全 文 ：基因组学与应用生物学，2011年，第 30卷，第 2期，第 204-211页
Genomics and Applied Biology, 2011, Vol.30, No.2, 204-211
研究报告
A Letter
甜杨低温响应 microRNAs的克隆与分析
孙润泽 侯琦 章文乐 钮俊 张志毅 林善枝 *
北京林业大学林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,北京, 100083
*通讯作者, linsz2002@163.com
摘 要 MicroRNAs (miRNAs)作为一类 21碱基左右的非编码小 RNAs，参与植物生长发育的调控，并在植
物对生物与非生物胁迫的应答过程中发挥重要作用。本研究依据 miRNA高度保守特点，利用已公布的毛果
杨(Populus trichocarpa)基因组序列设计引物，从甜杨(Populus suaveolens)基因组中克隆获得了 12个 miRNA
基因座序列。序列比对结果表明，这些 miRNA基因均为毛果杨低温响应 miRNA基因的同源序列。同时，以
低温(0℃)处理 0~48 h的甜杨幼苗为试材，通过半定量 RT-PCR法对 miRNA基因的成熟体序列在不同处理
时间下的表达谱进行分析，结果显示，大多数 miRNA成熟体序列在甜杨低温胁迫下的表达模式与其在毛果
杨中的表达极为相似，由此可推测这些保守性 miRNAs可能在甜杨和毛果杨两物种对低温胁迫的应答反应
中发挥相似的功能，而 miR168a、miR168b和 miR475a在两物种间表达现象的差异，表明它们可能通过调控
多种靶基因而发挥不同作用。本文结果将为进一步研究甜杨基因功能提供基础。
关键词 甜杨, microRNA,低温胁迫,表达谱
Cloning and Analysis of the Low Temperature Stress-Responsive microR-
NAs from Populus suaveolens
Sun Runze Hou Qi Zhang Wenle Niu Jun Zhang Zhiyi Lin Shanzhi *
National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants, Ministry of Edu-
cation, Beijing Forestry University, Beijing, 100083
* Corresponding author, linsz2002@163.com
DOI: 10.3969/gab.030.000204
Abstract MicroRNAs (miRNAs) are ~21-nucleotide non-protein-coding small RNAs that play key roles in plant
development and response to abiotic stresses. In this paper, 12 homologous sequences of cold stress-responsive
Ptc-miRNA genes were isolated from the genomic DNA of Populus suaveolens based on conservation of miRNA
within and between species. Additionally, the expression profiles of the obtained mature miRNAs from P. suave-
olens cuttings exposed to low temperature (0℃) for 0 to 48 hours were analyzed by semi-quantitative RT-PCR.
The results showed that the little difference in expression profiles of most mature miRNAs under cold stress be-
tween P. suaveolens and P. trichocarpa, suggesting that these conserved miRNAs may play similar roles in re-
sponse to low temperature stress, while the different expression profiles of miR168a, miR168b and miR475a indi-
cated that they might have different target genes between these two species. The results of this paper would provide
some groundwork for further investigating gene function of Populus suaveolens.
