全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
在体电脉冲基因导入技术研究进展
丁菲 1 徐宇虹 2
( 1上海交通大学生命科学与技术学院,上海 200240; 2上海交通大学药学院,上海 200240)
摘 要: 基因治疗是把 DNA或 RNA等外源物质输送到靶细胞, 以改善由于基因缺陷和变异引起的疾病,达到治疗目
的。有效的基因治疗依赖于外源基因高效而稳定的表达以及有效载体介导的基因输送。电脉冲介导的基因导入技术以其高
效率导入得到了广泛的应用,现就在体电脉冲基因导入技术的概况、装置、机理及应用作一综述。
关键词: 在体电脉冲 DNA疫苗 基因治疗 肿瘤治疗 免疫应答
Progress of in vivo Gene Transfer w ith Electroporation
D ing Fei
1 Xu Yuhong2
(
1
College of L ife Science and Technology, Shanghai J iaoT ong University, Shanghai 200240;
2
College of Pharmacy, Shanghai J iaoT ong University, Shanghai 200240)
Abstrac:t Gene the rapy is a technique to br ing foreign gene such as DNA or RNA into ta rget cells that use gene to treat or pre
vent diseases caused by gene d iso rder orm utation. Effic ient g ene therapy relies on the stab le express ion and transfection o f foreign gene.
In vivo e lectroporation is an e fficien t approach on gene therapy. Th is rev iew gave a overv iew of resea rch progress o f in vivo e lectropo ra
tion.
Key words: In vivo e lec tropotation DNA vaccine Gene the rapy Tum or therapy Immunoreaction
收稿日期: 20100421
作者简介:丁菲,女,硕士研究生,研究方向:肿瘤基因治疗; Em ai:l abbyfei88@ yahoo. com. cn
通讯作者:徐宇虹,女,博士生导师,研究方向:靶向药物输送,基因治疗; Em ai:l yhxu@ sjtu. edu. cn
大多数人体的重要疾病,如高血压冠心病糖尿
病等, 都是外界环境因素与人体本身的基因互相作
用所导致的某些基因或基因群结构与功能异常,或
是人类本身某些基因的遗传性缺陷或异常, 使这些
人群对某些环境因素特别敏感,从而增加了患病的
机率。基因治疗 ( G ene therapy ) [ 1]正是针对这种先
天或后天的基因异常,把 DNA或 RNA等外源物质
输送到靶细胞,提出纠正或取代异常基因,调整其功
能的新战略与新途径。电脉冲 ( e lectroporation)介导
的基因输送是实验室的常规方法, 可以大大提高局
部组织的基因导入效率, 被广泛应用于肿瘤基因治
疗和 DNA疫苗的研究中。与用病毒载体输送基因
相比, 其优势是能减小机体的免疫反应,降低病毒基
因整合入基因组的可能性,并且是一种清洁的、不会
污染环境的方法。
1 在体电脉冲基因导入
在体电脉冲导入技术,即将要导入的基因注射
入靶组织,并马上给予电脉冲刺激的方法。电脉冲
导入技术始于 1982年 [ 2] ,一直主要被应用于体外细
胞的转染,并已经成为实验室的常规方法, 1998年
日本科学家首次将电脉冲导入技术应用于体内基因
导入 [ 3] ,证明可以大大提高局部组织的基因导入效
率, 很快在体电脉冲基因导入技术就被应用于肿瘤
基因治疗和 DNA疫苗的研究中, 受到了广泛的关
注。它可以转染多种细胞, 使基因表达提高 10 -
1 000倍。治疗性的在体电脉冲基因导入可以用于
治疗肿瘤,通过提高或者降低蛋白的表达来调节其
功能或者改变疾病的症状, 也可以用来做疫苗或者
抑制某些基因的表达。在体电脉冲导入的靶位有肌
肉组织 [ 4]、肿瘤组织 [ 5 ]、皮肤组织 [ 6]、肝脏 [ 7]等。其
中最常用的是肌肉组织和肿瘤组织, 选择肌肉组织
作为靶组织是因为肌肉组织在体内所占比例很大,
约占 40%,而且外源基因可在肌肉中长期表达、分
泌,外源基因也不会因肌细胞的分裂而丢失。选择
2010年第 10期 丁菲等 :在体电脉冲基因导入技术研究进展
肿瘤组织作为靶组织则适用于原位治疗或者不能切
除的肿瘤,从而保留重要的组织功能。选择合适的
靶组织不仅使基因的导入比较方便, 而且可以使机
体引起有效的免疫应答而达到治疗的效果。
2 装置
目前, 生产电脉冲基因导入仪的公司主要有
Inov io和 Ichor。在体电脉冲导入的装置主要有
M edPulser
DNA导入系统 [ 8] ,转基因仪 [ 5, 9- 11] , 活体
电转化仪 CUY21[ 12, 13]以及上海交大自主研制的药
物导入仪 Teresa等。
其中, M edPulser DNA导入系统最为著名, 它
已通过美国 FDA认证, 现已广泛应用于临床治疗
中。针对不同应用部位及目的有所不同的 M ed
Pu lser
DNA导入系统,应用于肿瘤的 MedPu lser装
置电压范围在 400- 1 500 V /cm, 脉冲时间 99 s;
应用于肌肉组织的 M edPulser装置电压范围在 50
- 250 V /cm, 脉冲时间 60 s ( www. genetron ics.
