全 文 ：石防风原生质体遗传转化及抗除草剂植株的再生
王秀凤 　杨爱芳　张举仁
(山东大学生命科学学院　济南　250100)
摘要　以石防风(Peucedanum terebinthaceum (Fisch.)Fisch.ex Turcz.)叶柄愈伤组织为材料建立以致密细胞团为主的
悬浮培养物 ,用酶解法获得原生质体。用 PEG 法将拟南芥菜(Arabidopsis thaliana (L.)Heynh.)抗除草剂基因导入原
生质体后进行液体浅层培养。转化细胞经除草剂 chlorsulfuron 筛选 , 通过胚状体途径产生抗性小植株。转化处理
106 个原生质体 ,以加入 40～ 50 μg mL质粒 DNA , PEG终浓度为 10%, 于 1 mL转化介质中 , 26 ℃黑暗下处理 20 min
的效果最好。 ctDNA的加入对转化结果无明显影响。分子杂交试验表明 , 突变的 als 基因已整合进转化植株的基
因组中。转基因植株的细胞在脱分化过程中仍具有抗 chlorsulfuron? 的能力;移栽成活的转基因小苗仍表现出抗除
草剂特性 ,而未转化的植株在低浓度除草剂下即逐渐死亡。表明转入的 als 基因在石防风细胞内能够稳定表达。
关键词　原生质体 ,遗传转化 , als 基因 , chlorsulfuron , 石防风
Genetic Transformation of Protoplasts from Peucedanum terebinthaceum
and Regeneration of Herbicide_resistant Plantlets
WANG Xiu_Feng 　YANG Ai_Fang　ZHANG Ju_Ren
(School of Life Sciences , Shandong University , Jinan 250100)
Abstract　Calli produced from the segments of young petioles of Peucedanum terebinthaceum Fisch.ex Turcz.
were transfered into liquid medium for suspension culture.The protoplasts were isolated from cells of clusters by
enzymes digestion.The mutant als(acetolactate synthase)gene of Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.was
transferred into protoplasts of P .terebinthaceum with PEG method.A transformation medium containing 40 ～
50 μg mL DNA and 10%PEG and an incubation condition of 26 ℃ for 25 minutes in dark revealed the best
result.Supplementation with 0 ～ 60μg mL ctDNA into the medium gave no remarkable effect on transformation
frequency.After cell clumps formed from the treated protoplasts in liquid medium , they were transferred onto
proliferation medium containing 0.01 mg L chlorsulfuron.The resistant clones grew 20 days later , and were
transferred onto differentiation medium containing 0.03 mg L chlorsulfuron.Plantlets regenerated via embryoid
pathway.Southern blot hybridization with the 32P labeled 2.5 kb fragments of p35s_als demonstrated that the
mutant als gene had inserted into P .terebinthaceum genome.Chlorsulfuron_resistant calli which grew normally
were produced when segments of transgenic plantlets were cultured on the proliferation medium containing 0.01
mg L chlorsulfuron , whereas the growth of untransgenic explants were inhibited.Meanwhile , the transgenic
plants could stand high density of chlorsulfuron up to 0.06 mg L , but not the wild plants.These results
indicated that the exogenous als gene had integrated into P .terebinthaceum genome and could transcript and
translate stably.
Key words　Protoplast , Genetic transformation , als gene , chlorsulfuron , Peucedanum terebinthaceum
　　chlorsulfuron 是一种广谱性除草剂 ,对人畜无
害 ,不污染环境[ 1] ,应用前景十分广阔。它在植物细
胞中的作用位点是乙酰乳酸合成酶(acetolactate
synthase , als)。该酶是分枝氨基酸合成代谢中的关
键酶 。1986 年 ,Haughn 等[ 2] 获得了拟南芥菜抗除草
剂 chlorsulfuron 的突变系 ,次年 ,Muzar 等[ 3] 发现其抗
chlorsulfuron? 的原因是 als 基因发生了突变 ,并分
离出该突变基因。1988 年 ,他们以 Ti 质粒为介导 ,
将其转入烟草细胞并再生出抗性植株[ 4] 。石防风为
多年生伞形科植物 ,是常用的中草药 ,其原生质体再
生植株已有报道[ 5] ,本工作旨在用 PEG 法将拟南芥
菜抗除草剂的突变基因 als 转入石防风原生质体并
再生出抗性植株 ,了解影响细胞转化及植株再生的
因素和适宜参数 ,为研究外源基因在受体中的表达
现在东营市环保研究所工作。Dongying City Enviroment Protection Bureau , Shandong Province.
