全 文 ：增强 DNA疫苗免疫应答的新进展
周璨林
张富春*
(新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室,新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐
830046)
摘
要:
DNA 疫苗为编码抗原蛋白的真核表达载体, 注入体内后在原位表达所编码的抗原并诱导免疫应
答,在预防感染、治疗自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤等疫病中有着很好的应用前景。但与灭活疫苗相比, 其
免疫效价还比较低。有多种策略能够增强或调节 DNA 疫苗诱导的免疫应答,其中,作为外源基因载体的质粒的组
成及插入的有关基因均可直接或间接地影响免疫反应的效果, 在构建 DNA 疫苗质粒时,加入细胞因子、融合信号、
泛素等基因以及 ISS 序列,另外还可以通过设计一些对抗原提成细胞有影响的分子共注射,以及加入转移分子, 都
可以明显增强 DNA 疫苗的免疫效果, 从而有利于研制更有效的 DNA 疫苗。
关键词:
DNA 疫苗
免疫应答
免疫刺激序列
Progress for Improving the Immune Response of DNA Vaccine
Zhou Canlin
Zhang Fuchun
( K ey L aborator y of M olecu lar B iolog y , C ol le ge of L i f e Sc ienc e and Te chnology , X inj iang Univ ersi t y .
X inj iang K ey L aborator y of Biological R esource s and G enet ic Engineering , Urumqi
830046)
Abstract:
DNA vaccination is a novel immunization strateg y that has gr eat po tential for the development o f
vaccines and immune therapeut ics. DNA vaccines have been show n to elicit immune responses to a diversit y of anti

gens, but their immunogenicity has pr oven quit e lim ited. Enhancing DNA vaccine potency r emains a challenge.
Based on the initial r epo rts of immune enhancement by deliver y of plasmids encoding GM
CSF or IL
12 in combina

tion w ith specific antig en
encoded plasmids, other molecules have been studied fo r manipulat ing the potency of DNA
vaccines in mice. Molecules under investig at ion tar get Th1
ty pe T cell expansion; DC/ APC activation, expansion,
or matur ation; costimulat ion, and immune cell tr afficking by chemokines. Recently, some vaccine strateg ies have
pr oduced exciting results in nonhuman primates.
Key words:
DNA Vaccine
Immune response
Immune stimulating sequence


自Wolf f等提出直接将编码抗原性物质的基因
导入肌肉组织, 有可能和接种抗原物质一样使机体
获得免疫以来。已有许多研究者用抗原基因构建了
真核表达载体, 这些载体能诱发机体产生不同程度
的特异性细胞免疫和/或体液免疫。DNA 疫苗具有
很好的前景, 如疟疾、乙型肝炎和人类免疫缺陷病
毒( H IV ) 疫苗已进入了临床试验。鉴于传统的减
毒疫苗和灭活疫苗可能引起一些不良反应, 人们希
望DNA 疫苗发展为新型替代性疫苗, DNA 疫苗具
有很好的前景, 较其它疫苗有诸多优点,但由于其免
疫机理还不完全清楚, 免疫效果也有待增强,这些因
素均是 DNA 疫苗进入临床前亟待解决的问题。一
般认为, DNA 疫苗注入体内, 在肌肉内合成外源蛋
白并通过 MHC
I途径呈递,诱导产生 CT L 效应细
胞。Robinson 等研究发现肌肉免疫 10分钟之内切
除免疫部位的肌组织,对诱导的抗体反应及CT L 反
应并无影响。因此他们认为注射部位的质粒转染细
胞在 DNA 介导的抗体反应及 CT L 反应中不起主
导作用[ 1] 。Manickan 等[ 2] 用抗原基因转染从脾脏
分离的DC细胞和巨噬细胞, 转染的DC细胞移植
收稿日期: 2005
11
08
基金项目:国家自然科学基金资助项目( No. 30360062)
作者简介:周璨林( 1980
) ,男 ,硕士生,主要研究方向:生物技术

