全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-05-12
基金项目：江苏省卫生厅科研资金资助课题（H200625）
作者简介：朱威（1984-），男，硕士研究生，研究方向：分子药理、生物信息；E-mail：erving118@126.com
通讯作者：金坚（1960-），男，教授，博士生导师，长期从事分子药理学的研究；Tel：0510-85918220，E-mail：Jinjian31@126.com
羟基喜树碱（10-Hydroxyl camptothecine，HCPT）
是从我国特有山茱萸目珙垌科植物喜树（Camptoth
eca acuminata Decaisne）中分离得到的 20 多个单体
中抗癌作用最强的生物碱 [1]。 HCPT 具有较广的抗
瘤谱， 对多种肿瘤细胞株及移植瘤有较高的抑制
率，在与其它抗癌药物、放疗及热疗的联合应用方
面， 亦成为受到广泛重视的新热点。 HCPT 药物托
泊替康已被 FDA 批准用于肿瘤治疗 [2]。
目前已经阐明的 HCPT 的抗癌机制之一是其
通过与拓扑异构酶 I-DNA 复合物结合从而阻止
DNA 的重新连接来抑制拓扑异构酶 I[2]。 但是迄今
为止，HCPT 的作用机制尚未被完全解析， 喜树碱
类药物抗癌治疗中出现的 p53 高表达、myc 途径调
控以及 HCPT 对不同肿瘤细胞的疗效有显著差异
等均无法由拓扑异构酶抑制机制解释 .已有的研究
结果提示其抗癌作用是多因素的 [2~4]。 且肿瘤细胞
对 HCPT 的先天和临床获得性耐受机制还不清楚，
严重地影响着其临床疗效 [2]。 同时，HCPT 存在骨髓
抑制和消化道毒性，这两种不良反应的发生率和强
度随着用药剂量的上升呈线性增加，其毒理机制尚
未明确 [5]。有必要对 HCPT 的抗癌机制、耐受机制和
毒理机制进行进一步的研究。拟通过噬菌体展示技
术和生物计算分析等方法来解析 HCPT 结合肽，为
进一步寻找并分析 HCPT 结合蛋白质及其结合作
用位点 ，从而为研究 HCPT 的抗癌机制 、耐药机制
以及毒理机制提供帮助。
羟喜树碱结合肽的研究
朱威 1，2 张莲芬 2 雷楗勇 1，2 顾健德 3 金坚 1，2
（1江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122；2江南大学医药学院分子药理学研究室，无锡 214122；
3中国科学院上海药物研究所，上海 201203）
摘 要： 酯化脱水法制备生物素化羟喜树碱，使用 Resourse15 反相柱纯化，液质联用分析确证。 磺酰罗丹明 B 染
色法鉴定生物素化羟喜树碱的抗癌活性。采用噬菌体展示技术筛选得到 14条羟喜树碱结合肽。构建并优化了羟喜树碱结
构模型。构建并通过分子动力学优化了羟喜树碱结合肽结构模型。使用分子对接验证并分析了羟喜树碱结合肽与羟喜树
碱的结合作用。
关键词： 羟喜树碱 结合肽 噬菌体展示 分子动力学 分子对接
Research on HCPT Binding Peptides
Zhu Wei1，2 Zhang Lianfen2 Lei Jianyong1，2 Gu Jiande3 Jin Jian1，2
（1The Key Laboratory of Industry Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122；2Laboratory of
Molecular Pharmacology，School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122；3Shanghai Institute of
Materia Medica，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203）
Abstract： Biotin-HCPT compound was synthesized by means of esterification-dehydration，purified with
Resourse15 reversed-phase column and conformed by LC-MS. The anti-cancer activity of Biotin-HCPT was analyzed by
SRB method. Fourteen HCPT binding peptides were identified by phage display. Structure models of HCPT binding
peptides were built and then optimized by molecular dynamics. The binding effect between HCPT binding peptides and
HCPT was verified and analyzed by docking.
