSAG12-ipt转化植株和衰老调控
编码细胞分裂素生物 合 成 限 速 步 骤 合 成
酶——异戊烯基转移酶 (isopentenyl-transferases)的
基因首先在根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)
中得到鉴定,被称为ipt基因。随着拟南芥(Arabidopsis)
基因组测序工作的完成,对 ipt基因又有了新的了
解。研究表明,拟南芥的异戊烯基转移酶是被一个
小的多基因家族编码,其结构与细胞腺苷酸异戊烯
基转移酶和 tRNA异戊烯基转移酶相似。进行基因
产物的生化分析还揭示了 ADP和 ATP是反应的优
先底物[11]。
在对植物叶片衰老研究过程中,根据差异筛选
和减扣杂交等检测手段,发现衰老叶片的 RNA总
量下降,特别是 rRNA水平剧烈下降[12]。相反,某些
基因则在衰老开始后,表达量反而逐渐升高;这类
基因被称为 SAG基因。目前已经从拟南芥等植物
中克隆出了大约 30多中 SAG基因,但只有其中一
小部分表现出高度的衰老特异性,如从拟南芥中
克隆出的 SAG12、SAG13[10]和从欧洲油菜(Brassica
12
2008年第2期
napus)中克隆出的 LSC54[13]。这些基因的功能有的
已经被证实与衰老细胞内的大分子物质的降解转
运有关,如编码核酸酶、蛋白酶、酯酶、谷氨酰胺合
成酶等的基因。
用带有来源于拟南芥的衰老相关基因 SAG12
启动子和新霉素磷酸转移酶(NPTI)选择基因的
双元质粒作为载体,将克隆自土壤农杆菌 Ti质粒
的 ipt基因导入双元质粒构建表达载体。利用构建
的含 ipt基因的表达载体通过农杆菌介导法、基因
枪法等途径转化植株,按照规定的程序获得转基因
株系[14]。获得的转基因植株还要通过 PCR、Southern
杂交等对所转ipt基因的稳定性进行检测;通过GUS
活性和细胞分裂素含量分析,证明抑制衰老的自我
调节系统在转基因植株中得到表达。
当叶片开始衰老时,SAG12基因启动子(PSAG12)
被激活,表达 ipt基因合成细胞分裂素;通过细胞分
裂素抑制核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、蛋白酶等
的活性,延缓核酸、蛋白质、叶绿体等的降解;同时
细胞分裂素可促使营养物质向应用部位移动。
4 PSAG12-ipt对植株的生理影响
PSAG12-ipt转基因植株除了延缓下部叶片衰老
外,其他形态学和野生型对照基本相同,如株高、叶
型、侧芽萌发等。但是转基因植株种子萌发和幼苗
生长相对比较缓慢。这可能是由于在植株早期生长
时,所转基因被激活所引起的。
研究还发现,PSAG12-ipt转基因植株茎干变粗,茎
干内部的水含量也相应增加。已知细胞分裂素可以
增加内部还原性糖的含量[15]。因此,这些还原性糖
的积累可能会导致渗透压的增加,促使植物吸水
和细胞膨胀,最终使得茎干变粗和茎干内水量增
加。
已有研究表明,植物中细胞分裂素的积累与植
物的 N状态紧密相关[16]。但是缺氮对 PSAG12-ipt植株
并没有太大的影响。在缺少氮和硝酸盐的条件下,
植株仍然保持绿色。研究表明,转基因植株生长培
养基去氮 5~10d后,检测发现植株内氮含量减少了
70%,但并没有显著抑制植株的生长,也没有发现
黄化的叶片[17]。PSAG12-ipt的这种反作用为作物育种
提供了一个新的机遇。
转 PSAG12-ipt基因还可以延缓由水涝胁迫所引
起的衰老[18]。当水涝胁迫消除后,转基因株系糖、叶
绿素、细胞分裂素和脱落酸的恢复都比野生型迅
速;转基因植株根部细胞分裂素积累更快。
5 PSAG12-ipt基因转化植株在国内的研究
国内对作物衰老调控的研究,以前一直局限在
宏观上。随着国外 PSAG12-ipt基因的产生和应用,近
几年国内也对此基因进行了植株转化和利用,并在
作物遗传育种上取得了可喜的成绩。
1998年付永彩等[19]利用基因枪法把带有特异
衰老基因 SAG12启动子的 ipt基因导入水稻,并用
PCR、Southern杂交等证明外源基因稳定性。通过
GUS活性、细胞分裂素含量的分析以及 T1代转基
因植株成熟期的形态观察,证明 PSAG12-ipt基因在部
分转基因水稻中表达,叶片衰老受到明显抑制。
随着研究的深入,国内通过对青菜[20]和油菜[21]
等植株的基因转化,都证实 PSAG12-ipt延缓叶片衰
