全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
含 35S启动子的粟酒裂殖酵母表达载体的
构建及功能鉴定
王贺1 王丕武2 洪洋1 宋冰2
(1吉林农业大学生命科学学院，长春 130118;2吉林农业大学农学院，长春 130118)
摘 要: 利用 PCR技术从植物表达载体 pBI121 上先后克隆出 GUS基因和 35S-GUS-NOS基因序列，分别构建粟酒裂殖
酵母重组表达载体 pESP-2-GUS和 pESP-2-35S． GUS． NOS，并将它们转化到粟酒裂殖酵母菌体中。通过对不同液体培养基中
两种转化子的不同启动子启动 GUS基因表达产物的 GUS染色分析与比较，证明连入的 35S启动子能够替代 pESP-2 自身受维
生素 B1浓度调控的启动子，从而降低了培养基的成本，为今后工业上利用粟酒裂殖酵母发酵生产产品，提高经济效益，奠定了
基础。
关键词: 粟酒裂殖酵母 35S启动子 载体改造 GUS染色
Construction and Identification of Schizosaccharomyces pombe Expression
Vector Containing CaMV 35S Promoter
Wang He1 Wang Piwu2 Hong Yang1 Song Bing2
(1Jilin Agricultural University，College of Life Science，Changchun 130118;
2Jilin Agricultural University，College of Agricultural，Changchun 130118)
Abstract: Using PCR technology，we cloned GUS gene and 35S-GUS-NOS gene sequence from the plant expression vector
pBI121，and constructed Schizosaccharomyces pombes reorganization expression vector pESP-2-GUS and pESP-2-35S． GUS． NOS respec-
tively，which were transmitted into the body of Schizosaccharomyces pombe． Through comparing and analyzing GUS staining，which is the
product of GUS gene expression activated by promoters of two kinds of transforments in different liquid culture mediums，it proved that
35S promoter could replace pESP-2 promoter controlled by the concentration of Vitamin B1 ． It could decrease the cost of culture medi-
um，and lay the foundation for using Schizosaccharomyces pombe to increase economic benefit in industry．
Key words: Schizosaccharomyces pombe CaMV 35S promoter Vector construction GUS staining
收稿日期:2011-02-18
基金项目:教育部博士点基金资助项目(20070193005)
作者简介:王贺，女，硕士研究生，研究方向:分子生物学与基因工程;E-mail:wanghe19855@ 126. com
通讯作者:王丕武，男，教授，博士生导师;E-mail:peiwuw@ yahoo. com. cn
粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)是
一类不能出芽生殖而只能以分裂和产孢子的方式
繁殖的单细胞真核生物，近年来被广泛用作真核