收稿日期:1998-08-25　接受日期:1998-12-10
植　物　学　报　1999 , 41(7):706～ 710
Acta Botanica Sinica
和获得抗除草剂农作物奠定基础。
1　材料和方法
1.1　材料
石防风 (Peucedanum terebinthaceum (Fisch.)
Fisch.ex Turcz.)愈伤组织和悬浮培养系的建立 、原
生质体的游离和培养基参照已有报道[ 5 , 6] 。质粒
DNA 为 p35s_als(图 1)[ 7] ,其长 7.7 kb ,含有 Amp r 基
因 、来自拟南芥菜的抗 chlorsulfuron 的 als 和 nos 基
因的一个片段(黑线部分),另外在由 als 基因和 nos
基因片段组成的融合基因的两端是花椰菜花叶病毒
的启动子和终止子。质粒提取采用碱裂解法 ,纯化
采用 PEG 沉淀法[ 8] 。
图 1　p35s_als质粒
Fig.1　The p35s_als plasmid
1.2　chlorsulfuron选择浓度的确定
把悬浮培养的小细胞团(由 30 个以下细胞组
成)转移到分别加有 chlorsulfuron 0 、0.01 、0.05 、0.1 、
1 、10 、100 mg L的固体增殖培养基(1 2 MS+0.5 mg
L 2 ,4_D+0.1 mg L ZT)上培养 ,定期观察 ,一个月后
统计细胞团的存活率 。据细胞形态结构 、存活率等
确定筛选抗性克隆的 chlorsulfuron 浓度 。
1.3　原生质体转化 、培养及植株再生
据Krens 等[ 9]的方法并加以修改。转化原生质
体用液体培养基(川芎原生质体培养基 ,改碳源为蔗
糖 20 g L和葡萄糖 60 g L ,用 0.5 mg L ZT 代替 0.5
mg L 6_BA ,加入 L_半胱氨酸和 Vc各 2 mg L)进行浅
层培养。选择培养基用加有 0.01 mg L chlorsulfuron
的增殖培养基。抗性克隆在含选择剂的分化培养基
(MS+0.05 mg L ZT+0.05 mg L ABA)上再生植株;
小苗在生根培养基上(1 2 MS+0.03 mg L NAA+0.
