全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
猪传染性胃肠炎病毒 S基因 B和 C
抗原位点片段在毕赤酵母中的表达
于天飞1, 2 王君伟 1 胡森 1 靳淼 1
( 1东北农业大学动物医学院,哈尔滨 150030; 2齐齐哈尔大学生命科学与工程学院,齐齐哈尔 161006)
摘 要: 采用基因重组的方法构建了含有猪传染性胃肠炎病毒 S基因 B和 C抗原位点片段的巴斯德毕赤酵母 P ichia
pastor is分泌型表达载体 pP IC9Kts,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母 GS115中, 大量筛选后获得高效表达外源蛋
白的毕赤酵母工程菌株 GS115 /pP IC9Kts。表达蛋白经 Do tELISA检测具有良好的抗原性。本研究为 TGE的血清学检测方法
的建立提供了必要的物质基础。
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒 S基因 抗原位点 表达 毕赤酵母
Expression of Transm issible Gastroenteritis V irus of Swine
SpikeGene B and C Antigen Sites in Pichia pastoris
Yu T ianfei
1, 2
W ang Junw ei
1
Hu Sen
1
J in M iao
1
(
1
D epar tment of VeterinaryM edicine, N ortheast Agriculture University, H arbin 150030;
2
College of L ife Science and Engineering, Q iqihar University, Q iqihar 161006)
Abstrac:t A DNA fragment cod ing for TGEV spike gene B and C antig en sites w as c loned into P. pastor is expression vec to r
pP IC9K for ex trace llu la r expression in P. pas tor is by gene recomb ination. The resu lted recom b inant plasm id pP IC9ts w as then linea r
ized and transform ed intoP. pastoris GS115 by electroporation. The ts gene w as integrated into the genom e o fP. pastoris through ho
m ologous recomb ination and an expression strain, nam ed GS115 /pP IC9Kts, was obta ined. DotELISA showed that the recomb inant pro
te in possessed favourab le an tigen icity. Th is resea rch prov ided essentia lm a teria l founda tion fo r estab lishm ent o f TGE serology d iagnostic
m ethod.
Key words: TGEV S gene Antigen sites Expression P ichia pastoris
收稿日期: 20091231
基金项目:黑龙江省 九五 !攻关课题 ( G00B03021)
作者简介:于天飞,男,讲师,博士,从事分子病毒学与免疫学研究; Em ai:l yu tianfei2001@ 163 com
通讯作者:王君伟,男,教授,博士生导师,主要从事兽医微生物学与免疫学研究; Em ai:l jww ang@ m ailneau edu cn
猪传染性胃肠炎 ( transm issible gastroenteritis,
TGE )是猪的一种急性, 高度接触性传染病,各种年