* 通讯作者:张富春, T el: 0991
8583259, Fax: 0991
8583259, E
m ail ; zfc@ xju. edu. cn

生物技术通报

综述与专论
         BIOTECHNOLOGY
BULLETIN







2006年第 1期
入肌组织后,可有效激活机体特异性免疫,而相应的
巨噬细胞却无此功能, 因而认为 DC 细胞可能参与
DNA 疫苗的免疫应答,髓源性 DC 细胞在 DNA 肌
肉接种所引起的免疫应答中可能起重要作用 [ 3]。以
上 DNA 疫苗免疫机制方面的研究也促使了增强
DNA 疫苗免疫效果的研究迅速发展,本文即是对增
强 DNA 疫苗免疫效果的近期研究进展作一综述。
1
以 CpG基序增强 DNA疫苗免疫效果
CpG是从一种杆菌中提取的 DNA 片断具有体
外抗肿瘤的能力,其在体内可以提高 NK 细胞的活
性,并触发鼠科外周血淋巴系统中 IL
1 和 IL
2 的
释放,以上活性均对 DNA 酶敏感。特异的人工合
成的寡聚核苷酸可以模拟杆菌 DNA 的这种生物活
性,同时, 这种细菌 DNA还可以激活 B细胞并促进
其分泌免疫球蛋白, 而脊椎动物 DNA 却不能引起
上述反应。这主要是因为细菌体内含有未甲基化的
CpG基序,也称为免疫刺激序列( ISS) ,在细菌及低
等动物中十分普遍( 1/ 16)而且甲基化程度低( 5%以
下)。而在脊椎动物中却很少有此结构( 1/ 50)且多
被甲基化( 70% ~ 90% )。CpG 基序可以刺激多克
隆 B细胞前体,并通过单核细胞与其他细胞产生细
胞因子。
基于 CpG基序上述活性, 则在 DNA 疫苗质粒
中插入 CpG 基序起到增强 DNA 疫苗免疫效果的
作用。2003年 Gom is[ 4] 在鸡的皮下和肌肉中注射
人工合成的含 CpG的寡聚核苷酸,之后用分离的大
肠杆菌毒株注射, 10天后使用病理学和微生物学检
测发现,在为注射人工合成的含 CpG的寡聚核苷酸
的鸡中存活率仅为 15% , 与之相反, 在皮下与肌肉
中接种过人工合成的含 CpG 的寡居核苷酸的鸡存
活率有了极大的提高。人工合成的含 CpG 的寡聚
核苷酸不仅对正常动物有免疫增强作用, 对免疫缺
陷的动物也有免疫增强作用。2003年 Daniela Ver

thelyi发现使用含 CpG 的寡聚核苷酸处理的恒河
短尾猿可以明显的降低利氏曼原虫造成的身体损
害,在 HIV 感染的恒河短尾猿的外周血细胞中受含
CpG的寡聚核苷酸的影响, 会降低利氏曼原虫的损
害程度。
CpG基序的作用机制是在细胞摄入 CpG 基序
后发生的复杂生物过程, CpG 基序经非特异性的吸
附、内吞进入酸性的胞内体并被降解,随后诱导胞内
活性氧元类物质( react ive oxygen species, ROS)升
高。然后 ROS 作为第二信使经过 NF
k B ( nuclear
factor