03 mg L ZT)根系变发达。三叶期的小苗移栽到蛭石
中长大。
1.4　转基因植株的鉴定
质粒DNA 经 EcoRⅠ酶切后进行低融点琼脂糖
电泳 ,回收并纯化其 2.5 kb? 的 DNA 片段制备放射
性探针 。转化植株和未转化植株冰冻干燥 ,CTAB法
提取基因组 DNA[ 10] 。后者经 EcoRⅠ消化后电泳 ,
按卢圣栋介绍的方法[ 8] 将其转移到尼龙膜上 ,加入
放射性探针进行杂交。
转化小苗和未转化的小苗均切段培养 , 在含
chlorsulfuron的增殖培养基上鉴定抗性。并以移栽
后小苗为材料 ,隔天喷洒(共 3次)chlorsulfuron溶液 ,
观察植株生长状态的变化。实验温度 25 ℃,相对湿
度 45%～ 70%。
2　结果和讨论
2.1　原生质体遗传转化及培养
取酶解后用沉淀法收集的原生质体 ,用 PEG 介
导法[ 9] 进行转化。转化后的原生质体 ,大多数胞质
较浓厚 ,含有许多粒状物(图版 Ⅰ , a)。在培养的最
初两天里 ,转化与未转化原生质体的变化相似。部
分原生质体由圆球形变为椭球形 ,新壁再生 ,体积增
大 。培养第 4 d ,第一次分裂发生(图版 Ⅰ , b),此期
转化细胞死亡率高 ,成活细胞内含物多 。培养 10 d
时 ,小细胞团出现(图版 Ⅰ , c)。培养 20 d 左右 ,培
养液中已有较多的由几十个细胞组成的细胞团(图
版Ⅰ ,d)。培养 30 d 后 ,肉眼可见的小愈伤组织大
量形成 。
在本实验中 ,曾以几批转化细胞团为材料 ,尝试
在培养的20 d 内(6 、10 、16 d)添加新鲜的培养液 ,以
便尽早筛选 ,减少自发突变所造成的假象 。加入的
培养液或成分不变 ,或渗透压逐步降低 ,都引起小细
胞团全部死亡 ,这与文献[ 11] 报道不同。因而在转化
细胞培养 20 d 后加入 0 1 mg L chlorsulfuron 进行初
次筛选 。在初次筛选中 ,大多数细胞团生长变差 ,细
胞增殖变慢或停止 ,只有少数细胞团旺盛增生(图版
Ⅰ , e)。
2.2　转化细胞的筛选及植株再生
2.2.1　选择剂浓度的确定　把未转化的小悬浮细
胞团转到加有不同浓度 chlorsulfuron 的固体增殖培
养基上培养 。选择剂为 0 时 ,细胞不断分裂生长 ,形
成小愈伤组织 , 1 个月后布满平板。在含 0.01 mg L
chlorsulfuron的培养基上 ,小细胞团在最初的几天内
增大 ,但细胞分裂 2 ～ 4 次后停止 ,形状变得不规则 ,
体积增大 ,胞质变稀薄 。筛选培养半个月后 ,小细胞
团不再生长 ,颜色变褐 , 1 个月时 ,大部分死亡。随
chlorsulfuron浓度进一步提高 ,细胞分裂1 ～ 2次后就
7 期 王秀凤等:石防风原生质体遗传转化及抗除草剂植株的再生 707　
很快变形 ,进入坏死状态 。培养 30 d 后统计不同选
择浓度下细胞团存活率 ,由图 2 可知 ,细胞团存活率
与 chlorsulfuron 浓度呈负相关 ,当 chlorsulfuron 浓度
为0.01 mg L时 ,细胞团存活率只有 25 %左右;当浓
度为 1.0 mg L 时 ,细胞团存活率不足 5 %;浓度再
升高 ,存活率几乎为零 。由以上结果可推测 , 0.01
mg L chlorsulfuron 足以抑制由原生质体形成的小细
胞团的生长。
图 2　不同浓度 chlorsulfuron对小细胞团存活率的影响
Fig.2　Effect of chlorsulfuron concentrations on the survial rate of
cell clusters
2.2.2　植株再生　将初次筛选后的原生质体产生
的细胞团转移到含 0.01 mg L chlorsulfuron 的固体增
殖培养基上 , 1 个月后 ,一些细胞团形成小愈伤组
织 ,克隆频率远低于无 chlorsulfuron 培养基上的。未
转化处理的原生质体形成的细胞团 ,在含 0.01 mg L
chlorsulfuron 的培养基上无克隆形成。把抗性克隆
夹碎后进一步选择 ,部分克隆生长受抑 。1 个月后
统计受抑克隆数(表 1),发现 chlorsulfuron 浓度增大 ,
抗性克隆生长受抑制的频率增加。而且 ,不同抗性
克隆在高浓度 chlorsulfuron 培养基上表现出耐受性
有明显差异。一些克隆在加有 0.03 mg L选择剂的
培养基上生长旺盛 ,另一些克隆在此条件下生长严
重受抑(图版Ⅰ , f)。
表 1　抗性克隆对不同 chlorsulfuron浓度的耐受性
