全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
与 HBV感染可能有关的 m icroR122的
筛选及其作用的靶点预测
郝美君 黄爱龙
(重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室,重庆 400016)
摘 要: 应用基因芯片技术筛选到与 HBV感染可能有关的 m icroRNA m iR122, 利用计算机软件分析预测 m icroR
122作用 HBV的可能靶点。分析结果认为 m iR122与 HBV的感染可能有关,并且作用靶点可能为 HBV1 6891 711 nt。
关键词: HBV m icroRNA
m iR122 Screen Related to HBV Infection and
Prediction ofm iR122 Targeting HBV
H aoM e ijun HuangA ilong
(K ey Laboratory ofM olecular InfectiousD iseases, M inistry of Education, Chongqing M edical University, Chongqing 400016)
Abstrac:t m iR122 w as re la ted to HBV in fection by using genech ip and targe t sequence of m iR122 regu la tingH BV w as pred ic
ted by com putationa lm ethods. HBV 1 687- 1 711 nt w as ana lyzed the targe t sequence o fm iR122 regulatingH BV.
Key words: HBV m icroRNA
收稿日期: 20091117
基金项目:国家 973计划前期研究专项 ( 2007CB516810)
作者简介:郝美君,女,硕士研究生,主治医师,从事病毒分子生物学研究; Em ai:l hao970202@ 163. com
通讯作者:黄爱龙,教授,博士生导师; Em ai:l ahu ang@ cqu. edu. cn
M icroRNA广泛存在于动植物细胞中,它是一类
长度约 22个核苷酸的非编码微小分子 RNA [ 1] ,具有
很高的保守性。第一个 m iRNA的发现是在 1993年,
Lee等 [ 2]发现 lin4在线虫幼虫第一、第二阶段逐渐
积累,抑制其靶基因 lin14和 lin28的翻译,降低靶基
因的表达,刺激幼虫进入第三阶段。 2000年 let7被
发现 [ 3] ,它在幼虫阶段逐渐积累,刺激晚期幼虫到成
虫的转变,说明这个 m iRNA在免疫系统和 B细胞分
化中的作用。到目前为止,人们已经发现了 3 000多
种不同的 m iRNA分子 [ 4, 5] , 人类基因组中也发现了
450多种 m iRNA,约占人类基因的 1% - 4%。预计哺
乳动物细胞中存在上千种 m iRNA,这使得其成为最大
的一类基因表达调控因子,调节细胞分裂、增殖、分化
和多种生物学信号通路,也可以起到肿瘤抑制基因和
癌基因的作用,以及应用在疾病诊断和基因功能的研
究中。目前研究发现的与病毒有关的 miRNA如表 1。
病毒性肝炎的治疗仍然是世界难题,目前研究发
现 m iR122抑制 HCV的复制, 这为病毒性肝炎的治
疗提供了新的思路。为了探究与乙型肝炎病毒 ( hep
at itis B v irus, HBV)有关的 m iRNA,进行以下研究。
表 1 目前研究发现的与病毒有关的 m iRNA
病毒 m iRNA 来源 功能
SV40 SVm iRNA s 病毒 降解或下调早期基因表达
EBV m iRBART2 病毒 修饰 BALF5的转录
H IV m iRN367 病毒 下调 LTR启动子的转录
PFV1 m iR32 宿主 下调病毒转录本的翻译
HCV m iR122 宿主 促进 HCV的复制
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 3期
1 材料与方法
1. 1 基因芯片技术筛选与 HBV可能有关的 m i
croRNA
为了进一步探求 m iRNA与嗜肝病毒 HBV的关
系,首先, 对 HBV稳定表达和瞬时转染细胞模型中
m iRNA表达谱用基因芯片分析 ( Ex iqon 8. 1 Den
mark)的方法,并通过实时 RTPCR验证芯片检测到
的准确性。
1. 2 计算机预测 HBV上 m icroRNA的可能作用靶点
本研究选用 m iRanda v 1. 0b版本的计算机软
件, 遵循预测靶点的基本原则, 设定自由能小于
- 20 Kcal/mol、综合评分大于 80等的各项参数。
2 结果
2. 1 基因芯片筛选可能与 HBV感染有关的m iRNA
基因芯片结果显示 38条差异表达的 m iRNA,
其中观察到 m iR122在瞬时转染 HBV的 HepG2细
胞内表达上调 4. 17倍 (表 2)。
表 2 m iR122瞬时感染 HBV的 HepG2
细胞中的表达结果
名称 瞬时标准值 ( a) H epG2标准值 ( b) a /b
m iR122 0. 038073908 0. 009129968 4. 17
2. 2 计算机软件预测 m iR122作用 HBV的靶点
从以上数据分析发现 m iR122的 5端与 HBV
