全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (3): 372-388, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-11-10; 接受日期: 2007-01-31
基金项目: 国家自然科学基金(No. 30221002)
* 通讯作者。E-mail: ybxue@genetics.ac.cn
.综述.
基于 S-核酸酶的自交不亲和性的分子机制
张一婧, 薛勇彪 *
中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100080
摘要 自交不亲和性是一种广泛存在于显花植物中的种内生殖障碍, 可以抑制近亲繁殖而促进异交。其中, 以茄科、玄参科
和蔷薇科为代表的配子体自交不亲和性是最常见的类型。这类自交不亲和性是由单一的多态性S-位点所控制。目前的研究发
现这一位点至少包含两个自交不亲和反应特异性决定因子: 花柱中的S-核酸酶和花粉中的SLF(S-Locus F-box)蛋白。该文将
主要介绍并讨论基于S-核酸酶的自交不亲和性分子机制的研究进展。
关键词 内吞, F-box, 自交不亲和性, 泛素
张一婧, 薛勇彪 (2007). 基于 S-核酸酶的自交不亲和性的分子机制. 植物学通报 24, 372-388.
被子植物是地球上分布最广泛的一类植物, 其重要
的特征之一在于它拥有一种在其它植物中所没有的生殖
器官——花, 因而它也被称为显花植物。然而, 许多显
花植物的花都同时拥有雄蕊与雌蕊。显然, 这些雌雄同
株植物进行自花授粉的可能性非常大, 因此可能降低这
一类植物的遗传多样性, 不利于其后代个体的生长。为
了避免这种情况的发生, 植物采取了多种策略来抑制近
亲繁殖并促进异交, 自交不亲和性(self-incompatibility,
SI)就是其中最为重要的一种。
自交不亲和性是指可育的雌雄同花植物在自花授粉
后不能产生合子的现象与机制(de Nettancourt, 2001)。
自交不亲和性机制的存在促进了植物遗传多样性的保持,
从而提高了植物应对自然选择的能力和进化潜力。一
般认为, 自交不亲和性的产生可能与被子植物的高度分
化和广泛分布密切相关。
目前分子生物学研究比较多的自交不亲和植物主要
分布在 5个科: 茄科、蔷薇科、玄参科、罂粟科和十
字花科(Takayama and Isogai, 2005)。研究表明, 这
5个科的花粉和花柱的识别都是由单一的多态性位点, 即
自交不亲和位点(S-位点)所控制的。当然, 自交不亲和
反应的完成, 也需要 S-位点之外基因产物的参与。然
而, 这一过程中识别与作用的特异性是由S-位点的基因
产物来决定。也就是说, 花粉和花柱的识别是由同处于
S - 位点的 2 个 S - 基因来决定的。在不同单倍型
(haplotype)(如S1, S2, S3, ⋯, Sn)中, 这 2个S-基因存
在着一定的多态性, 编码着结构相似但不完全等同的花
粉或花柱决定因子(de Nettancourt, 2001; Takayama
and Isogai, 2005)。
在自交不亲和反应中, 花粉的遗传背景决定了它是
否能被花柱所接受。根据这种遗传背景的特点, 上述 5
个科植物的自交不亲和可以分为两类: 配子体自交不亲
和(gametophyi t ic SI , GSI )和孢子体自交不亲和
(sprophytic SI, SSI)。茄科、蔷薇科、玄参科和罂
粟科属于配子体自交不亲和, 因为它们的花粉亲和与否
决定于该花粉(配子体)自身的基因型。也就是说, 如果
花粉的基因型(Sx)与花柱(二倍体)的基因型(SxSy)只要有
一个相同, 那么这粒花粉就不能被该花柱所接受。而在
十字花科中, 花粉的自交不亲和表型是由它们的二倍体
亲本(孢子体)的基因型来决定的。这意味着, 如果在产
生花粉的亲本植株的两个基因型(如SxSy)中, 只要有一
个与花柱(二倍体)的某一个基因型相同, 那么这些花粉的
萌发或生长就会被该花柱所抑制(de Nettancourt, 2001;
Takayama and Isogai, 2005) (图 1)。