表达系统。它具有较多与高等真核生物类似的性
质，在分子生物学研究中已成为一种提供信息的、准
确的真核模型［1 － 3］，成功应用在细胞重组、翻译、
RNA拼接、染色体结构、有丝分裂、减数分裂和细胞
周期等方面的研究，是研究细胞周期调控、染色体结
构、性别分化中的信号转导等较好的试验模型之
一［4 － 8］。粟酒裂殖酵母表达载体 pESP-2 自身的启
动子 Pnmt1受培养基中维生素 B1(VB1)浓度的严格
调控，当培养基中含浓度高于 0. 5 μmol /L VB1时，
Pnmt1被强烈抑制，不能启动目的基因正常表达。欲
使 Pnmt1正常发挥启动作用，得到人们所需要的外源
目的基因的表达产物，培养酵母菌体时就必须使用
不含有 VB1的纯物质培养基，而此类培养基价格比
较昂贵，不益应用于发酵工业上的大规模生产［9］。
CaMV 35S为植物表达载体中的强启动子。基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
因工程中，常使用 GUS 作为报告基因，研究 35S 启
动子在转基因植物中的表达分布情况［12，13］。GUS
基因又称 β-葡糖苷酸酶基因，来源于大肠杆菌
(E. coli) ，其产物具有明显的蛋白质特异性和良好
的热稳定性［14］。利用 GUS 组织化学染色法检测转
基因生物，若呈现蓝色，说明外源 GUS 基因已成功
转入宿主细胞并在启动子的作用下得到表达。此方
法操作简便快速，灵敏度高，具有直接明了、简便易
行的特点［15］。本研究将不受 VB1浓度影响的 35S
启动子插入到 pESP-2 质粒的多克隆位点处，以 GUS
为报告基因，通过对 35S 在粟酒裂殖酵母重组质粒
中表达活性的测定，证明 35S 能够成功替换 pESP-2
本身的启动子，降低了培养基的成本。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株与载体 大肠杆菌 DH5α、分别带
pBI121 质粒和 pESP-2 质粒的大肠杆菌菌株，以及
栗酒裂殖酵母菌株均由本实验室保存。
其中 pBI121 质粒为植物表达载体，包括 35S 启
动子、GUS基因、NOS 终止子和卡那霉素抗性基因
等。pESP-2 质粒为粟酒裂殖酵母表达载体，主要包
括氨苄青霉素抗性基因(ampicillin resistance，Amp
+) ，其允许在大肠杆菌克隆时进行载体的抗生素
选择;选择标记基因 LEU2-d，源自酿酒酵母(Sac-
charomyces cerevisiea) ，可作为向栗酒裂殖酵母细胞
中转化表达结构的选择标定物(亮氨酸缺陷型筛选
标记) ;一个表达盒包括栗酒裂殖酵母全长的 nmt1
启动子(Pnmt1)-终止子(Tnmt1) ，其中夹着 1 个 GST
(glutathione S-transferase)基因和 1 个多克隆位点
(multiple cloning site，MCS)［16］。
1. 1. 2 培养基 LB培养基(胰蛋白胨 10 g /L、酵母
提取物 5 g /L、NaCl 10 g /L，pH7. 0)、YPD 培养基
(胰蛋白胨 20 g /L、酵母提取物 10 g /L、葡萄糖
20 g /L，pH7. 0)、EMM 培养基(邻苯二甲酸氢钾 3
g /L、磷酸氢二钠 2. 2 g /L、氯化铵 5 g /L、葡萄糖 20
g /L、Salts母液 20 mL/L、Vitamins母液 1 mL/L、Miner-
als母液 0. 1 mL/L，阻止表达时加入 VB1 0. 0076 g /L)，
固体培养基另加琼脂粉(Agar)15 g /L。
1. 1. 3 酶与试剂 限制性内切酶(NheⅠ、BglⅡ)、
Taq聚合酶、DNA回收试剂盒、X-Gluc、DL-2000、DL-
15000 DNA Marker 、T4DNA连接酶均购自大连宝生
物(TaKaRa)工程公司，卡那霉素、氨苄青霉素均为
国产试剂，其他试剂都是国产分析纯产品。引物合
成及目的基因测序由北京三博远志生物技术公司
完成。
1. 2 方法
1. 2. 1 PCR引物设计 根据 GUS基因序列和 35S-
GUS-NOS基因序列，应用 Primer Premier 5. 0 软件分