Table 1 　 Difference of tolerance to different concentration of
chlorsulfuron among resistant clones
Concentrations
of chlorsulfuron
(mg L)
No.of clones
transferred
No.of clones
suppressed
% of clones
suppressed
0.01 30 0 0
0.02 30 5 17
0.03 30 10 33
0.06 30 24 80
为了获得较高抗性的转基因植株 ,将筛选出的
抗性克隆转移到含 0.03 mg L chlorsulfuron 的分化培
养基上再生植株 。1 个月后 ,一些克隆停止生长并
变褐 ,一些克隆由灰白色变为米黄色 ,表层呈颗粒状
松散结构 ,产生出了大量胚状体(图版Ⅰ , g)。继代
培养后 ,胚状体逐步发育成小植株。再生植株畸形
苗比率高 ,生根较难 ,需转入生根培养基中促进根系
生长。
2.3　影响转化频率及植株再生的因素
2.3.1　转化时间对转化频率的影响　转化时间是
指原生质体 、质粒 DNA 、PEG 、ctDNA(小牛胸腺 DNA)
在转化介质中于一定温度下共处的时间。转化处理
1mL原生质体(106 个),当质粒 DNA 为 40 μg mL、
PEG 最终浓度为 10 %、温度为26 ℃时 ,转化时间对
转化效果的影响见表 2。可见 ,转化处理时间越长 ,
原生质体死亡率越高 ,小细胞团形成频率降低。从
最终选择频率看 , 转化处理 25 min 的选择频率最
高 。可能转化处理时间过短时外源 DNA 进入受体
细胞的机率小 ,以致选择频率低。而转化处理时间
过长 ,虽使 DNA 进入受体细胞的机会增多 ,但原生
质体长时间处于逆境中 ,导致细胞团形成率低 ,从而
间接降低了选择频率。
表 2　不同转化时间对原生质体转化频率的影响
Table 2　Effect of incubation time on transformation frequency of
protoplasts
Incubation
time(min)
Death rate on
the 3rd day
(%)
Small cell
clusters on the
8th day(%)
Frequency of
select ion(%)
0 10.3 17.6 0
15 33.2 15.5 0.0012
20 41.4 16.7 0.0020
25 67.9 13.3 0.0051
30 80.1 11.6 0.0032
＊Frequency =(Number of clones grown on selected medium Number of
cultured protoplast s after transformation)×100%.
2.3.2　质粒 DNA用量对转化频率的影响　当原生
质体为 1 mL(106 个 mL),PEG 浓度为 10 %,转化时
间为25 min 时 ,质粒 DNA 用量对转化频率的影响见
表 3。质粒量增多 ,原生质体死亡率升高 ,过高的质
粒浓度对原生质体存活不利。从最终选择频率看
出 ,40 ～ 50μg mL 的质粒 DNA 量较为合适 。这同小
麦原生质体转化中质粒用量差距不大 ,而同烟草 、甘
蓝等原生质体转化所用的最适质粒量相差较
大[ 7 , 13] 。
2.3.3　PEG浓度对原生质体转化频率的影响　转
化处理 1 mL 原生质体(106 个)、加入 50μg mL质粒
DNA 、转化时间 25 min 、温度为26 ℃时 ,不同PEG 浓
708　 植　　　物　　　学　　　报 41 卷
度对转化的影响不同 。当 PEG 浓度为 13.3 %[ 9, 12] ,
培养 3 d 后细胞死亡率为 67%,比 PEG 为 10%时
(死亡率 48.5%)高 。从最终选择频率来看 ,13.3%
PEG 的转化频率为 0.0032%, 而 10% PEG 时为
0.0046%,即 10%PEG 诱导转化的效果较优。这同
甘蓝等原生质体转化中所得的结论一致[ 13] ,而同小
麦等遗传转化所用 PEG 浓度不同[ 9 , 12] 。看来诱导不
同植物的原生质体转化所需的最适 PEG 浓度有一
定的差异 。
表 3　质粒 DNA用量对原生质体转化频率的影响
Table 3 　Effect of plasmid DNA concentration on transformation