Keywords Populus suaveolens, miRNA, Low temperature stress, Expression profile
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(30872043)资助
温度是植物生长的必要条件，而低温是限制植
物生长发育和地理分布的重要环境因素，全球每年
因低温伤害(包括冷害和冻害)对农作物及林木生产
造成的损失十分严重，已引起各国政府和相关研究
部门的普遍关注。目前国内外对于植物抗低温机理
的研究主要集中于低温胁迫下的生理生化变化特
性、抗冻蛋白以及抗冻相关基因的功能分析等方面
(林善枝和张志毅, 2004; Guy et al., 2008; Maestrini et
al., 2009)，但对于植物在逆境胁迫应答过程中形成的
复杂调控网络机制至今尚未完全弄清。
microRNAs (miRNAs)是一类长度为 21 碱基左
右的内源非编码小分子 RNAs，由于其在真核生物基
因表达中的重要调控作用而成为近年来分子生物学
研究的热点。植物 miRNA是由包含茎环(stem-loop)
结构的长片段初始转录物(primary miRNA)在细胞核
内经 Dicer-like蛋白等剪切加工而合成的，而成熟后
的 miRNA转运至胞质中可与 Argonaute蛋白组装成
RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing com-
plexes, RISC)并与靶 mRNA结合，进而降解靶基因或
抑制其翻译(Voinnet, 2009)。目前识别和鉴定miRNAs
主要采用直接克隆和计算机预测 2种方法，其中直接
克隆法是将从生物材料中分离获得的小片段 RNA的
5和 3端分别连接接头后反转录构建 cDNA文库并
测序，通过与基因组数据库比对分析而筛选出可能
的 miRNA序列，并最终通过 Northern印迹杂交加以
验证(Wang et al., 2007; Yao et al., 2007)；而依赖于
miRNA 保守性的计算机预测方法是获得 miRNAs
的另一种有效策略，这一基于生物信息学的方法可
通过利用基因组序列和表达序列标签(expressed se-
quence tags, EST)等数据库从新物种中高效捕获已
知同源 miRNA基因序列(Yousef et al., 2009; Zhang
et al., 2005)，是对直接克隆法不能检测低丰度或特异
性表达 miRNAs的有效补充。到目前为止，已公布于
miRBase 数据库(http://www.mirbase.org; Release 16:
Sept 2010)中的杨树 miRNAs数量达 239个，其中大
部分成员在植株体内的表达可受寒冷、高温、干旱、盐
碱以及机械损伤等各类非生物胁迫的影响(Lu et al.,
2005; 2008)，表明它们在植物防御系统中有重要功能。
甜杨(Populus suaveolens)属青杨派的高大乔木，
主要分布于我国黑龙江大兴安岭，能够在年平均气
温-3.8℃和极端低温-46.9℃的环境下生存，具有较
强的抗冻能力，因而是研究木本植物抗冻性分子机
制的理想材料(林善枝和张志毅, 2004)。目前，我们已
开展了甜杨抗冻性相关的生理生化指标测定与分析
(Lin et al., 2005)、抗冻蛋白的分离纯化及功能鉴定以
及抗冻性相关转录因子 ICE1和代谢关键调控酶葡
萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因克隆与表达分析等方面
研究(林善枝和张志毅, 2004;林元震等, 2007;2009)，
并取得了一定成果，但尚未开展甜杨在低温环境相
关基因表达调控机理的研究工作。据此，本研究以毛
果杨(Populus trichocarpa)低温响应 miRNAs 和毛果
杨全基因组序列为参照，从甜杨基因组中分离获得
了 12个 miRNA基因座序列。同时，以低温处理不同
时间后的甜杨幼苗为试材，对 miRNA基因在低温
胁迫条件下的表达情况进行了检测与分析，从中探
讨这些 miRNAs 在甜杨应答低温胁迫环境中的可
能作用。
1结果与分析
1.1甜杨 miRNA基因的克隆
通过 PCR扩增，从甜杨基因组总 DNA中分离
获得了 12个基因片段(部分序列 GenBank 登记号:
HM627256-HM627266)，测序结果显示这些基因片段