com )。各种型号的转基因仪 ECM830, T820, T830,
可以应用于肌肉组织和肿瘤组织的基因导入。日本
NEPA GENE公司的活体电转化仪 CUY21可以精确
的控制电压,以 0. 1 V为单位调节,也得到了广泛的
应用。
根据试验和临床的需要, 可选用不同的电极。
体内电穿孔技术主要使用以下电极:针式电极 ( nee
dle e lectrodes) ,回形电极 ( meander e lectrodes) , 平板
电极 ( ca lliper electrodes)和钳式电极 ( tw eezers rode
electrode) , 其中针式电极通常包括双针电极和六针
电极, 双针电极一般用于鼠等小动物,六针电极一般
用于猪等大型动物。
电脉冲的导入效率与许多因素有关, 电场强度、
脉冲持续时间、脉冲次数、脉冲频率、注射体积及注射
速度、溶液成分、质粒的大小和形态、作用的基因和受
作用对象的不同都能使导入效率有很大的改变。选
择适合的试验参数可以提高基因导入的效率, M ir
等 [ 14]采用低电压 ( 100- 300V ),长脉冲 ( 4- 50m s),
V icat
[ 15]采用高电压 ( 400 - 1 200 V /cm ) , 短脉冲
( 95- 300 s)都能使 DNA表达效率提高 500倍
以上。
3 机理
细胞膜是细胞的一道重要屏障, 负责细胞内外
物质与信息的交换。一般公认的细胞电穿孔导入首
先作用在细胞膜上,通过电场作用使细胞膜暂时出
现微孔,使细胞瞬间吸收一些不易通过细胞膜的物
质如化疗药物、DNA片段以及生物活性分子等。细
胞内外分子交换显著增加,这些物质透过微孔,进入
细胞内部发挥生物效应。在合理控制电脉冲各参数
(幅度、脉宽、脉冲数、持续时间等 ) 的条件下, 质膜
的电穿孔是可逆的, 一般持续较短的时间 (几秒钟
至数分钟 ) 。取消电场后, 膜能自行修复闭合而不
会对细胞造成任何影响。
目前,在体电脉冲导入 DNA的分子机制仍然不
清楚 [ 16]。对于电脉冲基因输送的机理一般认为是
一个两步的过程: 首先是在细胞质膜上形成亲水性
的孔,增加了细胞质膜的渗透性; 其次是 DNA在电
泳的作用下进入细胞。
肌肉组织通常作为首选的靶组织。肌肉组织的
生命周期长,操作方便, 占身体的面积大,并且骨骼
肌由成千上万条柱状纤维成束组成, 含有丰富的血
管和神经纤维淋巴管, 具有丰富的血液循环系
统 [ 17]。因此,骨骼肌及其附近产生的各种分子都可
以轻易进入血液循环中。许多基因都被成功导入骨
骼肌中并在体内长期表达 [ 18- 20]。基因表达在前面
的几天随着时间推移增加, 然后稳定下来 [ 21] , 表达
可持续一年 [ 19]。
本实验室前期的研究致力于探究基因在骨骼肌
中长效表达的机制,一般认为,是由于电激使未分化
好的多核的骨骼肌细胞在分化的过程中吞噬 DNA。
肌肉损伤随着电激的持续时间增长而加重 [ 22] ,
肌肉损伤开始于质粒 DNA到达胞内并表达 [ 23]。组
织学研究证实肌肉电激后最大损伤在最初的 7 d。
电激的中心区域, 显示大量坏死的纤维和浸润的炎
症细胞,很快卫星细胞就开始重建骨骼肌细胞, 到 3
个星期,肌肉完全恢复 [ 24]。
Peng等 [ 18]认为, 在体电脉冲导入 DNA将作用
区域骨骼肌的肌束膜和肌内膜击穿, 对骨骼肌造成
一定程度的损伤,引起大量单核细胞 /巨噬细胞等炎
症细胞浸润,这些细胞吞噬肌细胞或者 DNA后表达
抗原,提呈抗原并致敏免疫系统,使机体产生反应。
早期的表达 ( 3- 5 d)是由于成熟肌肉细胞被转染,
但是大部分这些细胞由于电激的损伤会在 2周内死
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
亡,使基因短暂的表达, 电脉冲输送 DNA的方法转
染了骨骼肌中的卫星细胞, 激活的卫星细胞分化成
新生的肌细胞,也可长时间维持抗原的表达 [ 24]。
4 应用
4. 1 在体电脉冲在 DNA疫苗中的应用
DNA疫苗是将含有编码抗原基因的表达质粒
DNA,经过接种体内后,可被体细胞摄取并转录、翻
译、表达出相应的抗原,然后通过不同途径刺激机体
产生针对此种抗原的免疫应答,通常不需要任何化
学载体,又称为裸 DNA疫苗。
如何提高 DNA疫苗的体内转染效率是目前
DNA疫苗研究中亟待解决的问题, 在体电脉冲基因
导入技术通过外加电场作用提高了 DNA的体内转
染效率,更好地刺激机体产生保护性的免疫应答,因
此在 DNA疫苗的研究中,在体电脉冲显示出较大的
实际应用价值。Gustaf等 [ 8]将丙型肝炎基因注射入
小鼠骨骼肌,并给予电脉冲刺激,蛋白的表达量大大
增多, 表达时间延长, 并伴随着 CD3+ T细胞的浸润。
Zhao等 [ 25 ]的研究证实了电脉冲导入 DNA疫苗,增
强了抗原抗体以及 T细胞反应。
在体电脉冲可以看作 DNA疫苗的佐剂,起着增
强核酸疫苗免疫原性的作用。之前我们提到的在体
电脉冲导入骨骼肌,引起大量单核细胞 /巨噬细胞等
炎症细胞浸润,这些细胞吞噬肌细胞或者 DNA后表
达抗原, 提呈抗原并致敏免疫系统,使 DNA的免疫
原性增强 [ 18]。学者们研究发现, 利用电脉冲导入
H5N1禽流感 DNA疫苗, 能够有效增强机体对于
DNA的提呈,在试验中动物针对不同抗原表现出广
泛的免疫应答 ( http: / /new sw ire. rockefe ller. edu /?