frequency of protoplasts
Concentrations
of plasmid
DNA(μg mL)
Death rate on
the 3rd day
(%)
Small cell
clusters on the
8th day (%)
Frequency of
selection(%)
0 39.6 10.8 0
20 49.1 8.3 0.0010
40 55.8 5.4 0.0043
60 62.5 4.2 0.0029
80 69.7 7.2 0.0021
一些学者认为 ,转化处理时加入 ctDNA 可使质
粒DNA 在进入细胞后被降解的机率减小 ,因而主张
转化介质中必需加入一定量的 ctDNA ,且不能用加
大质粒量来代替[ 14] 。本实验中曾在转化介质中加
入过不同浓度(0 ～ 60 μg mL)的 ctDNA ,发现转化频
率没有明显差别 ,这同薛红卫等的结果相同[ 12] 。
由以上结果得出 ,转化处理时 ,每毫升原生质体
(106 个)加入 40 ～ 50 μg 质粒 DNA 、PEG 终浓度为
10%、黑暗下 26 ℃处理25 min 可达到较高的转化频
率(0.0051%)。
2.4　转基因植株的鉴定和抗性稳定性分析
质粒 DNA 在 EcoRⅠ酶切前后的电泳图谱见图
版Ⅰ图 i的 2 和 3 ,即质粒 p35s_als 经 EcoRⅠ酶切后
电泳出3 个片段 ,分子量分别为 3.8 kb 、2.5 kb 和
1.4 kb[ 7] ,图版 Ⅰ图 i 的 4 和 5是经低熔点琼脂糖电
泳后回收得到的 1.4 kb 和 2.5 kb 片段。2.5 kb 片
段制备的探针与转化植株的 DNA 杂交出现两条带 ,
一条对应于质粒 DNA 的 2.5 kb 片段 ,另一条约在
1.0 kb 处(图版 Ⅰ , j)。已知制备探针的DNA 片段含
有一段 als 基因和一段nos 基因 ,它与转化植株DNA
杂交后在 2.5 kb 处出现阳性带 ,表明质粒 DNA 已经
转入受体细胞并整合进后者基因组中。而在 1.0 kb
处出现的杂交带 ,可能是石防风自身的 als 片段与
探针杂交的结果 。这表明石防风自身的 als 基因与
拟南芥菜als 基因的同源性较高 。
在加有 0.01 mg L chlorsulfuron 的增殖培养基上
继代培养转化克隆形成的愈伤组织 ,多数生长旺盛 ,
不随继代次数而明显变化;抗性愈伤组织和再生植
株在无选择剂的培养基上生长两个月后 ,转入加有
0.01mg L chlorsulfuron 的培养基上仍生长正常;把小
苗切段接种到含 0.01 mg L chlorsulfuron 的增殖培养
基上 ,1 个月后 ,来自转化小苗的外植体产生正常的
愈伤组织 ,而未转化植株的外植体则逐渐变褐死亡。
向三叶期的转基因小苗喷洒含 0.03 mg L
chlorsulfuron 的水溶液 ,不影响小苗的生长 ,但来自
种子或未转化愈伤组织的小苗则在 5 d 后全部死
亡 。移栽成活后的转基因植株对 chlorsulfuron 的耐
受性强 ,高浓度时表现出差异(表 4)。
表 4　转基因小苗对不同浓度 chlorsulfuron 的耐受性
Table 4　Tolerance to chlorsulfuron of transgenic plantlets
Concentration of
chlorsulfuron(mg L) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
No. of plantlet s in
experiment
8 8 8 8 8 8
No.of normal plantlets
on the 8th day after
selection
8 8 8 6 1 0
喷施浓度在 0.06 mg L 以下 ,植株表现正常 ,浓
度达到 0.1 mg L 或更大时 ,多数转化植株首先生长
变慢 ,8 d后逐渐死亡(0.1 mg L 下 8 d 时存活的植
株也在喷药后 13 d 死亡),看来转化植株的抗性是
有一定限度的。
以上结果表明 ,抗性基因在转基因植株细胞中
能够持续表达 ,即使在细胞脱分化过程中 ,转入的基
因仍表达稳定 。可以认为 ,我们获得了稳定表达外
源基因的抗除草剂植株 。
致谢　本文分子杂交实验在中国科学院植物生理研
究所分子遗传国家重点实验室完成 ,其间得到白永
延先生和毛慧珠老师的指导 ,在此深表感谢!