长度分别为 841 bp、312 bp、895 bp、1 083 bp、1 870 bp、
690 bp、361 bp、1 918 bp、307 bp、393 bp、295 bp 和
437 bp，与预期片段大小几乎一致(图 1)。
1.2甜杨 miRNA基因的序列比对及结构分析
将克隆所得的 12个甜杨 DNA序列与毛果杨基
因组序列进行 BLAST分析，结果显示这些 DNA序
列编码的 miRNA基因均为毛果杨低温响应 miRNAs
基因的同源序列。在这些序列中，除 miR476a基因在
成熟体序列基因座位置存在单碱基差异外，其它成
员成熟体 miRNA基因座序列完全一致，表明这些同
源性 miRNA前体基因座序列在甜杨和毛果杨两物
种间具有较高相似度。同时，利用Mfold程序(Zuker,
2003)对所得的甜杨 DNA序列进行二级结构预测分
析，结果发现(图 2)，它们均能形成折叠自由能低于
图 1甜杨 12个 miRNA基因的 PCR扩增
注 : M: D2000 DNA Marker; 1: miR156a 基因 ; 2: miR156g 基
因 ; 3: miR160a 基因 ; 4: miR160e 基因 ; 5: miR164a 基因 ; 6:
miR168a基因; 7: miR168b基因; 8: miR390a基因; 9: miR393a
基因; 10: miR394a基因; 11: miR475a基因; 12: miR476a基因
Figure 1 PCR amplifications of the 12 miRNA loci from P. suave-
olens
Note: M: D2000 DNA Marker; 1: miR156a gene; 2: miR156g
gene; 3: miR160a gene; 4: miR160e gene; 5: miR164a gene; 6:
miR168a gene; 7: miR168b gene; 8: miR390a gene; 9: miR393a
gene; 10: miR394a gene; 11: miR475a gene; 12: miR476a gene
甜杨低温响应 microRNAs的克隆与分析
Cloning and Analysis of the Low Temperature Stress-Responsive miRNAs from Populus suaveolens 205
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
图 2甜杨与毛果杨 miRNA前体序列茎环结构预测
注:下划线标注部分:成熟体 miRNA序列;阴影标注部分:甜杨与毛果杨间的碱基差异
Figure 2 Predicted stem-loop structure of putative Psu-miRNA and Ptc-miRNA precursors
Note: Underlined: The mature miRNA sequences; Shadow: The base differences between P. trichocarpa and P. suaveolens
206
甜杨低温响应 microRNAs的克隆与分析
Cloning and Analysis of the Low Temperature Stress-Responsive miRNAs from Populus suaveolens
-25 kcal/mol (-25.80 kcal/mol 至 -73.80 kcal/mol)的
茎环结构，并且除了 miR394a和 miR475a的成熟体
序列位于茎环结构的 3 臂上外，其它 10个 miRNA
基因的成熟体序列均位于 5 臂上。此外，在成熟体
序列与其反向臂序列形成的互补区中包含有至少
15个 Watson-Crick或 G/U碱基对，并且不含较大的
内环结构。
1.3成熟体 miRNAs在甜杨中的表达
将在正常生长状况和受低温胁迫处理后收集的
甜杨幼苗叶片混和并提取总 RNA，利用 RNA加尾
和引物延伸 RT-PCR法验证这 12个预测的 miRNAs
在甜杨中的表达。结果发现，除了 miR476a之外，
miR156a、miR156g、miR160a、miR160e、miR164a、
miR168a、miR168b、miR390a、miR393a、miR394a 和
miR475a均在甜杨幼苗叶片中得到表达(图 3)。
同时，半定量表达检测结果显示(图 4)，miR160a,