茄科、蔷薇科、玄参科和罂粟科植物所拥有的配
373张一婧等: 基于S-核酸酶的自交不亲和性的分子机制
子体自交不亲和的分子机制也存在着很大的不同。茄
科、蔷薇科和玄参科植物的花柱决定因子已经被鉴定
为S-核酸酶(S-RNase)。它们呈现S-单倍型间的高度
多态性, 有着类真菌T2型核酸酶结构和核酸酶活性的糖
蛋白, 分子量为 30 kDa左右。而花粉决定因子则被确
认为一类F-box蛋白, 可能作为一种泛素连接酶SCF复
合体(SKP1-CUL1-F-box)的组分识别有待泛素化乃至降
解的底物蛋白(Kao and Tsukamoto, 2004)。在罂粟科
中, 已被鉴定的S-蛋白(花柱决定因子)与上述蛋白截然
不同, 而且现有的研究表明这一类自交不亲和可能与细
胞程序性死亡有关(Thomas et al., 2003)。另外, 十字
花科的自交不亲和涉及受体激酶和配基的相互作用
(Takayama et al., 2001)。因此, 上述 5个科中, 存在
着3类不同的自交不亲和机制。为了方便起见, 我们可
以分别称之为茄科类型的自交不亲和、罂粟科类型的
自交不亲和以及十字花科类型的自交不亲和。鉴于这3
种机制在微观层面上有着很大差异, 而近几年来对于以
茄科、蔷薇科和玄参科为代表的配子体自交不亲和系
统的研究取得了突破性进展, 因此, 本文将主要讨论茄科
类自交不亲和系统的研究进展, 相关的工作也可以参考
其它有关文献(Kao and Tsukamoto, 2004; Takayama
and Isogai, 2005; McClure, 2006)。
1 花柱SI特异性决定因子S-核酸酶
通常, 根据SI的遗传和生理特性, 要分离S-单倍型基因
产物就需要寻找与特异S-基因共分离的雌蕊或花粉蛋
白。比如, 要分离植株在雌蕊中 S1基因型的特异产物,
就要寻找一类在所有具有S1基因的植株中都有, 而在所
有无 S1基因的植株中都没有的蛋白。
20世纪80年代, Clarke实验室在茄科植物花烟草
(Nicotiana alata)的花柱中分离到一种与特定单倍型共分
离的糖蛋白(Anderson et al., 1986)。N端测序和随后
的cDNA克隆第一次得到了茄科植物中参与自交不亲和
反应的花柱 S-基因。在接下来的几年里, 茄科其它植
物和一些蔷薇科植物的花柱S-基因也陆续通过类似的
图 1 配子体自交不亲和性的模型
Figure 1 Genetic control of gametophytic self-incompatibility (GSI) (Franklin-Tong and Franklin,2003)
374 植物学通报 24(3) 2007
技术手段得到分离(Ai et al.,1990; Clark et al.,1990;
Sassa et al.,1993; Ishimizu et al.,1996)。随着大量
S-基因的鉴定, 这类蛋白的保守结构和系统进化关系也
越来越清晰, 从而促成了基于PCR技术的金鱼草3个单
倍型(S2、S4和 S5)花柱 S-基因的分离(Xue et al.,
1996)。这表明了玄参科植物也有着与茄科类型相似的
自交不亲和机制。
已有的研究表明, 这些花柱S-蛋白在结构上与真菌
T2核酸酶相似, 并在体外有着核酸酶的活性(McClure et
al.,1989; Singh et al.,1991), 因此它们被称为S-核酸
酶。1994年, 在矮牵牛和烟草中的转基因实验最终确
认了S-核酸酶就是自交不亲和反应中控制花柱特异性
的关键因子(Lee et al., 1994; Murfett et al., 1994)。
在转基因植物中, 一个新单倍型的S-核酸酶基因的导入
会让这株植物的花柱获得排斥与转入S-核酸酶单倍型
一致的花粉的能力。反过来, 如果某个单倍型 S-核酸
酶的表达由于相关的反义基因的导入而受到抑制, 那么
相应单倍型的花粉就会被转基因植株接受从而自交亲
和。上述结果表明S-核酸酶对于自交不亲和反应的完
成是必需的, 而且它独立介导着这一反应中花柱的特异
性。因而, 茄科类型的自交不亲和也被称为基于 S-核
酸酶的自交不亲和 ( S - R N a s e - b a s e d s e l f -