B)和 MAPK( m itog en
act iv ated pr otein ki

nase)途径激活包括细胞因子在内的相关基因表达,
从而实现免疫刺激作用 [ 5]。
2
以细胞因子基因增强 DNA疫苗免疫效果
多种细胞因子可作用于体内免疫活性细胞或促
进其分化与增殖、或加强其活性与功能、或影响细胞
内生物活性分子的表达与分泌。因此, 可用细胞因
子调节和增强免疫反应。在 DNA 疫苗发明以前,
细胞因子被作为佐剂注入体内, 但由于半衰期短,降
解很快,在体内不能维持较高水平, 而且需反复注
射,随之而来的是严重的副作用, 而且其价格昂贵,
这些都限制了其使用。
在 DNA 疫苗中引入细胞因子基因的方式有两
种:一种是将只含有细胞因子的质粒和含有目的基
因的质粒共同注射模式动物,这种方法构建质粒较
简单,且可以方便地将细胞因子与目的基因组合。
第二种方式将细胞因子和目的基因构建于同一个质
粒,这种方法可以把两种基因融合表达,也可以通过
IRES(核糖体进入位点)作为中介将目的基因与细
胞因子连接构建共表达质粒,或是在同一质粒上用
双启动子表达两个基因。
将细胞因子的表达质粒与抗原表达质粒混合接
种小鼠即可观察到协同效应。2002 年 Dan 等[ 6] 人
在小鼠体内用 HIVgp120 质粒进行研究发现,使用
GM
CSF 与 HIV gp120 DNA 质粒共同注射, 提高
了脾脏中 CD4+ 细胞对 gp120的反应。
IL
12可以插入到 DNA 载体[ 7] 或病毒载体[ 8]。
IL
12的佐剂活性可以通过与其他细胞因子连接如
IL
2, IL
8[ 9]等,或与 B7等共刺激分子连接来改进。
IL
12诱导抗原特异性的 CTL 反应, 在 H IVDNA
疫苗研究中限制了体液免疫反应, 对此 Iwasaki等
人也有相似的报道 [ 10]。IL
12 cDNA 可以活化静止
的免疫细胞, 当共注射 IL
12cDNA 和 HSV DNA
疫苗,可以引起针对于 Th1型 CD4+ T 介导的抗原
特异型反应, 但抑制抗体生成。IL
12 质粒与日本
脑膜炎病毒衣壳的 DNA疫苗同时注射可以显著提
高抗体水平和 T 细胞反应 [ 11]。IL
12与 IL
18 和猫
232006年第 1期










周璨林等: 增强 DNA 疫苗免疫应答的新进展
的白血病病毒的 DNA疫苗一起免疫可表现出很强
的免疫保护能力 [ 12]。
罗雨红等用 IL
2 基因与抗原基因融合后能使
抗原蛋白有效分泌表达具有双重抗原性。插入 IL

2基因的重组质粒可以明显提高抗 HBs滴度和淋
巴细胞诱生的 IL
2的生物活性水平, 增强 HBsAg
特异性的皮淋巴细胞增殖指数, 提示 IL
2 增强
DNA 疫苗免疫效应是可行的。
Conry 等人报道 GM
CSF 有免疫增强效应, 特
别是当与 DNA 疫苗共同注射, 所引起的细胞介导
抗肿瘤免疫效果更明显。GM
CSF 表达质粒可显
著提高狂犬病 DNA 疫苗的免疫效果。GM
CSF 共
表达质粒可增强包括 HIV [ 13, 14] 、HCV、HSV、疟原
虫和结核杆菌[ 15] DNA疫苗的抗体水平。GM
CSF
与 HIV
gp120 的双表达质粒能诱导较强的针对
gp120的 CD4+ T 反应[ 16]。原因可能是GM
CSF 对
DC细胞活化提高抗原提呈能力, 通过提高 IL
2 的
表达和 CD4+ T 的活化, 提高了抗体水平, 并导致
CD8
+
T 的活化 [ 17]。
3
使用具有运输能力的蛋白基因增强免疫
效果
DNA 疫苗在体内受到无法扩增的限制, 因此尽
管在鼠模型中非常有效, 在大型动物身上的应用仍
有许多缺点需克服。融合牛疱疹病毒 1 ( Bovine
Her pesvirus 1)的 V P22是一种已证明的运输蛋白,
它是通过一种非细胞的不明的机制从感染细胞到达
邻近的细胞。Chunfu Zheng[ 18] 等人构建 VP22 与
tgD基因融合表达质粒, 与仅使用 tgD 基因的对照
相比免疫反应水平明显提高, 并且获得了免疫保护。
4
通过对抗源提呈细胞的影响增强免疫效
果
4. 1
使用促使 DC细胞成熟的分子共同构建疫苗
抗原提呈细胞( APC)特别是 DC细胞在疫苗的
免疫系统的抗原提呈中扮演重要角色。DC 的抗原
提呈能力依赖于其成熟度, 体内的大量分子可以作
为提高 DNA 疫苗的 APC 活性、扩增、成熟、抗原提
呈及处理。这些包括细菌来源的抗原, T NF 超家族
受体, 生长因子, 炎症反应细胞因子。Shawn M .
Sumida
[ 19] 等人,使用在老鼠肌肉中注射 HIV
1 env
的 DNA疫苗仅诱导了少量的 DCs到注射位点及低
的 env特异的免疫反应。而使用编码配体 M IP
1