miR168b、miR160e、miR164a、miR390a、miR393a 和
miR394a 在 0℃低温处理后甜杨幼苗叶片中的表达
量均明显高于对照，且随低温处理时间的延长呈上升
趋势；而 miR156a和 miR156g的表达则呈相反趋势。
此外，miR168a、miR168b和miR475a的表达量随处理
时间的变化呈波动状态。以上结果说明，这些miRNAs
的表达均受到低温胁迫的诱导或抑制，它们可能作为
甜杨中响应低温信号的调控分子而发挥各自的作用。
2讨论
MicroRNAs广泛存在于真核生物中并发挥重
图 3 RT-PCR验证 miRNAs在甜杨幼苗叶片中的表达
注: M: 50 bp DNA Ladder Marker; CK: 5.8S rRNA; 1: miR156a;
2: miR156g; 3: miR160a; 4: miR160e; 5: miR164a; 6: miR168a,
miR168b; 7: miR390a; 8: miR393a; 9: miR394a; 10: miR475a
Figure 3 RT-PCR validated the expression of miRNAs in leaves
of P. suaveolens seedlings
Note: M: 50 bp DNA Ladder Marker; CK: 5.8S rRNA; 1:
miR156a; 2: miR156g; 3: miR160a; 4: miR160e; 5: miR164a; 6:
miR168a, miR168b; 7: miR390a; 8: miR393a; 9: miR394a; 10:
miR475a
要的调控作用，而对各物种中 miRNAs的识别、鉴定
和表达分析是研究它们在植物生长发育或其它生理
过程中功能的基础。已有研究证明，大多数植物
miRNAs在不同物种间具有较高的同源性和进化保
守性，这可为从新物种中识别鉴定已知同源 miR-
NAs提供大量可行的方案。基于植物 miRNA保守
性特点，本研究从甜杨基因组总 DNA中成功克隆
获得归属于 9 个基因家族的 12 个保守 miRNA 基
因序列，结构分析结果表明，这些序列形成的二级
结构特征均符合 miRNA 在植物细胞核内能够被
Dicer-like酶等识别并加工合成的标准。此外，在正
常生长和低温处理后的甜杨幼苗中均未能检测到表
达的 miRNA成员 miR476a，其前体序列及成熟体序
列与毛果杨 miR476a 分别存在 9 碱基和单碱基差
异，且前体序列形成的茎环结构具有相对较高的自
由能(-25.80 kcal/mol)，这种结构上的不稳定可能是
造成 miR476a 在甜杨植株中不能表达或表达量极
低的主要原因。
近期研究表明，保守性 miRNAs在植物花蕾形
成和叶片形态建成等生长发育过程中发挥重要作用
或参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应；而那
些非保守 miRNAs则调控参与物种特异生长状况或
发育过程相关基因的表达(Lu et al., 2005; Zhang et al.,
2006)。本研究发现，在低温胁迫下，miR156a、
miR156g、miR160a、miR160e、miR164a、miR390a、
miR393a和 miR394a在甜杨幼苗中的表达情况与其
在毛果杨受 4℃低温处理后经微阵列分析获得的表
达谱结果极为相似(Lu et al., 2008)，表明这些保守性
miRNAs在两物种间可能具有相同的靶基因并在低
温逆境胁迫下发挥相似的作用。此外，miR168a、
miR168b和 miR475a在甜杨中的表达变化随低温处
理时间的延长呈波动状态，但它们在低温胁迫的毛
果杨中的表达量则分别出现增加和减少(Lu et al.,
2008)，这种序列保守 miRNAs在不同物种间表达现
象的差异，表明它们可能通过调控多种靶基因而在
植物抗逆反应中发挥不同作用，而且这些有功能差
异的同源性 miRNAs可能是各物种在长期适应自身
生活环境的进化过程中的产物。
业已证明，某些 miRNAs的靶基因可作为具有调
控植物生长和发育功能的转录因子，如生长素响应因
子(auxin response factor, ARF)、SQUAMOSA (SQUA)
类基因启动子结合蛋白(squamosa promoter binding
protein-like, SPL)以及 NAC-domain转录因子等。其
中 miR160在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza
207
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
sativa)、玉米(Zea mays)、毛果杨以及其它一些植物中
的靶基因具有 ARF家族成员的功能，该转录因子家
族可通过与启动子序列上的生长素响应元件特异性
结合而调节生长素响应基因的表达；而且 miR160对
该类型转录因子表达的负调控对于调节植物种子发
芽、后萌芽期发育以及控制根冠形成等方面有重要
的作用(Liu et al., 2007; Wang et al., 2005)。据此可认
为，在低温胁迫下，甜杨 miR160a和 miR160e表达量
的明显增加，可能会导致细胞内 ARF水平的降低而
减少生长相关基因的表达，最终通过延缓生长速度
来增强甜杨植株抵御低温胁迫能力。另外，SPL是一
类在植物中调控 SQUA类基因表达的转录因子，其
表达则可受到另一个保守性 miRNA成员 miR156的
负调控；有关研究表明，miR156在拟南芥和水稻中
分别过量表达均可导致植株花期延迟以及形态多样
化等现象的发生(Schwab et al., 2005; Xie et al., 2006)，
而 miR156表达量的减少则可相应增加 SPL基因的
表达量，这对于拟南芥等一年生草本植物而言，可使
图 4半定量 RT-PCR检测甜杨幼苗在低温处理不同时间叶片中 miRNAs的表达
注:以 5.8S rRNA作为内参,并将对照组 miRNA的相对表达量设为 1;图中所示数据为 3次 PCR重复实验所得结果的平均值
Figure 4 Semi-quantitative RT-PCR detected the expression of miRNAs in leaves of cold stress treated seedlings
Note: 5.8S rRNA was selected as control and the normalized miRNA in leaves without treatment were arbitrarily set to 1; The present-
ed data were mean values for three PCR replicates with a single reverse transcription reaction
208
甜杨低温响应 microRNAs的克隆与分析
Cloning and Analysis of the Low Temperature Stress-Responsive miRNAs from Populus suaveolens
植株提前进入生殖生长期而避免寒冷环境对其造成
的危害(Wang et al., 2009)。由此可推测，甜杨在低温
胁迫下其 miR156a和 miR156g表达水平的下调可能
是植物体通过调节营养生长和生殖生长之间平衡而
达到提高自身抗性的一种方式。
许多研究表明，miR164可通过调控包含 CUC1、
CUC2 和 NAC1 等成员的 NAC-domain 转录因子家
族的表达来控制植株侧根生长、腋生分生组织形成、
叶缘锯齿化和老化诱导的叶片细胞死亡等生理过
程，而且其表达量的提高可产生削弱生长素信号的
效应，进而增强植株适应低温环境的能力(Guo et al.,
2005; Kim et al., 2009; Nikovics et al., 2006; Raman et
al., 2008)。值得注意的是，miR164a在甜杨幼苗正常
植株中的表达量极低，而经低温胁迫后其表达水平
有较大幅度的提高，由此可认为，甜杨 miR164a与低
温胁迫密切相关，可能作为关键调控基因而在甜杨
的低温胁迫应答反应中发挥重要作用，但其功能和
作用机制有待于进一步研究。
3材料与方法
3.1植物材料与处理
甜杨组培苗为北京林业大学林木育种国家工程
实验室培养保存，组培体系参照已有方法(林元震等,
2004)，培养温度 25℃，光照 16 h/d，光照强度 2 200 lx。
选取生长期为 90 d 的完整幼苗为试材，将其置于
0℃低温生化培养箱中分别处理 0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、
24 h和 48 h，每组处理进行 3次重复，处理结束后收
集叶片并在液氮中速冻保存用于 RNA提取。
3.2引物设计与 PCR扩增
以毛果杨基因组序列(JGI: http://genome.jgi-psf.