老,增长叶片利用光能的时间,使之积累了大量的
光合产物。通过对转 PSAG12-ipt基因水稻叶片中叶绿
体的类囊体、嗜锇体等超微结构变化研究[22],也说
明叶片衰老抑制基因 PSAG12-ipt在转化植株中的表
达可明显延缓叶片衰老,较长时间保持叶片绿色。
2004年奚亚军等[23]利用花粉管通道法将叶片
衰老抑制基因 PSAG12-ipt导入普通小麦,获得了 2株
叶片早衰现象得到明显改善的转基因植株。通过叶
片细胞分裂素含量、叶绿素含量、叶片衰老进程及
农艺性状分析,初步证明 PSAG12-ipt基因在转基因小
麦的衰老叶片中特异表达,叶片衰老受到明显抑
制,其千粒重、籽粒产量和生物学产量均较对照显
著增加,表明可以利用 PSAG12-ipt基因对生产上有早
衰缺陷的品种进行遗传改良,最大程度地发挥现存
品种的生产潜力及为育种创造新种质。
与此同时,今后作为我国第一能源作物的木
薯,其叶片抗衰老转基因植株已经在国内种植成
功,这在国际上也是首次。中国科学院上海生命科
学研究院植物生理生态研究所的张鹏研究员建立
了一套成熟的木薯转化方法,并在木薯中成功转化
了 PSAG12-ipt基因,于 2006年 3月在海南海口顺利
完成了 0.1333hm2田间试验;通过延缓木薯叶片脱
落,延长叶片寿命来增加木薯全株的光合作用能
力,从而提高块根产量。
张根良等:PSAG12-ipt基因转化植株研究进展 13
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
6 展望
从国内外转 PSAG12-ipt基因植株的应用和发展
来看,从分子生物学方面来研究植物叶片衰老,已
成为当前的一个热点。人们试图通过延迟植物叶片
衰老,增加光合效率,来提高作物产量的同时不改
变植株形态;然而除了下部叶片脱落延缓、细胞分
裂素含量增加外,PSAG12-ipt基因转化植株还存在着
许多与野生型不同的特征。
在转基因植株生长后期,其下部叶片叶绿素、
蛋白和 Rubisco含量都比野生型多;相反,上部叶片
含量却比野生型少;同时,整株叶片蔗糖、果糖和葡
萄糖含量与对照相比都有所增加。然而转基因植株
幼苗相对矮小,且开花结果有所延迟[24]。这些生理
上的区别仍然没有得到很好的解释。在国内,大部
分还处于植株转化阶段;在植株转化并检测成功之
后,并没有对其生理上存在的差异进行研究,更不
用说是分子水平上的解释了。因此,在这方面国内
还是有待于改善的。
同时,为了获得更好的转基因植株,一些新的
衰老相关基因启动子已经开始研究。2006年 D.
Swartzberg等[25]将拟南芥 SAG13基因启动子与 ipt
基因构建转化番茄获得 PSAG12-ipt转基因植株,并与
PSAG12-ipt转基因番茄进行了比较研究;发现两者都
导致了叶片衰老和开花的抑制,且果实重和果实可
溶性总固体量(TSS)有所增加。与 PSAG12-ipt转基因
番茄不同的是,PSAG13-ipt在上部成熟未衰老叶片中
也有少量表达,说明它不受细胞分裂素抑制;而且
植株也相对矮小,节间短、茎干粗;但经黑暗诱导发
现,PSAG13-ipt叶片黄化和叶绿素降解比 PSAG12-ipt更
慢,开花的叶片部位也提前。
此外,PSAG12-ipt转基因植株叶片衰老的分子机
制目前还不十分清楚,国内外还找不到详细的解
释,这在很大程度上限制了对其分子调控的研究和
应用。但对 SAG表达调节的研究可能会有助于阐明
叶片衰老的分子机制。据研究表明,SAG基因表达
十分复杂,可能存在由多条途径组成的调节网络来
控制叶片衰老[26]。所以阻断哪些途径,对衰老的进程
是否有明显的效果,这些问题需要进一步研究学习
加以解决。
外源基因能否通过根系分泌物进行逃逸,目前
尚无定论。Saxena等[27]曾报道在转基因植物种植的
土壤中发现了外源 DNA。由于转基因植物安全性
的研究尚处于起步阶段,对于 PSAG12-ipt转基因植株
安全性评价还存在许多不确定性。
在转基因技术不断完善和迅猛发展的今天,植物
叶片衰老遗传调控的研究将更加深入,PSAG12控制ipt
表达的分子机制必将得到明确的阐述,PSAG12-ipt基因
转化植株也会进行有效的改进,甚至可能会有更好
的衰老相关启动子发现,最终将成功应用并推广到
农作物生产中,提高社会和经济效益。
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