(巨噬细胞炎症蛋白 1
) 与 DCs 特异的生长因子
fms样酪氨酸激酶 3配体与 DNA 疫苗共注射引起
在注射位点大量 DCs的游走、扩增、激活, 而且可以
大大的提高 DNA 疫苗诱导的细胞及体液免疫反
应。
4. 2
使用抑制抗原提呈细胞的凋亡分子提高 DNA
疫苗的免疫效果
丝氨酸蛋白酶抑制剂( SPI
6)又称 serpinb9通
过抑制 g ranzyme B延缓 DCs的细胞凋亡 Tae Woo
Kim[ 20]等人将编码 SPI
6 的 DNA 与 H PV
16 E7
共注射,这种联合策略使得 E7特异的 CD8+ T 细
胞和 TCD4+ T H1型反应显著增加, 并增强肿瘤治
疗能力,并且与不含 SPI
6的对照相比提高了对肿
瘤的保护,在将 SPI
6 进行无意突变之后却不引起
免疫增强,因此推测提高免疫是依赖于它的抗凋亡
功能。
5
其他提高 DNA疫苗免疫效果的方法
通过密码子的优化,已经证明人类乳头瘤病毒
16 型 ( H umanpap i l lomavir us ty p e 16, H PV 16)
HPV 16L1和 H PV L2 蛋白的瞬时表达能通过改
变 RNA编码序列极大的提高, 引起病毒样颗粒在
被转染的细胞核内大量增殖积累。当前的数据显
示,就 L1而言, 密码子的通用性在蛋白表达方面意
义重大,而且不依赖翻译的转录后过程仅起到很小
的作用, 与密码子未优化的 HPV 16L1DNA 疫苗相
比,密码子优化后的 HPV 16L1DNA疫苗能诱导更
强的免疫反应[ 21]。
由于内源性蛋白的降解主要是通过泛素途径被
蛋白酶体识别后, 降解为 8~ 12个氨基酸的小肽段,
被抗原加工转运体 ( TAP 1和 TA P2 ) 选择并被
MHC
1类分子结合提呈给 CT L, Rechardson[ 23] 利
用此途径将 LCMV (淋巴性脉络丛脑膜炎病)核心
蛋白( NP)的基因与泛素蛋白( ub)基因嵌合表达,并
将泛素的末尾甘氨酸( Gly )改为丙氨酸( Ala) ,以防
融合蛋白降解为 NP 和 ub单体。结果显示, 此泛素
途径极大的加快了 NP 的降解速度。NP 在胞内的
加速降解使得它不能有体液免疫的产生。加速它被
MHC
1类分子的提呈的几率,可以显著增强 CT L
24







生物技术通报 Biotechnology
Bullet in







2006年第 1期
的活性及小鼠的保护性免疫效率。此外在抗原基因
中增加分泌引导序列亦可提高 DNA 疫苗诱发产生
抗体的水平[ 24] ,增强 DNA 疫苗的免疫效果。
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