别设计一对特异性引物。
GUS 基因上游引物 GUS1 序列:TTTGCTAGC-
ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCG;
下游引物 GUS2 序列:GGTAGATCTTCATT-
GTTTGCCTCCCTGCTGCGG;
35S-GUS-NOS 基因上游引物 P1 序列:TTT-
GCTAGCGCAGGTCCCCAGATTAG;
下游引物 P2 序列:GGTAGATCTGATCTAGTAA-
CATAGATGACACCG。
划线部分分别为上、下游引物引入的 NheⅠ和
BglⅡ酶切位点。
1. 2. 2 GUS基因和 35S-GUS-NOS 基因的克隆 以
植物表达载体 pBI121 质粒 DNA 为模版，以 GUS1、
GUS2 和 P1、P2 为引物分别对目的基因进行 PCR扩
增。两者反应体系(25 μL)相同:ddH2 O 17. 2 μL，
10 × PCR buffer 2. 5 μL，MgCl2(25 mmol /L)2. 5 μL，
dNTP(10 mmol /L)0. 5 μL，上、下游引物(10 mmol /
L)各 0. 5 μL，模板(约 50 ng)1 μL，Taq DNA Poly-
merase(8. 34 × 10 －5 kat /L)0. 3 μL。GUS 基因扩增
反应程序:94℃预变性 5 min;94℃变性 45 s，60℃复
性 45 s，72℃延伸 1 min，31 个循环;72℃后延伸 8
min，4℃保存。35S-GUS-NOS 基因扩增反应程序:
94℃预变性 5 min;94℃变性 1 min 30 s，49℃复性 1
min 30 s，72℃延伸 1min 30 s，31 个循环;72℃后延
伸 10 min，4℃保存。
1. 2. 3 含 GUS基因和含 35 启动子连 GUS 基因的
粟酒裂殖酵母重组表达载体的构建及鉴定 用 Nhe
Ⅰ和 BglⅡ两种酶同时双酶切所扩增的 GUS 基因序
列、35S-GUS-NOS 基因序列和表达载体 pESP-2，该
步骤使用分步酶切。反应体系(20 μL) :ddH2 O 3
μL，10 × Buffer Tanqo 1 μL，DNA(目的片段或载体)
5 μL，NheⅠ1 μL，1. 5 h 后，每管分别再加入 ddH2O
291
2011 年第 7 期 王贺等:含 35S启动子的粟酒裂殖酵母表达载体的构建及功能鉴定
6 μL，10 × Buffer Tanqo 3 μL，BglⅡ1 μL，1. 5 h。反
应温度为 37℃。待酶切反应结束后，进行 1. 0%的
琼脂糖凝胶电泳，分别回收目的片段和载体，并用
T4DNA 连接酶进行过夜连接。连接体系(20 μL) :
ddH2O 11. 5 μL，10 × T4DNA 连接体系 Buffer 2 μL，
目的片段 4 μL，载体 2 μL，T4 DNA Ligase 0. 5 μL。
反应温度为 22℃。连接后，即得到重组质粒 pESP-
2-GUS 和 pESP-2-35S. GUS. NOS。转化大肠杆菌
DH5α，涂于含有 50 μg /mL 氨苄青霉素的 LB 固体
培养基上，37℃条件下倒置过夜培养，挑单菌落于含
有相同浓度氨苄青霉素的 LB 液体培养基中进一步
培养。提取重组质粒，分别进行 PCR检测与酶切鉴
定(体系和条件同 1. 2. 2)。
1. 2. 4 重组表达载体酵母菌转化及 PCR 鉴定
采用电击法同时将 pESP-2 空质粒、重组表达载体
pESP-2-GUS和 pESP-2-35S. GUS. NOS 转至栗酒裂
殖酵母菌体中［17］。将转有 pESP-2 空质粒和 pESP-
2-GUS质粒的菌液涂于不含有 VB1的 EMM 固体
培养基，将转有 pESP-2-35S. GUS. NOS 质粒的菌
液涂于含有 VB1的 EMM 固体培养基，30℃条件
下倒置培养数天。待都长出单菌落，分别挑单菌
落于 EMM 液体培养基(是否加入 VB1同上)中进
行培养，提取酵母质粒并分别进行琼脂糖凝胶电
泳检测。接下来对转有重组表达载体 pESP-2-
GUS 和 pESP-2-35S. GUS. NOS 的粟酒裂殖酵母
