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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2010年第 2期
Chelex2100快速提取放线菌 DNA
作为 PCR扩增模板
周双清　黄小龙　黄东益　胡新文　陈吉良
(海南大学农学院 ,儋州 571737)
　　摘 　要 : 　旨在建立有效扩增 16S rRNA基因序列的放线菌 DNA快速提取的方法。采用 Chelex2100法提取放线菌 DNA,
使用 PCR扩增 16S rRNA基因序列评价提取核酸的质量。结果显示 , Chelex2100法能够在 10 m in之内从放线菌中快速提取
DNA,所提取的 DNA可以直接用于 PCR扩增反应 , PCR扩增产物电泳条带清晰 ,符合理论预期结果。因此 , Chelex2100法提取
放线菌 DNA可以作为 16S rRNA基因序列 PCR扩增的模板 ,该方法具有经济、简便、快速的特点 ,适合于放线菌菌株大规模地
筛选和分类鉴定。
关键词 : 　Chelex2100　放线菌 　DNA提取 　PCR　16S rRNA
A Rapid M ethod for Extracting DNA from
Actinomycetes by Chelex2100
Zhou Shuangqing　Huang Xiaolong　Huang Dongyi　Hu Xinwen　Chen J iliang
(Agronom y College, Hainan University, Danzhou 571737)
　　Abs trac t: 　To establish a rap id method for extracting DNA from actinomycetes, DNA was extracted from actinomycetes by Chelex2
100. The quality of the extraction by 16S rRNA gene was evaluated with PCR technique. The PCR p roduct of 16S rRNA gene was used
as a mark fragment. Results showed the Chlex2100 can quickly extract the DNA from actinomycetes about in 10 m in. The DNA can be
directly app lied to the following step2PCR amp lification as DNA temp late. Electrophoresis results of the PCR p roducts was clear. There2
fore, Chelex2100 extraction method could be an efficient and reliable method for PCR detection and used in actinomycetes screening and
identification rap idly.
Key wo rds: 　Chelex2100　Actinomycetes　DNA extraction　PCR　16S rRNA
收稿日期 : 2009211202
基金项目 :海南省高等学校博士生创新科研课题 (Hxwby2008207)
作者简介 :周双清 ,女 ,硕士生 ,研究方向 :应用微生物资源 ; E2mail: annizhou23@1261com
通讯作者 :黄小龙 ,博士 ,研究方向 :微生物资源 ; E2mail: hxl2012@163. com近年来 , 16S rRNA基因序列分析技术已广泛地应用于放线菌分类鉴定的研究中 , 16S rRNA分子普遍存在于各种原核生物细胞中 ,其基因既存在高度保守区域 ,也存在局部的可变区。这为设计特异性引物利用 PCR方法扩增 16S rRNA基因序列快速鉴别不同的菌群提供了条件。 PCR扩增的前提条件是提取较完整的 DNA ,有关放线菌 DNA的提取 ,国内外普遍采用酶法 [ 1 ]、物理法 (如 :液氮研磨、微波炉法等 ) [ 2, 3 ]以及化学法 [ 4 ]破除细胞壁 ,再与有机溶剂抽提相结合的办法 ,这些方法共同的缺点是操作 步骤繁琐 ,费时费力 ,菌体需要量大 ,效率低下 ,而且在提取过程中加入的酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂有损操作者健康 ,对周边环境会产生一定污染 ,同时也增加了 DNA提取的成本。因此 ,探索一种快速、高效且安全的 DNA提取方法 ,以用于放线菌菌株大规模地筛选和分类鉴定显得十分必要。本研究在综合分析各种 DNA提取方法的基础上 ,选取以 Chelex2100法提取放线菌 DNA作为 16SrRNA基因 PCR扩增的模板 ,以期得到特异性强、明亮清晰的 PCR条带 ,为有效、快速地对放线菌资源
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2010年第 2期
进行大规模分类鉴定研究奠定了基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　菌株 　选取 5个属的标准菌株 Am ycolatopsis
tolypom ycina JCM 4936T , N onom uraea rubra JCM
3389T , S treptom yces yatensis JCM13244T , N ocardia testa2
cea JCM 12235T , M icrom onospora endolith ica DSM
44398T作为参考菌株 ;其它菌株为本实验室从海南药
用植物分离的内生放线菌或根际土壤放线菌 (表 1)。
表 1　试验菌种
菌种 菌种号 GenBank登录号