incompatibility)。
S-核酸酶在花柱中大量表达, 并被分泌到花柱传输
组织细胞外基质, 在那里积累到非常高的浓度(10-50
mg.mL-1)。目前一般认为, 胞外积累的不同单倍型的
S-核酸酶无差别地进入花粉管内(Luu et al., 2000), 如
果不被花粉管内的因子所抑制, 那么S-核酸酶的细胞毒
性就会被释放, 从而导致不亲和反应的发生。
不同S-单倍型核酸酶有着高度的多态性, 其氨基酸
一致程度在 38％-98％之间。序列比对分析结果表明,
茄科 S-核酸酶有 C1-C5 5个保守区域(Ioerger et al.,
1991; Tsai et al.,1992), 而蔷薇科和玄参科 S-核酸酶
则有 4 个保守区域(缺少相应于茄科中的 C4 保守区)
(Ishimizu et al., 1996; Xue et al., 1996)。C2和 C3
这2个保守区与真菌RNase T2的相应2个保守区结构
相似, 而且在这2个保守区内, 都各有1个保守的核酸酶
催化活性的组氨酸残基。如果把这其中任何一个组氨
酸残基突变成天冬氨酸或精氨酸, 那么表达这些突变核
酸酶的植株将丧失排斥相应 S - 单倍型花粉的能力
(Huang et al., 1994; Kowyama et al.,1994; Royo et
al.,1994)。这表明, 核酸酶活性对花柱 S-蛋白在自交
不亲和反应中的作用是关键的。综合McClure等(1990)
观察到自交花粉管 rRNA被降解这一事实, 有理由认为
S-核酸酶进入自交花粉管后可能会导致 rRNA的降解,
从而引起花粉管生长受抑制。然而, 目前已有的实验证
据并不能直接证明rRNA的降解是自交不亲和反应的原
因而不是结果。换句话说, 花粉管受到抑制乃至解体可
能会伴随其rRNA的降解, 但却不一定是由S-核酸酶所
介导的 rRNA降解所引起。
2 花粉SI决定因子SLF
已有的研究表明, S-核酸酶的功能缺失或获得性突变只
能改变花柱而非花粉的自交不亲和表型。这意味着, 在
花粉中还有一个单倍型特异的决定因子, 也称为花粉S-
基因。可以推测, 这个决定因子有着这样的特性: 在花
粉中表达应该是特异的, 在各单倍型间呈多态分布并位
于 S-位点, 也就是与S-核酸酶基因连锁。根据这几个
特性, 人们设计了不同的策略, 如mRNA差异显示和差
减杂交, 但都未获得严格符合上述几点的候选花粉S-基
因(Li et al., 2000; McCubbin et al., 2000; Wang et
al.,2003)。Lai等(2002)利用构建的金鱼草细菌人工染
色体(BAC)文库筛选到一个含有S2核酸酶的63.7 kb的
BAC克隆, 并在其中距离S2核酸酶9 kb的位置发现了
一个新基因, 因其编码一个带有F-box结构域的蛋白, 因
而命名为AhSLF-S2(Antirrhinum hispanicum S-locus
F-box S2)。
AhSLF-S2在花粉中特异表达, 这提示我们该基因很
可能编码人们寻觅了 10余年的花粉 S决定因子。对
AhSLF-S2的Southern杂交结果分析表明, 它在各S-单
倍型中的等位基因很可能是高度相似的。因此, 虽然由
于各S-单倍型中S-核酸酶与SLF的距离不等而导致寻
找AhSLF-S2的策略难以在其它单倍型中奏效, Zhou等
375张一婧等: 基于S-核酸酶的自交不亲和性的分子机制
(2003)仍然基于同源克隆的方法得到了AhSLF-S2在其
它S-单倍型的等位基因。与金鱼草各单倍型的S-核酸
酶有着高度多态性不一致的是, 这些SLF基因所编码蛋
白的一致性可达 95％以上, 仅在 3UTR处有较大的差
异。根据3UTR设计特异引物对金鱼草群体的PCR结
果显示, 这些 SLF基因与来自同一单倍型的 S-核酸酶
是紧密连锁的, 从而确认了它们就是金鱼草各S-单倍型
的SLF等位基因, 而非某一单倍型内的重复基因。我们
亦称之为AhSLF-S2的直系同源(orthologous)基因。同
时, 对这些SLF等位基因周边序列的测序结果显示, 往
往有2个以上的类似F-box基因与各AhSLF-S2等位基