id= 824&page= eng ine& printer= 1)。同样, 在体电
脉冲导入技术在 H IV病毒的 DNA疫苗的研究中也
占有一席之地,在美国纽约 40名健康志愿者接受了
试验,证明利用电脉冲导入的方法极大地增强了针对
DNA 疫苗的免疫反应 ( http: / /www. businessw ire.
com /porta l/ site/home /perma link /? ndmV iew Id= new s
_view& new sId= 20091130005065& new sLang= en)。
4. 2 在体电脉冲在药物输送中的应用
在体电脉冲可应用于提高药物的输送效率。第
一个使用电脉冲输送药物的是 Ok ino等 [ 26] , 他们用
博来霉素减小小鼠肝肿瘤体积。博来霉素是一个
1. 5 kD的糖肽, 它可以导致 DNA链断裂。博来霉
素通过质膜时不稳定,如果不通过电脉冲刺激使细
胞空隙增大则对肿瘤细胞的毒性非常小,使用电刺
激和不使用电刺激,其对肿瘤细胞的毒性相差 1 000
倍以上,电脉冲诱发了暂时的血管收缩,使药物能够
留在肿瘤组织中 [ 27]。博来霉素对肿瘤组织的毒性
大于正常组织 [ 28 ] , 可以用于静脉内或者肿瘤内注
射, 研究证明它对黑色素瘤、头颈癌、肺癌、乳腺癌、
肾癌等都有很好的治疗效果, 在二期和三期临床中
已有完全康复的报道 [ 27]。
4. 3 在体电脉冲在肿瘤治疗中的应用
大多数的研究证明直接的电脉冲介导的质粒输
送可以显著抑制肿瘤生长, 说明输送的基因可以作
为抗肿瘤的药物。电转染编码 IL12质粒对黑色素
瘤 [ 29]及鳞状细胞癌 [ 30]有明显的治疗作用。肌肉内
电转不同的质粒或者 TIMP4, IL12, IFN , GHRH
的 cDNA以及 vasostatin也能减缓肿瘤生长的速度
和提高生存率 [ 31 - 35]。目前,电脉冲介导的基因输送
在试验中最成功模型是输送 IL12和 IFN, 电脉冲
介导的编码 IL12 cDNA的质粒治疗黑色素瘤已经
进入临床试验阶段 [ 29]。
一些类型的肿瘤,如黑色素瘤、头颈肿瘤应用原
位肿瘤内治疗 [ 36 ]。肌肉内电脉冲转染 IL23, 抑制
纤维肉瘤的生长 [ 12]。 Lucas和 He ller[ 37]将编码 IL
12的质粒注射入小鼠腓肠肌,系统 IL12表达了 21
d,分泌的 IL12抑制了 50%的皮下肿瘤, 极大延长
了试验动物寿命。
在体电脉冲在其它许多领域也有着广泛的应
用, 可导入 RNA i使基因沉默 [ 9] , 可用于造小鼠疾病
模型 [ 13]。它已成为了成熟的试验手段,在各方面的
研究中发挥着作用。
5 展望
在体电脉冲基因导入技术为各种科学研究及疾
病治疗提供了方法学的支持, 尤其是为近年来爆发
的禽流感以及一些疑难疾病的治疗中提供了行之有
效的方法。但是它的应用也有局限性,它是一种侵
入性的疗法,会造成靶部位的损伤,并且其主要作为
辅助手段用来配合或者增效各种治疗疾病的方法,
其分子机理并没有十分明确。电脉冲导入技术引起
机体各方面的免疫应答, 其本身对机体的影响以及
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对免疫系统的影响还有待研究。尽管如此, 在体电
脉冲导入技术在科学研究、疾病治疗方面有着广泛
而光明的应用前景。
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