龄及品种的猪对本病均易感,其中 2周龄以下仔猪
的死亡率可达 100%。该病病原为猪传染性胃肠炎
病毒 ( transm issib le gastroenterit is virus of sw ine,
TGEV )
[ 1, 2]。
TGEV S蛋白 (或称 E2蛋白 )形成病毒粒子表
面的突起,携带主要的 B淋巴细胞抗原决定簇, 是
唯一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结
构蛋白。S蛋白含有 4个抗原位点, 从氨基末端开
始依次定为 C、B、D和 A, 4个抗原位点都位于 S蛋白
N端 543个氨基酸残基之内,不同 TGEV分离株的 A、
B和 C位点高度保守, D位点则有一些变化 [ 3 ]。本试
验在巴斯德毕赤酵母中表达了 TGEV S蛋白 B、C抗
原位点片段, 为建立 TGE的准确、快速、特异和敏感
的血清学检测方法提供必要的物质基础。
1 材料与方法
11 菌株与质粒及试剂
含有 TGEV S蛋白 B、C抗原位点片段的重组质
粒和大肠杆菌菌株 DH5由本实验室保存;毕赤酵母
2010年第 5期 于天飞等:猪传染性胃肠炎病毒 S基因 B和 C抗原位点片段在毕赤酵母中的表达
P ichia pastoris GS115, pPIC9K表达载体购自 Inv itro
gen公司;质粒 pMD18T Vector购自 TaKaRa公司。
胶回收试剂盒,限制性内切酶 EcoR ∀、N ot∀和
Sac∀, T4 DNA 连接酶, 氨苄青霉素, DNA M aker
DL15000等试剂购自 TaK aRa公司; G418和山梨醇
购自北京经科宏达生物技术有限公司; PCR引物合
成及序列测定由上海生工生物工程技术有限公司完
成。LB、YPD、MD和 BMGY培养基配制方法见 In
vitrogen公司毕赤酵母操作手册。猪传染性胃肠炎
病毒血清和健康猪血清由本实验室制备保存; 羊抗
猪过氧化物酶标记抗体购自北京中杉生物科技
公司。
12 毕赤酵母重组表达载体的构建
根据 S基因 B、C抗原位点片段的核苷酸序列
设计 PCR引物并在引物的 5#端分别引入 E coR ∀和
N ot∀酶切位点。 PYu: GTAGAATTCATGTGTTCTA
AATTGACT; PY :l TTTGCGGCCGCTTAACCATTTT
TATTATTA。PCR反应体系 ( 25 L )为含有 B、C抗
原位点片段的克隆质粒稀释液 2 L, 10 ∃Buffer 25
L, 10 mmo l/L dNTP 2 L, 25mmol /L M gC l2 2 L,
ExTaq DNA聚合酶 ( 25U ) 05 L, 10 mo l/L特异
的上下游引物 PYu和 PY l各 1 L,用无菌去离子水
补足 25 L。 PCR反应程序: 94% 4 m in; 94% 1
m in, 56% 1 m in, 72% 1 m in,共 30个循环; 72 % 延
伸 10m in。PCR产物与 pMD18T连接, 得到重组质
粒 pMD18Tts,将该质粒转化大肠杆菌 DH5, 筛选
阳性克隆。将重组质粒 pMD18Tts用 E coR ∀和
N ot∀进行双酶切, 与同样双酶切的酵母表达质粒
pPIC9K进行连接,获得重组质粒 pPIC9Kts转化大
肠杆菌 DH5,挑选单菌落,提取质粒 DNA,以引物
PYu和 PY l进行 PCR检测并测序。
13 重组毕赤酵母的筛选和鉴定
131 毕赤酵母的电转化 酵母感受态制作见 In
vitrogen公司毕赤酵母操作手册。电转化条件为,电
压 15 kV, 电容 25 F, 电阻 200 , 电击时间 4
10 s。电击结束后立即加入 1 mL冰预冷的山梨醇,
混合后取 300 L菌液涂布于 MD筛选平板上, 于
28% 培养,直至单个转化子出现。
132 重组毕赤酵母的平板筛选 将 MD培养基
中长出的最初 H is+转化子,采用影印法依次接种到
含 G418浓度梯度为 025、05、10、20、30和 40
mg / mL的 YPD平板中,逐级筛选 G418抗性菌株即
目的基因高拷贝重组菌株。
133 重组毕赤酵母菌株的 PCR鉴定 提取毕赤
酵母重组工程菌基因组 DNA, 以载体 pPIC9K 5#
AOX1 /3#AOX1通用引物和引物 PYu /PY l进行 PCR