菌所提质粒进行 PCR 检测，筛选转化子并保存
菌种。
1. 2. 5 35S启动子启动效果的测定 将粟酒裂殖
酵母空菌培养于 YPD液体培养基中，将转有 pESP-2
空质粒、pESP-2-GUS 和 pESP-2-35S. GUS. NOS 重组
质粒的粟酒裂殖酵母菌各分别培养于 YPD、EMM
(含 VB1)和 EMM(不含 VB1)液体培养基中，将收集
后的菌体细胞分别悬浮于约 300 － 400 μL 的 GUS
染色液(0. 1 mol /L 磷酸缓冲液 pH7. 0，10 mmol /L
EDTA，0. 1% TritonX-100，0. 5 mmol /L 铁氰化钾，
0. 5 mmol /L 亚铁氰化钾，1 mmol /L X-Gluc)中［16］，
37℃染色 2 h后观察。
2 结果与分析
2. 1 GUS基因和 35S-GUS-NOS基因的克隆
以植物表达载体 pBI121 所提质粒 DNA 为模
板，利用所设计的引物 GUS1、GUS2 和 P1、P2 进行
GUS基因和 35S-GUS-NOS 基因的的 PCR 扩增，所
得产物经 1. 0%琼脂糖凝胶电泳，分别获得大小约
为 1 812 bp和约 3 006 bp的目的条带(图 1，图 2) ，
都与预期大小一致。
1．分子量标准 DL2000;2． GUS基因片段的 PCR产物
图 1 GUS基因片段的 PCR扩增结果
1．分子量标准 DL15000;2． 35S-GUS-NOS 基因片段的
PCR产物
图 2 35S-GUS-NOS基因片段的 PCR扩增结果
2. 2 含 GUS基因和含 35S-GUS-NOS基因重组表达
载体的构建
分别将电泳条带回收，经酶切、连接后，将连接
液转化至大肠杆菌，经菌液 PCR初步鉴定为阳性克
隆后，摇菌提取质粒，进行 NheⅠ和 BglⅡ的双酶切
鉴定。结果(图 3，图 4)表明，都切出与预期大小一
致的条带，约 1 812 bp和约 3 006 bp。另外，测序结
果也表明，重组质粒插入的外源片段与目标基因序
391
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
列一致。上述结果表明，已成功构建粟酒裂殖酵母
表达载体 pESP-2-GUS和 pESP-2-35S. GUS. NOS。
1．分子量标准 DL2000;2． NheⅠ和 BglⅡ酶切重组质粒
pESP-2-GUS
图 3 重组质粒 pESP-2-GUS的双酶切鉴定
1．分子量标准 DL15000;2． NheⅠ和 BglⅡ酶切重组质粒
pESP-2-35S． GUS． NOS
图 4 重组质粒 pESP-2-35S． GUS． NOS的双酶切鉴定
2. 3 重组表达载体的酵母菌转化
采用电击法将 pESP-2 空质粒、含 GUS 基因以
及含 35S 启动子连 GUS 基因的重组表达载体转入
粟酒裂殖酵母菌中，挑单菌落并标号，分别摇菌提取
质粒，进行琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到约 9 760
bp、1 1560 bp和12 755 dp的目的条带(图 5) ，都与
预期位置相同。且同时对重组表达载体 pESP-2-
GUS和 pESP-2-35S. GUS. NOS质粒进行 PCR 检测，
检测结果分别获得大小约为 1 812 bp和约 3 006 bp
的目的条带(图 6，图 7) ，都与预期大小一致。证明
粟酒裂殖酵母 pESP-2 空质粒、构建的带有 GUS 基
因和含有 35S 启动子连 GUS 基因的重组表达载体
都成功转入了粟酒裂殖酵母菌体中。
1．分子量标准 DL15000;2． pESP-2 质粒;3．含 GUS 基因
的重组表达载体质粒;4．含 35S启动子连 GUS基因的重
组表达载体质粒
图 5 粟酒裂殖酵母转化子的电泳检测
1．分子量标准 DL2000;2． 酵母转化重组质粒 pESP-2-
GUS的 PCR鉴定;3．阴性对照
图 6 pESP-2-GUS表达载体转化酵母重组质粒的 PCR检测
2. 4 35S启动子启动效果的测定
将粟酒裂殖酵母空菌与分别培养在 YPD、EMM
(含 VB1)和 EMM(不含 VB1)液体培养基中的转有