参 考 文 献
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Arabidopsis thaliana.Mol Gen Genet , 1986 , 204:430 ～ 434
3 　 Muzar B J , Chui C F , Smith J K. Isolation and
characterization of plant genes coding for acetolactate synthase ,
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1987 , 85:1110 ～ 1117
7 期 王秀凤等:石防风原生质体遗传转化及抗除草剂植株的再生 709　
4　Haughn G W, Muzar B J , Smith J.Transformation with a
mutant Arabidopsis acetolactate synthase gene render tobacco to
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图 版 说 明
a.转化处理后进行浅层培养的原生质体。 ×620　b.转
化后原生质体第一次分裂。 ×680　c.转化细胞产生的小细
胞团。 ×680　d.转化后 20 d 形成的细胞团。 ×320　e.加
进筛选培养基后 10 d (转化后 30 d)的细胞团 ,示部分细胞
内含物减少 , 开始死亡。 ×220　f.初次筛选获得的三个抗
性克隆在含 0.03 mg L chlorsulfuron 的培养基上生长 , 示 20 d
后的差异。 g.抗 性愈伤 组织 表面分 化出胚 状体。 h.抗
Chlorsulfuron的转基因植株。i.一些相关 DNA的电泳图谱:1.
转化植株 DNA , 2.EcoRⅠ 酶切质粒 p35s_als 所得的 3 个片
段 , 3.完整质粒 DNA , 4.质粒的 1.4 kb 片段 , 5.质粒的 2.5
kb 片段 , 6.标准分子量 DNA(EcoRⅠ酶切λ_DNA)。 j.1.未转
化植株的杂交带 , 2.转化植株DNA 的杂交带 , 3.质粒DNA 酶
切片段的杂交带(2.5 kb 片段处), 即阳性对照。
Explanation of Plates
Fig.a.The transformed protoplasts.×620　Fig.b.The first
division of a transformed cell.×680　Fig.c.A small cell cluster of
transformed cells.×680　Fig.d.A cell cluster after cultured for 20
d.×320　Fig.e.Cell clusters in selection medium contaning 10
ppb chlorsulfuron for 10 days , showing some dying cells with the
decreasing cell contents.×220　Fig.f.Different resistant clones
showing different endurance to 0.03 mg L chlorsulfuron.Fig.g.
Embryoids from the surface of resistant calli growing on
differentiation medium.Fig.h. A transgenic plant showing
resistance to chlorsulfuron.Fig.i.Electrophoretic profile of DNA:
1.transgenic plants DNA , 2.three fragments of p35s_als after EcoR
Ⅰ digestion , 3.p35s_als plasmid , 4.1.4 kb fragment of plastid , 5.
2.5 kb fragment of plastid , 6.DNA marker (λ_DNA digested by
EcoRⅠ).Fig.j.Southern_blot analysis:1.The hybridizing band
of untransformed plants , 2.The hybridizing bands of transformed
plants , 3.The positive marker(2.5 kb fragment).
710　 植　　　物　　　学　　　报 41 卷
王秀凤等:石防风原生质体遗传转化及抗除草剂植株的再生 图版 I
WANG Xiu-Feng et al.:Genetic Transforation of Protoplasts from Peucedanum terebinthaceum
and Regeneration of Herbicide-resistant Plantlets Plate I
See explanation at the end of text