鉴定。
134 重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 将阳
性转化子接种于 25 mL BMGY培养基中, 于 28% ,
220 r/m in摇床培养至 OD600 20。室温离心收集菌
体并转移至 50mL BMMY诱导培养基中继续培养,
每 12 h补加 100%甲醇至终浓度为 05% - 20%,
每 24 h取样,将培养液于 4% 下 12 000 r /m in离心 3
m in收集上清。
1 4 重组毕赤酵母表达产物分析
141 SDSPAGE分析 取诱导的上清液 1mL,加
入 1 /9体积的 100% TCA沉淀,离心收取棕黑色沉
淀加入 200 L冰冷的丙酮,洗去残余 TCA; 离心,倒
掉上清, 加入 20 L 1 mol /L NaOH 溶液重悬沉淀,
SDSPAGE分析重组蛋白的表达情况。
142 表达蛋白的抗原性分析 ( Do tELISA ) 包被
抗原用 001 mo l/L pH74的 PBS稀释至适当的浓
度。将硝酸纤维素膜安装于斑点杂交加样器内, 加
样, 室温干燥。将膜放入封闭液中 37% , 1 h。用洗
涤液洗涤 3次, 每次 3m in。将膜放入适当稀释的不
同待检血清中, 37% , 1 h。洗 3次。将膜放入与待
检血清相对应的适当稀释的酶标抗体溶液内, 37% ,
30m in。用洗涤液洗涤 3次。将膜浸入底物溶液
中, 显色 5 m in。放入去离子水中终止反应。
2 结果
21 毕赤酵母重组表达载体的鉴定
毕赤酵母重组表达载体质粒 pPIC9Kts经 No t
∀单酶切可得到长约 10 000 bp的一条带, 经 E coR
∀ / N ot∀双酶切得到约 700 bp和 9 300 bp的两条
带, 经 PCR产生约 700 bp一条带, 表明重组质粒
pPIC9Kts为阳性重组质粒 (图 1)。测序结果表明
所克隆的目的片段核苷酸全长 690 bp, 编码 229个
氨基酸, 与参考序列 ( G enB ank序列号: AF494337)
同源性为 100%。目的片段正确插入到毕赤酵母表
达载体 pPIC9K中。
155
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
1. DL 15000 Marker; 2. pPIC9KtsEcoR∀ /N ot∀双酶切;
3. pP IC9KtsN ot∀单酶切; 4. pPIC9Kts PCR鉴定
图 1 毕赤酵母重组表达载体质粒 pPIC9Kts鉴定结果
2. 2 重组毕赤酵母的筛选和鉴定
将重组表达质粒 pPIC9Kts用限制性内切酶
Sac∀ (酶切位点位于 5#AOX1区内 )线性化, 电击转
化酵母菌株 GS115酵母感受态细胞,获得重组转化
子。提取转化子基因组, 进行 PCR鉴定。 B、C抗原
位点片段基因大小为 690 bp, 5#AOX1和 3#AOX1在
质粒 pPIC9的间隔距离为 492 bp, 故第 2泳道 PCR
扩增得到 1 200 bp左右产物的转化子即为阳性克
隆,另一条为 AOX1基因 (大约 22 kb) (图 2)。结
果表明, B、C抗原位点片段基因编码序列已插入到
毕赤酵母基因组中的 AOX1区。
1. DL 15000M arker; 2. GS115 /pP IC9Kts PCR鉴定,引物为 5#
AOX1和 3#AOX1; 3. GS115 PCR鉴定, 引物为 5#AOX1和 3#
AOX1; 4. GS115 /pP IC9Kts PCR鉴定,引物为 PYu和 PY l
图 2 重组毕赤酵母的 PCR鉴定
23 重组毕赤酵母表达产物分析
对经甲醇诱导 96 h的重组菌株 GS115 /pPI
C9Kts上清样品进行 SDSPAGE分析, 结果检测到
分泌表达的 33 kD左右的蛋白,分子量与预期相符
(图 3)。对照 GS115 /pPIC9K 96 h收获的上清液中
无该蛋白带。
1. 蛋白质分子质量标准; 2 - 4. GS115 /pPIC9Kts诱导 96 h的
表达产物; 5. GS115 / pPIC 9K诱导 96 h的表达产物
图 3 重组毕赤酵母表达产物分析
24 蛋白浓度的测定和抗原性分析
根据 B radford 法 [ 4] 对蛋白浓度进行检测,