的 1 689- 1 711 nt处, 序列互补性较高。种子序
列配对情况较好,有 1- 9 nt互补。而且不同基因
型的 HBV在此序列区域同源性高, 图 1从上到下
基因型与同源性分别为 A型: 95% ; B型: 95% ; C
从上到下基因型及同源性分别为 A型: 95% ; B型: 95% ; C
型: 95% ; D型 : 95% ; E型: 95% ; F型: 95% ; G型: 95% ;
H型: 100%
图 1 各种基因型 1 689 n t- 1 711 n t同源性分析
型: 95%; D型: 95%; E型: 95%; F型: 95% ; G型:
95%和 H型: 100%。m iRNA与靶基因连接位点的
进化保守性较强, 并计算 m iR122: mRNA自由能为
- 20 K ca l/M o,l动力学稳定性较高, 各项指标符合
m iRNA靶序列的生物学要求, HBV的 1 689- 1 711
nt位置有 m iR122的可能作用靶点。
3 讨论与总结
通常 m iRNA编码基因的转录由 RNA聚合酶
参与 [ 6, 7] ,转录形成 pr im iRNA, 它含有 5端的 7甲
基鸟甘酸帽和 3端的 po lyA尾。之后被多蛋白体复
合物中的核糖核酸酶 D rosha切割为 70 nt的发夹
结构前体 ( prem iRNA ) [ 8- 11] , 这一酶切反应不仅得
到了成熟的 m iRNA的 3末端,而且使 3末端有 2 nt
的突出 [ 12, 13]。 Prem iRNA通过依赖 RanGTP∕ ex
portin5的转运出核 [ 14, 15 ] , 由另一类核糖核酸酶
D icer切割生成 5端磷酸化的不完全配对的 21- 25
nt双连 RNA, 其中一条是成熟的 m iRNA。m iRNA
的 5末端对于 m iRNA进入 m iRISC, 并在其中保持
稳定是非常重要的,而且,这一末端对于其生物学功
可能也相当关键。这种双链很快被整合到 m iRISC
复合体中。成熟的 m iRNA保留在此复合物中, 对
靶基因表达进行转录后水平上调控: mRNA的降
解或翻译抑制。如果 m iRNA与 mRNA的 3非翻
译区的靶序列碱基完全互补, mRNA 转录本在
RNA诱导的沉默复合体 ( m iRISC )中被核酸酶剪
切,导致靶 mRNA的降解 [ 16]。这种 m iRNA介导的
基因沉默机制在植物中比较普遍, 但在哺乳动物
中也有发现。最近的一些发现表明, m iRNA s与它
们的靶基因只有部分互补的情形也会导致 mRNA
的降解。绝大多数哺乳动物中的 m iRNA并不导致
靶 mRNA的降解, 而是通过另外一种机制进行基
因表达调控的。这些 m iRNA通过不完全的碱基配
对与 mRNA的 3非翻译区 ( UTRs)共结合在 R ISC
复合物中,蛋白质基因翻译被抑制, 但其 mRNA水
平几乎没有受到什么影响 [ 17 ]。m iRNA抑制 mRNA
的翻译机制至今为止是个迷, m iRNA抑制机制的
揭示有待于 m iRNA领域的深入研究。
研究证明 M iR122是一种肝脏组织特异性
m icroRNA , C hang
[ 18 ]课题组研究发现在受精卵置
入后 12. 5 d的小鼠即可检测到 m iR122表达, 其
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2010年第 3期 郝美君等:与 HBV感染可能有关的 m icroR122的筛选及其作用的靶点预测
表达水平在出生前达到平台期, 出生后以一种相
当缓慢的方式升高, 如用反义寡聚核苷酸使 m iR
122失活,肝脏功能则受损,胆固醇合成降低, 提示
m iR122不仅参与肝脏分化的调节, 还在维持肝脏
正常功能中起着重要作用。Yangshan等 [ 19, 20 ]发现
m iR122可调节凝血因子 的基因表达。大量研
究证实 m iR122可以与 HCV基因组相互作用促使
HCV复制,当 m iR122被灭活, 丙肝病毒复制水平
明显降低。 SarasinFillipow icz等 [ 21]发现对于干扰
素治疗丙肝无应答的病人 m iR122的表达低, 如
果在干扰素治疗前预处理 m iR122的水平, 病人
的干扰素治疗的应答率升高。
目前, 用计算机软件预测 m iRNA的靶点, 在
m iRNA研究领域得以广泛的应用。现在已开发出
TargetScan、m iR anda、P ictar、DIANAM icroT 等。M i
R anda由 Enright等编写,可用于线虫和人的 m iRNA
靶基因的预测。此软件预测方法的预测结果覆盖了
10个已经验证 m iRNA靶基因中的 9个, 主要强调
m iRNA的 5端序列与靶基因 3UTR 的靶序列的互
补性, 种子序列的碱基匹配情况,以及靶基因的保守
性。本试验前期的研究结果分析发现 m iR122的 5
端与 HBV的 1 689 - 1 711 nt处,序列互补性较高。
种子序列配对情况较好,有 1- 9 nt互补。而且不同
基因型的 HBV在此序列区域同源性高。m iRNA与
靶基因连接位点的进化保守性较强, 动力学稳定性
较高, 各项指标符合 m iRNA靶序列的生物学要求,
HBV的 1 689- 1 711 nt位置有 m iR122的可能作
用靶点。
参 考 文 献
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