org/Poptr1/Poptr1.home.html)为引物设计的模板，在包
含 Ptc-miRNA前体基因座的序列两端设计引物(表 1)。
采用 CTAB法提取甜杨幼苗基因组总 DNA并以其
作为模板进行 PCR扩增，扩增产物经回收和纯化后连
至 pGM-T载体进行转化、筛选，并由北京金唯智生
物技术有限公司完成测序。基因克隆所用的 Taq
DNA Polymerase、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、
pGM-T克隆试剂盒以及 DNA分子量标准均购自北
京天根生化科技有限公司，引物由上海生工公司合成。
3.3甜杨 miRNA基因序列比对与二级结构预测
应用 DNAMAN Version 6.0对所获甜杨 miRNA
基因序列与已知毛果杨序列进行相似性比对，并利
用 http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi 网
站提供的 Mfold在线分析软件按其默认参数预测以
上序列的二级结构。
3.4甜杨 RNA的提取和半定量 RT-PCR
总 RNA 提取按照 Invitrogen 公司的 TRIzol
reagent试剂盒说明进行。成熟体 miRNAs的半定量
分析参照 RNA加尾和引物延伸 RT-PCR法(Shi and
Chiang, 2005)，其主要操作步骤为：首先利用 Poly (A)
Polymerase (NEB, USA)对 RNA的 3末端进行加尾
反应，加尾后的 RNA经酚 /氯仿抽提、醇沉后溶于适
量无 RNA酶的 H2O中，然后利用 EasyScript reverse
transcriptase进行反转录合成 cDNA链，反转录引物
采用 oligo (dT) 3 RACE adaptor [5-GCGAGCACAG
名称
Name
miR156a
miR156g
miR160a
miR160e
miR164a
miR168a
miR168b
miR390a
miR393a
miR394a
miR475a
miR476a
正向引物(5-3)
Forward primer (5-3)
CCACGCCCCAACCTAAAA
CAAGCATTCGGTAAAGAAATCAAAC
GGCAAGACCTGTAGAATCAAAGC
GAAAAGCATCATTTATTCGTGTC
AACATCAAGTAAATGCCTGCCCG
TTCGTACAAGCGATTATTTCTTTCC
ATCTAACGCTGCTGCCTCTGCT
AAAAACCGTCCCTCTCCACA
AGATTTTAGTCGGTGTTGGGGCA
GTAAGGACCAGAAGCTGCCAGT
TTTGGCTGGTTATTAGGGTG
ACTGAAACCCTACCCAACACTC
反向引物(5-3)
Reverse primer (5-3)
TGAAATGAACCCGCCAAA
CCCTAGCTCTATTATGGATACGC
CTAAGTGGGAATCGAATCATCAAA
TTTCACCTTACAGATTCATCCATA
TATCTCTTCCCCATCTCCCTCCC
TCTCCCAGACACCTAACCACCA
CCCTCATCCCTCACCAATACCT
ACACCCAGAAGCCAACAACC
ATGAGAAGGGCGAGTGTGTGGAG
CCCCCATGTGTAGTCTCCAAAG
TTAGCGGAGGTTGTGTTCTT
TGCTGTATTCACTTTAGCCCAC
表 1 miRNA基因克隆引物
Table 1 Primers used for miRNA genes cloning
209
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
AATTAATACGACTCACTATAGG (T) 12VN-3; Am-
bion, USA]。PCR扩增选取成熟体 miRNA序列作为
上游引物，3-RACE outer primer (5-GCGAGCACA
GAATTAATACGAC-3; Ambion, USA)作为下游引
物，内参选取甜杨 5.8S rRNA (上游引物为 5-GTCT
GCCTGGGTGTCACGCAA-3)，反应均采用 Hot start
Taq Polymerase (TaKaRa, Dalian)进行 3 次重复。扩
增产物经克隆测序验证其特异性，并应用 BandScan
Version 5.0软件(Glyko, Novato, CA)通过琼脂糖凝胶
电泳图谱对其进行浓度分析。
作者贡献
通讯作者林善枝负责本研究的实验设计及安排，
第一作者孙润泽负责本论文整个实验的具体实施及分
析工作，其他作者均参与了本实验的具体实施工作。
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Call for Papers—Molecular Pathogens
(ISSN 1925-1998)
Molecular Pathogens (ISSN 1925-1998) is an open access, peer reviewed
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significantly advance the understanding of molecular pathogens.
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tion of pathogens, genome structure and functional analysis, gene expression
and regulation, model host organisms, pathogenesis, virulence factors, pathog-
ens and human health, and genetic improvement of pathogens and its applicat-
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