GS115 /pPIC9Kts经甲醇诱导 96 h收获的上清总蛋
白含量为 732mg /mL。将总蛋白稀释至 1mg /mL,
再以 1&10、1&100、1&1 000稀释后,点于硝酸纤维素
膜上,每点加样 10 L,使每点的包被抗原含量分别
为 1 000、100、10 ng /点,进行 DotEL ISA试验分析。
结果表明, 抗原包被量在 100 ng /点时, 阳性斑点颜
色清晰,而阴性对照无可见斑点 (图 4)。以 100 ng /
点包被抗原, 对健康猪血清进行 Do tELISA检测。
结果无可见斑点 (图略 )。
A1( 1 000 ng) , A2( 100 ng), A3( 10 ng)为 GS115 /pPIC 9K经
甲醇诱导 96 h收获的上清稀释液;
B1( 1 000 ng) , B2 ( 100 ng) , B3 ( 10 ng)为 GS115 /pPIC9Kts
经甲醇诱导 96 h收获的上清稀释液
图 4 重组蛋白 DotELISA试验结果
3 讨论与分析
本试验通过毕赤酵母表达系统成功获得了猪传
染性胃肠炎病毒 S蛋白 B、C抗原位点片段,表达蛋
白经 DotELISA检测具有良好的抗原性。猪呼吸道
冠状病毒 ( PRCV )是上世纪 80年代中期欧美等国
156
2010年第 5期 于天飞等:猪传染性胃肠炎病毒 S基因 B和 C抗原位点片段在毕赤酵母中的表达
报道的一种 TGEV自然变异株, PRCV与 TGEV相
比主要是在 S基因的 5#端约 200 bp处开始存在一
约 621- 672碱基的缺失 [ 5, 6] , 进而丧失了 B、C抗
原位点。PRCV主要在欧洲、美洲流行,亚洲近几年
也有发生的报道。PRCV主要在呼吸道和肺组织中
增殖, 不引起腹泻、不产生或仅产生轻微的呼吸道疾
病症状。PRCV和 TGEV 具有极相似的抗原结构,
用常规血清学方法难以区分 PRCV 和 TGEV [ 7 - 9 ]。
本试验所获得蛋白为 PRCV缺失部分, 避免了潜在
的 PRCV感染对检测 TGE的干扰。本研究探讨了
TGEV S基因 B和 C抗原位点片段在毕赤酵母表达
系统中进行分泌表达的可行性,为进一步优化表达
条件以提高表达量以及探索其作为 TGE血清学诊
断试剂的可行性打下了良好的基础。
参 考 文 献
[ 1 ] 斯特劳 BE,阿莱尔 SD,蒙加尔 WL,等. 猪病学 (第 8版 ) [M ] .
北京:中国农业大学出版社, 2000, 305328.
[ 2] S chw egm annW esselsC, H errler G. T ran sm iss ib le gastroen teritis vi
rus in fection: a van ish ing sp ecter. Dtsch T ierarztl Wochen sch r,
2006, 13( 4 ): 157159.
[ 3] Delm as B, Rassch aert D, GodetM, et a.l Four m ajor ant igen ic sites
of the coronavirus tran sm iss ib le gast roen terit is v iru s are located on
the am inoterm in al half of sp ike g lycop rotein . J Gen V iro,l 1990,
71: 13131323.
[ 4] 汪家政,范明. 蛋白质技术手册 [M ]. 北京: 科学出版社, 2000,
4246.
[ 5] 于天飞,王君伟,胡森,等. RTPCR检测猪传染性胃肠炎病毒的
研究.中国动物检疫, 2006, 23 ( 5) : 2123.
[ 6] E ric M, Patrick G, Prem S. Sequence comparison of porcin e resp ira
tory coronavirus iso lates reveals h eterogeneity in th e S, 3, and 31
genes. JV iro,l 1995, 69: 31763184.
[ 7] 邱深本,王磊,苏丹萍,等. 猪呼吸道冠状病毒 S1基因的克隆与
序列分析. 中国动物检疫, 2009, 26( 6 ) : 3638.