Key words： 10-Hydroxyl camptothecine（HCPT） Binding peptide Phage display Molecular dynamics Dock
2009年第 1期
1 材料和方法
1.1 材料
随机十二肽噬菌体展示文库为美国 New Eng-
land Biolabs 公司产品；亲和素磁珠和磁力收集器均
为美国 Promega 公司产品 ；AKTA 中低压液相系统
为瑞典 Amersham Pharmacia Biotech 公司产品；酶标
仪 Multiskan MK3 为上海 Thermo Labsystems 公司产
品；羟喜树碱原料药 （C20H16N2O5，分子量：364.35）为
泰华天然生物制药有限公司产品；4-二甲氨基吡啶
（DMAP）、1，3-二环己基碳化二亚胺 （DCC）为上海
延长生化科技发展有限公司产品 ；HCPT 耐药的人
乳腺癌细胞株 MCF-7/Tb 为本实验室建株 [6]；RPMI
1640 为美国 Gibco 公司产品； 胰蛋白酶 、DMSO 和
小牛血清为华美生物工程公司产品；生物素为美国
Sigma 公司产品；琼脂糖为美国 BBI 公司产品；其它
试剂均为国产分析纯级。
InsightII 2005 软件为 Accelrys 公司产品 ；ICM-
Pro v3.5-0a 软件为 Molsoft 公司产品 ；Guassian03 软
件、Guassian Viewer 软件为 Guassian 公司产品 ；Hy-
perchem8.0 软件为 HyperCube 公司产品。神威 2000
A 超级计算机为无锡超级计算中心提供。
1.2 方法
1.2.1 生物素化羟喜树碱的制备
1.2.1.1 生物素化羟喜树碱的合成 将 2.445 mmol
羟喜树碱 、168 mg DCC （羧基活化剂 ） 和 10 mg
DMAP（酯化反应催化剂 ）溶于 10 ml 混合溶剂 （干
燥二氯甲烷：甲酰二甲胺 = 9 ∶1）中 ，搅拌均匀后滴
加含 0.815 mmol 生物素的甲酰二甲胺溶液， 避光，
4℃反应 24 h。
1.2.1.2 生物素化羟喜树碱的纯化 在 AKTA 中
低压液相系统中采用 Resource15 反相柱以如下条
件进行纯化分离：A 液：水，B 液：体积分数为 0.3 的
甲醇、 体积分数为 0.7 的乙腈。 洗脱梯度：A 液洗
（2CV）、B 液 0%~100% （20CV）、100%B 液 （5CV），
检测波长：358 nm。 洗脱流速为 1.0 ml/min。
1.2.1.3 生物素化羟喜树碱的液质联用检测 生
物素化 HCPT （Biotin-HCPT）经制备型 sunfire C-18
（2.1×250 mm）色谱柱层析分离，LC/MS 鉴定。 HPLC
条件： 保持柱温 35℃， 流速 0.3 ml/min， 进样量 5
μl，流动相甲醇-水- 10%甲酸梯度洗脱。 MS 条件：
毛细管电压 4.20 kV， 锥孔电压 30 V， 离子源温度
100℃，脱溶剂气温度 250℃，流速 4.3 L/h。
1.2.1.4 生物素化羟喜树碱的药物活性鉴定 采
用磺酰罗丹明 B（Sulforhodamine B，SRB）染色法分
别检测 HCPT 和 Biotin-HCPT 对 MCF-7/Tb 细胞的
生长抑制的活性 [7]。 于 96 孔板每孔接种 5×103 个细
胞 ， 培养 24 h 后加入不同浓度的 HCPT 或 Biotin-
HCPT，每个浓度设 4 个复孔，培养 72 h。 SRB 法细
胞染色 ，酶标仪测量 A540，按 （1）计算抑制率 ，通过
比 较 HCPT 和 Biotin-HCPT 的 IC50， 判 断 Biotin-
HCPT 的药物活性。
细胞生长抑制率=对照孔 A 值-加药孔 A 值
对照孔 A 值
×100%
1.2.2 噬菌体展示筛选羟喜树碱结合肽
1.2.2.1 亲和素磁珠的包被 将标有亲和素的磁
珠转移到 1 ml 离心管中，TBS（pH＝7.5）洗涤磁珠 3
次后 ， 加入 600 μl 0.2 nmol/ml 的 Biotin-HCPT，避
光，4℃，轻柔晃动过夜。 用磁力架分离得到包被有
Biotin-HCPT 的亲和素磁珠。
1.2.2.2 随机十二肽噬菌体展示文库的筛选 ①
以 1 ml 0.5%BSA 封阻液封闭包被有 Biotin-HCPT
的亲和素磁珠 12 h， 去除封阻液， 使用 0.1%TBST
缓冲液 （TBS+体积分数为 0.001 的 Tween-20）洗涤
磁珠 6 次。② 去除洗涤液，在磁珠中加入以 500 μl
0.1% TBST 缓 冲 液 （TBS +体 积 分 数 为 0.001 的
Tween-20） 稀释的 10 μl 随机十二肽噬菌体展示文