Am ycola topsis tolypom ycina JCM 4936T AJ508241
N onom uraea rubra JCM 3389T AF277200
S treptom yces yatensis JCM13244T AF336800
N ocardia testacea JCM 12235T AB192415
M icrom onospora endolithica DSM 44398T AJ560635
Am ycola topsis sp. 308201 308201 FJ612595
N onom uraea sp. 310103 310103 FJ612593
S treptom yces sp. 30701 30701 EU556734
N ocardia sp. 10913 10913 FJ262976
M icrom onospora sp. 11009 11009 FJ216458
1. 1. 2　试剂 　Chelex2100和 PCR 所用的 2 ×Taq
PCR Masterm ix由北京天根生化科技有限公司提供。
16S rDNA 扩增用 PCR 引 物 ( 27F: 5′2AGAGTT
TGATCC TGGCTCAG23′; 1492R: 5′2GGTTACCTTGT2
TACGACTT23′)由海生工生物工程技术服务有限公
司合成。放线菌培养用 ISP2培养基。
1. 1. 3　仪器 　PCR仪是 PE29600型 PCR仪。电热
恒温水浴锅是天津民利科学器材厂的 YY910372
1999型恒温水浴锅。
1. 2　方法
1. 2. 1　菌体准备 　用无菌竹签从 ISP2固体培养基
上挑取绿豆大小的放线菌单菌落或少些菌苔于无菌
的 1. 5 mL Eppendorf管中备用。
1. 2. 2　Chelex2100法提取基因组 DNA　在装有菌
体的 Eppendorf管中加入 0. 5 mL 10% (w / v)的无菌
Chelex2100溶液 ,在旋涡混合器上振荡 5 s,沸水浴
10 m in;冷却至室温后 10 000 r/m in离心 10 m in,
- 20℃保存备用 (上清即可作为 PCR的模板 )。
1. 2. 3　16S rRNA基因扩增　将提取的基因组 DNA作
为模板进行 PCR扩增。50μL反应体系包括 1μL
DNA原液 , 25μL 2 ×Taq PCR Mastermix溶液 ,引物各 1
μL (20μM) , ddH2O 22μL。反应在 PE29600型 PCR仪
上进行 ,程序为 95℃变性 5 min, 94℃变性 1 min, 55℃
复性 5 min, 72℃延伸 1. 5 min进行 29个循环 , 72℃延伸
10 min。取 5μL PCR产物在 1%琼脂糖凝胶 80 V电
泳 , 260 nm紫外灯下观察并照相。
2　结果与讨论
选取放线菌 5个不同属的标准菌株 (Am ycola2
topsis tolypom ycina JCM 4936T , N onom uraea rubra JCM
3389T , S treptom yces ya tensis JCM 13244T , N ocard ia
testacea JCM 12235T ,M icrom onospora endolith ica DSM
44398T )和 5株从海南药用植物分离的放线菌菌株
(Am ycola topsis sp. 308201, N onom u raea sp. 310103,
S treptom yces sp. 30701, N ocard ia sp. 10913, M icrom 2
onospora sp. 11009) ,进行比较研究。结果如图 1所
示 ,所有菌株经 Chelex2100法提取的基因组 DNA作
为模板 ,都能够有效地进行 16S rRNA 基因序列
PCR扩增。扩增产物经电泳后检测 ,目的条带特
异 ,所有菌株均得到了 1 500 bp条带 ,并且产物量
大 ,可以直接用来测序和酶切等分析。
　　M. DL2000; CK. 水空白对照 ; 1 - 10分别为 Am ycola topsis
tolypom ycina JCM 4936T , N onom uraea rubra JCM 3389T ,
S treptom yces yatensis JCM13244T , N ocardia testacea JCM
12235T ,M icrom onospora endolithica DSM 44398T , Am ycola2
topsis sp. 308201, N onom uraea sp. 310103, S treptom yces sp.
30701, N ocardia sp. 10913, M icrom onospora sp. 11009
图 1　放线菌 16S rRNA基因 PCR扩增电泳图
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2010年第 2期 周双清等 : Chelex2100快速提取放线菌 DNA作为 PCR扩增模板
　　Chelex 100是一种由苯乙烯和苯二乙烯组成的
独特螯合树脂 ,可以高选择性地结合多价阳离子 ,去
除样品和缓冲液中的金属离子 ,避免煮沸过程中模
板 DNA的降解。目前广泛应用于医学微量血痕
DNA [ 5, 6 ]和血液制品污染细菌 DNA [ 7 ]提取 ,以及植
物转基因检测模板 DNA的制备 [ 8 ]。有学者也曾应
用 Chelex2100提取放线细菌基因组 ,并成功扩增出
16S rRNA基因 [ 9 ] ,但在丝状放线菌 DNA的提取方
面少有报道。本试验利用 Chelex2100煮沸法能快速
提取放线菌 DNA,使 16S rRNA基因的 PCR扩增更
加简便、省时和经济 ,在大规模快速筛选、鉴定放线
菌资源方面具有重要的意义。
参 考 文 献
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