[ 8] 常志顺, 汤德元,曾智勇, 等. 猪传染性胃肠炎病毒基因及其疫
苗的研究进展. 猪业科学, 2008( 12 ) : 2632.
[ 9] 韩国全, 郭万柱,李云云, 等. 猪传染性胃肠炎病毒检测技术研
究进展, 2008( 12 ): 3336.
(上接第 144页 )
[ 5] 申佩弘,王亚莉,武波.甲醇利用菌 MB200丝氨酸乙醛酸氨基转
移酶基因的克隆、突变及对产 L丝氨酸的影响. 工业微生物,
2008, 38 ( 1) : 1519.
[ 6] 欧倩,韦东,武波.丝氨酸生产菌的筛选及静息细胞培养系统中
L丝氨酸的合成.氨基酸和生物资源, 2006( 3 ) : 4448.
[ 7] 孔庆胜, 王亚莉,吴福国. 一株甲醇利用菌 M e thylobac terium. sp
SDM 11的筛选鉴定及生长条件优化.化学与生物工程, 2009, 1:
4244.
[ 8] F M art in .i The prim ary structu re of rabb it l iver m itochond rial serine
hyd roxym ethyltran sferase. J B iol Chem, 1989, 264: 85098519.
[ 9] G irgis S. Mo lecular clon ing, characterizat ion and altern at ive sp licing
of th e hum an cytoplasm ic serin e hydroxym ethyltransferase gene.
Gene, 1998, 210( 2) : 31524.
[ 10 ] C h istoserdova LV. Genet ics of th e serin e cycle inM ethylobacterium
extorquens AM 1: clon ing, sequence, m utation, and physiolog ical
effect ofg lyA, the gen e for serine hydroxym ethyltransferase. J Bacte
rio,l 1994, 176 ( 21) : 675962.
[ 11 ] Yam ada H, et a.l LS erine Product ion by aG lycin eresistantMu tant
ofM ethylotrph icH yphom icrob ium m ethylovorum. Agric B io lChem,
1986, 50: 1721.
[ 13 ] Yosh id aT, et a.l LS erin e syn thesis us ing th e res tingHyphom icrobi
um sp. NCB I10099 cells under supp ress ive cond itions for LSerine
Degrad ing act ivity. J Ferm ent B ioeng, 1995, 79: 181183.
[ 14 ] S irirote P, et a.l LS erin e p roduction from m ethano land glycine w ith
an immobi lized m ethylotroph. J Ferm ent Techno,l 60: 291297.
(上接第 153页 )
[ 19 ] W ang YY, C heng P, Chan DW. A sim p le aff in ity sp in tub e f ilter
m ethod for rem ov ing h ighabundan t comm on p roteins or enriching
lowabundan t b iom arkers for serum proteom ic ana lysis. P roteom ics,
2003, 3 ( 3) : 243248.
[ 20 ] Yuan X, Des iderio DM. P roteom ics analys is of hum an cerebrospin al
flu id. J C hrom atogr B Analyt T echnol B iom ed L ife Sc,i 2005, 815
( 12) : 179189.
[ 21 ] C hen YY, Lin SY, Y eh YY, et a.l A m od ified protein precip itation
procedu re for eff icient rem oval of album in from serum. E lect ropho
res is, 2005, 26( 11 ) : 21172127.
[ 22 ] 孙太欣,彭国光.双向凝胶电泳脑脊液蛋白质提取方法的比较.
中国医药生物技术, 2007, 2( 3 ) : 172176.
[ 23 ] 陈波,沈国.不同样品制备方法对双向电泳图谱的影响. 武警医
学院学报, 2007, 16( 3 ) : 256258.
[ 24 ] 吕济相,王济明,罗诗樵, 等.胆管癌胆汁蛋白质样品制备和双
向电泳条件的优化.生物技术通报, 2009( 8 ): 125127.
157