库，温和震荡，室温反应 60 min。 ③ 去除未结合的
噬菌体，使用 0.1%TBST 缓冲液洗涤磁珠 10 次。④
去除洗涤液，加入 400 μl 0.2 mol/L Glycine-HCl（pH
2.2）、1 mg/ml BSA 的洗脱液洗脱收集结合的噬菌
体 ，用 80 μl 1 mol/L Tris-HCl （pH 9.1）调 pH 至中
性 。 ⑤ 将中和后的洗脱液加入与包被有 Biotin-
HCPT 的亲和素磁珠等量的空白亲和素磁珠中 ，温
和震荡，室温反应 60 min。 ⑥ 分离收集未与空白亲
和素磁珠结合的噬菌体。 以 200 μl 0.5%TBST 缓冲
液洗涤磁珠 2 次。将洗涤液合并入未与空白亲和素
磁珠结合的噬菌体液中。 ⑦ 将合并所得噬菌体液
加入与包被有 Biotin-HCPT 的亲和素磁珠等量的生
物素化亲和素磁珠中，温和震荡，室温反应 60 min。
⑧ 分离收集未与生物素化亲和素磁珠结合的噬菌
朱威等：羟喜树碱结合肽的研究 127
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
体。 以 200 μl 0.5%TBST 缓冲液洗涤磁珠 2 次。 将
洗涤液合并入未与生物素化亲和素磁珠结合的噬
菌体液中， 此即为第一轮筛选所得噬菌体。 ⑨ 按
New England Biolabs 公司随机十二肽噬菌体展示文
库说明书进行噬菌体滴度测定以及对筛选所得噬
菌体进行扩增。 ⑩ 重复步骤①～④对前一轮筛选所
得噬菌体进行进一步筛选直至噬菌体的投入与回
收比率稳定。其中第二轮筛选采用 0.3%的 TBST 缓
冲液作为洗涤液， 此后的每一轮筛选均采用 0.5%
的 TBST 缓冲液作为洗涤液。
1.2.2.3 噬菌体 DNA 的提取和序列测定 噬菌体
的投入与回收比率达到稳定后，从最后一轮保存的
平板上， 用牙签随机挑选 25 个分离良好的蓝色单
菌落，抽提 DNA。 以 0.7%的琼脂糖凝胶，100 V 电
压电泳检测。 噬菌体 DNA 测序工作由上海生工公
司完成。
1.2.3 羟喜树碱结合肽的计算分析
1.2.3.1 羟喜树碱结构模型的建立与优化 使用
hyperchem8.0 软件构建羟喜树碱的结构模型。 再使
用 hyperchem8.0 软件对羟喜树碱结构模型进行最
陡下降法结构优化 ， 收敛标准 RMS gradient 设为
0.1 kcal/mol， 力场设为 MM+ forcefield。 然后在 hy-
perchem8.0 软件中通过共轭梯度法对羟喜树碱结
构模型进行进一步的结构优化，收敛标准 RMS gra-
dient 设为 0.01 kcal/mol，力场设为 MM+ forcefield。
通过 Guassion Viewer 软件将羟喜树碱结构优
化结果数据转换为 Guassian03 软件读取数据。 使用
Guassian03 软件对羟喜树碱结构模型进行进一步
优化，命令设置为 #p B3LYP/6-31G（d）opt，freq。 使
用 Guassian03 软件对羟喜树碱结构模型进行虚频
检验。
1.2.3.2 羟喜树碱结合肽结构模型的建立与优化
使用 InsightII 2005 软件对 14 条羟喜树碱结合
肽进行了建模。 使用 InsightII 2005 软件 Discover3.0
模块对羟喜树碱结合肽模型进行最陡下降法结构
优化，设置最大优化步数 50 000 步，收敛标准 Final
convergence 设为 0.0001，力场设为 cvff forcefield。
使用软件 Discover3.0 模块对羟喜树碱结合肽
模型进行 15 000 步的分子动力学模拟平衡计算 ，
起始温度设为 298 K，模拟温度设为 1 000 K，步长
1 fs，力场设为 cvff forcefield。
使软件 Discover3.0 模块对羟喜树碱结合肽模
型进行 150 000 步的分子动力学模拟计算，模拟温
度设为 1 000 K，步长 1 fs，力场设为 cvff forcefield。
寻找羟喜树碱结合肽的最稳定构象。
1.2.3.3 羟喜树碱与羟喜树碱结合肽的分子对接
计算 使用 ICM-Pro v3.5-0a 软件将羟喜树碱结合
肽模型与羟喜树碱模型进行了分子对接模拟计算。
使用 ICM-Pro v3.5-0a 软件对分子对接模拟计算结
果进行了分析评估并使用 hyperchem8.0 软件对分
子对接模拟计算结果进行了结合能计算。
2 结果与讨论
2.1 生物素化羟喜树碱的制备与鉴定
采用酯化脱水法合成 Biotin-HCPT，由于 HCPT
含有 2 个可参加反应的羟基，为了尽可能保留羟喜
树碱的抗癌药物活性， 在反应体系中加了过量的
HCPT 以得到 HCPT 和 Biotin 按 1 ∶1 比例连接的