pESP-2 空质粒、pESP-2-GUS 和 pESP-2-35S. GUS. NOS
重组质粒的粟酒裂殖酵母菌体同时进行 GUS 染色，
结果显示，培养在 YPD 培养基中的，粟酒裂殖酵母
空菌、转有 pESP-2空质粒和 pESP-2-GUS重组质粒的
菌体都没有显示蓝色，而转有 pESP-2-35S. GUS. NOS
重组质粒的菌体被染成蓝色(图 8) ;培养在含有
VB1的 EMM 培养基中的，转有 pESP-2 空质粒和
pESP-2-GUS重组质粒的菌体都没有被染成蓝色，而
491
2011 年第 7 期 王贺等:含 35S启动子的粟酒裂殖酵母表达载体的构建及功能鉴定
1．分子量标准 DL15000;2． 酵母转化重组质粒 pESP-2-
35S． GUS． NOS的 PCR鉴定;3．阴性对照
图 7 pESP-2-35S． GUS． NOS表达载体转化
酵母重组质粒的 PCR检测
转有 pESP-2-35S. GUS. NOS 重组质粒的呈蓝色(图
9) ;培养在不含 VB1 的 EMM 培养基中的，转有
pESP-2 空质粒的菌体未显示蓝色，而转有 pESP-2-
GUS及 pESP-2-35S. GUS. NOS重组质粒的菌体显示
蓝色(图 10)。以上结果说明粟酒裂殖酵母空菌与
pESP-2 空质粒本身都不携带有 GUS基因。同时进
一步验证了 pESP-2 质粒自身的启动子 Pnmt1只有在
培养基中不含有 VB1的情况下，才能启动下游目的
基因的表达。而转有含 35S 启动子的重组表达载体
的粟酒裂殖酵母菌，无论在 YPD、含 VB1的 EMM，还
是不含 VB1的 EMM液体培养基中培养的，菌体均被
染成蓝色(图 10) ，说明连入的 35S 启动子不受培养
基中有无 VB1的影响，且能够成功地替代 pESP-2 质
粒自身的启动子启动下游目的基因的表达。
3 结论
本研究首次将植物性启动子 35S插入粟酒裂殖
酵母表达载体中，先后构建了含有 GUS 基因和含有
35S启动子连 GUS 基因的重组质粒。通过对 GUS
报告基因表达产物的 GUS 染色分析与比较，证明
35S启动子能够替代 pESP-2 质粒本身的受 VB1浓
度调控的启动子，从而成功构建了含有 35S 启动子
的粟酒裂殖酵母重组表达载体。将其应用于工业生
产中时，可将目的基因替换掉 GUS 基因。在对含该
重组质粒的粟酒裂殖酵母工程菌进行发酵生产目的
蛋白时，无需再考虑培养基中有无 VB1的因素。
1．粟酒裂殖酵母空菌;2． 转有 pESP-2 空质粒的粟酒裂
殖酵母菌;3． 转有 pESP-2-GUS 重组质粒的粟酒裂殖酵
母菌;4．转有 pESP-2-35S． GUS． NOS 重组质粒的粟酒裂
殖酵母菌
图 8 培养于 YDP液体培养基中
菌体的 GUS染色
1．转有 pESP-2 空质粒的粟酒裂殖酵母菌;2．转有 pESP-
2-GUS重组质粒的粟酒裂殖酵母菌;3． 转有 pESP-2-
35S. GUS. NOS重组质粒的粟酒裂殖酵母菌
图 9 培养于含有 VB1的 EMM液体培养
基中的菌体 GUS染色
1．转有 pESP-2 空质粒的粟酒裂殖酵母菌;2．转有 pESP-
2-GUS重组质粒的粟酒裂殖酵母菌;3． 转有 pESP-2-
35S. GUS. NOS重组质粒的粟酒裂殖酵母菌
图 10 培养于不含 VB1的 EMM液体培养
基中的菌体 GUS染色
591
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
另外，酵母类饲料在动物饲养中已有广泛的应
用。利用酵母富集微量元素，以及利用酵母表达系
统合成和分泌外源酶、抗菌肽等物质，作为“绿色”
活性饲料添加剂在饲料业中拥有着广阔的应用前
景［18］。其在饲料工业中的应用，为本研究营造了广
泛的应用空间。
随着生物技术、发酵工业及饲料工业的不断发
展，酵母的开发，以及利用酵母发酵生产产品已成活
跃的领域［19］。我们需要做的工作是进一步完善酵
母表达系统，使越来越多的目的蛋白可以在该系统
中获得高效表达。
参 考 文 献
［1］岳强，周惠．粟酒裂殖酵母———种良好的真核模式生物． 韶关学
院学报:自然科学版，2003，24(3) :21-26．
［2］董清华，沈元月． 酵母表达系统研究进展． 北京农学院学报，