Biotin-HCPT。 经纯化， 过量的 HCPT 和合成的 Bi-
otin-HCPT 得到很好的分离 （图 1）。 合成转化率约
为 30% 。 经 HPLC 检测 ，Biotin-HCPT 的峰纯度为
92.7％（图 2）。Biotin-HCPT（1∶1 连接）的理论分子量
为 590.5 g/mol，MS 分析结果为 589.5 （M-1），591.5
（M+1），625.5（M+Cl），与理论值一致（图 3）。 HCPT
和 Biotin-HCPT 对 MCF-7/Tb 的 IC50 值相近 ，分别是
2.24 nmol/ml 和 5.74 nmol/ml，说明生物素化合成反
应对 HCPT 活性影响不大（图 4）。 采用人乳腺癌细
胞系 MCF-7 的 HCPT 与紫杉醇交叉耐药细胞株
MCF-7/Tb进行药物活性检测 [6]，证明 Biotin-HCPT 仍
图 1 生物素化羟喜树碱的纯化分离色谱图
128
2009年第 1期
能保持相当的抗癌活性，对交叉耐药细胞株依然具
备一定的疗效， 显示 Biotin-HCPT 是良好的研究材
料，且所得数据亦可用于多药耐药研究。
2.2 羟喜树碱结合肽的筛选与测定
经过 5 轮筛选，噬菌体的投入与回收比率已达
稳定（表 1）。 经序列测定，得到 14 个具有 HCPT 高
亲和力的 HCPT 结合肽（表 2）。 在第 1 轮筛选中通
过将从包被有 Biotin-HCPT 的亲和素磁珠上筛选洗
脱下来的噬菌体与等量的空白亲和素磁珠以及生
物素化亲和素磁珠孵育结合的步骤剔除了干扰结
合肽。
2.3 羟喜树碱与羟喜树碱结合肽的计算分析
经计算分析验证， 实验所得 14 条羟喜树碱结
合肽均能与羟喜树碱发生强结合相互作用（表 3）。
部分羟喜树碱结合肽与羟喜树碱的结合构象如图
5 所示。 为寻找并分析 HCPT 结合蛋白质及其结合
作用位点从而研究阐明 HCPT 的抗癌机制、耐药机
制以及毒理机制奠定了基础。
图 2 纯化产物的 HPLC 分析色谱图
图 3 生物素化羟喜树碱的阴离子、阳离子质谱图
图 4 Biotin-HCPT 和 HCPT 对 MCF-7/Tb
细胞生长的影响
1g[Concentration μmol·L-1]
n
-20
pfu
pfu
1 0.1 10 1.02×10 1.02×10
2 0.3 10 1.15×10 1.15×10
3 0.5 10 1.59×10 1.59×10
4 0.5 10 1.81×10 1.81×10
5 0.5 10 1.83×10 1.83×10
表 1 亲和筛选对噬菌体的富集
1 SGHQLLLNKMPN 8 HAAMPPQAISSV
2 SPYPSWSTPAGR 9 SYLAPASRTYVT
3 SNTSAVPQSRSS 10 DPFPQRVNYLKR
4 LLADTTHHRPWT 11 HPSHMAMDRSQP
5 TAPLPNTLNSRL 12 VITENTHPPRSP
6 QSNHPWMGPALL 13 DTSSLMPTNALP
7 SLDSMSPQWHAD 14 HPTLPNKPALPH
表 2 羟喜树碱结合肽序列
HCPT
(kcal/mol)
HCPT
(kcal/mol)
1 16.893 8 19.841
2 16.855 9 14.852
3 14.671 10 19.121
4 13.304 11 14.494
5 17.216 12 19.070
6 19.633 13 15.036
7 17.218 14 19.638
表 3 羟喜树碱与羟喜树碱结合肽结合能量表
（ 下转第 137页）
朱威等：羟喜树碱结合肽的研究 129
2009年第 1期
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（ 上接第 133页）
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图 5 部分 HCPT 结合肽与 HCPT 结合构象图
注：图中虚线表示氢键
转化子的数量不够，由于质粒基因文库的克隆数比
较大，必须筛选足够多的克隆才有可能得到阳性克
隆，通常需要筛选 2 000~3 000 个克隆。
3 结论
不吸水链霉菌基因文库的构建为克隆梧宁霉
素生物合成基因簇奠定了基础。本实验室欲以本菌
株抗性基因作探针杂交筛选基因文库，步移克隆生
物合成基因簇， 通过序列测定和基因功能分析，进
一步在分子水平上定向改变菌株的次级代谢途径，
以得到高产菌株 ，提高梧宁霉素的效价 ，降低其成
本，使之得到推广使用。 虽然本实验暂时未能在此
基因文库中筛选出阳性克隆，但能为以后的研究工
作奠定一定的基础。
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