2008，23(2) :72-76．
［3］吴丽娟，蒋建新，朱佩芳，等．酵母表达系统及其应用研究．生命
的化学，2003，23(1) :46-50．
［4］信丰学，王鹏，钟盛华．粟酒裂殖酵母 N-糖酰胺酶在大肠杆菌中
的表达、纯化及活性分析．生物工程学报，2008，24(4) :592-597．
［5］Forsburg SL． Codon usage table for Schizosaccharomyces pombe． Yeast，
1994，10(8) :1045-1047．
［6］李思光，周惠，张鹏，等．两个新的粟酒裂殖酵母 box H /ACA sno
RNA的鉴定、功能分析及进化意义． 自然科学选展，2005，15
(3) :282-290．
［7］赵特，罗梅浩，郭线茹，等．烟夜蛾滞育激素基因在粟酒裂殖酵
母中的表达．河南农业大学学报，2008，42(4) :423-426．
［8］吴朝霞，郑文岭，马文丽．裂殖酵母作为外源基因表达系统．生物
科学研究，2004，8(2) :110-116．
［9］Wood V，Gwilliam R，Rajandream MA，et al． The genome sequence
of Schizosaccharomyces pombe． Nature，2002，415(6874) :871-876．
［10］王海海，吴慎杰，李飞飞． 35S启动子甲基化引起棉花转基因沉
默．棉花学报，2008，20(4) :274-280．
［11］焦改丽，孟钊红，聂安全．花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子
在转基因棉花中的表达．作物学报，2004，30(11) :1135-1139．
［12］ Hirt H，Kgl M，Murbacher T，et al． Evolutionary conservation of
transcriptional machinery between yeast and plants as shown by the
efficient expresion from the CaMV 35S promoter and 35S termina-
tor． Current Genetics，1990，17(5) :473-479．
［13］Lu J，Zhao HY，He YK，et al． Advances and progresses of high pro-
moter research and its application． Natural Science Progresses，
2004，14(8) :856-862．
［14］Yang NS，Christou P． Cell type specific expression of a CaMV 35S-
GUS gene in transgenic soybean plants． Developmental Genetics，
1990，11(4) :289-293．
［15］ Jefferson RA． Assaying chimeric genes in plants:the GUS gene fu-
sion system． Plant Molecular Biology Reporter，1987，5 (4) :
387-405．
［16］Wood V，Gwilliam R，Rajandream MA，et al． The genome sequence
of Schizosaccharomyces pombe． Nature，2002，4(15) :871-876．
［17］丁志山，蒋承俊，吴根福．电穿孔法转化完整酵母的研究． 生物
技术，1995，5(4) :9-12．
［18］Chang EC，Barr M，Wang Y，et al． Cooperative interaction of S．
pombe proteins required for mating and morphogenesis． Cell，1994，
7(9) :131-141．
［19］储晨亮，孙伟．酵母在饲料业中的研究和应用．饲料博览，2007，
3(2) :19-22．
(责任编辑 狄艳红)
691