因伴随存在, 这些基因一般就被称为AhSLF-S2的旁系
同源(papralogous)基因。如在 S2单倍型中, 存在着
SLF-S2A和S2C; 在S4单倍型中则分离到SLF-S4A和
S4D; 在S1和S5单倍型中则分别发现了S1E和S5A。其
中, AhSLF-S1E、S2CA和 S4D均在花粉中特异表达
(Zhou et al.,2003)。
在AhSLF-S2克隆之后, 又有一系列基于S-核酸酶
的自交不亲和植物的 S-位点 F-box基因得到鉴定。对
蔷薇科S-位点的测序结果显示, 也有2个编码F-box蛋
白的基因与 S-核酸酶连锁, 并在花粉中表达。这大抵
上相当于我们对金鱼草所定义的直系同源和旁系同源这
2类SLF基因。与金鱼草及茄科植物不同的是, 蔷薇科
的 S-位点似乎要小得多, 测出 2类 F-box与 S-核酸酶
基因仅需要不过70 kb的片段, 这一点可能与蔷薇科植
物基因组较小有关。更需要强调的是, 蔷薇科这2类编
码F-box蛋白的基因中有一类在各S-单倍型间有着显著
的多态性, 大致与蔷薇科S-核酸酶的多态性相当, 因此,
在扁桃(Prunus dulcis)中, 它被命名为PdSFB(P. dulcis
S-haplotype-specific F-box gene)。而另一类基因则
编码各 S-单倍型间一致性高达 95％的 F-box蛋白, 在
Prunus dulcis被命名为 PdSLF(P. dulcis S-locus F-
box gene)(Ushijima et al., 2003)。需要指出的是, 这
2类基因被命名为SFB或SLF是为了标识其S-单倍型
间多态性的高低程度与AhSLF是否相似。如PdSLF与
AhSLF在各单倍型间相似程度都相当大, 而非表明这些
基因与 AhSLF是否存在直系同源关系。毕竟, 这 2类
Prunus S-基因所可能编码的蛋白与AhSLF的一致性均
小于 25％。而在日本杏(Prunus mume, 即所谓 Japa-
nese Apricot)中, 也有人克隆到离S-核酸酶最近的编码
F-box蛋白的基因, 并命名为 SLF基因(Entani et al.,
2003)。在不同 S-单倍型间的, PmSLF氨基酸一致性
在80％左右, 这表明, PmSLF与PdSFB可能互为同源
基因。总之, 蔷薇科自交不亲和机制研究者倾向于认为
上述有着较大多态性的SLF/SFB基因可能编码花粉决
定因子。最近, 2个实验室报道了 3个蔷薇科自交不亲
和花粉方面突变体, 即这些突变体仅影响到植物花粉自
交不亲和性的维持, 而不影响花柱排斥自体花粉的能
力。这3个突变体中, 来自甜樱桃(Prunus avium)的S4
突变体的 SFB-S4基因被插入 4个碱基而导致移码; 来
自日本杏的Sf突变体的SFB基因在蛋白编码区中部被
插入一个6.8 kb的片段(Ushijima et al., 2004); 而另一
个来自甜樱桃的 S 3 突变体的 S F B 基因则缺失
(Sonneveld et al., 2005)。无论前 2个突变体是否形
成有缺陷的 SLF/SFB蛋白, 第 3个突变体的SLF/SFB
的缺失都暗示, 正是SLF/SFB的功能丢失导致植物自交
不亲和性的丧失。这表明, 蔷薇科中 SLF/SFB可能编
码决定自交不亲和反应中花粉特异性的因子。
SLF/SFB与 S-核酸酶在染色体上位置连锁, 并且
这些F-box蛋白在不同单倍型间有一定程度的多态性,
暗示 SLF/SFB很可能就是花粉 SI特异性因子。而且,
SLF/SFB与 S-核酸酶可能不仅在基因组中紧密联系,
它们所编码的蛋白产物在细胞中也可能互相识别和作
用。 关于这一点, Qiao等(2004a)通过相关的酵母双杂
交、pull-down和免疫沉淀实验得到证实。虽然这些
以玄参科植物金鱼草为材料的实验结果并没有显示出
SLF与不同单倍型的S-核酸酶的作用程度有所不同, 但
是, 这些结果第一次显示了SLF与花柱决定因子S-核酸
酶可以发生直接的相互作用。最近, Hua和Kao(2006)
通过酵母双杂交及pull-down等一系列手段证明茄科植
物膨大矮牵牛(Petunia inflata)的SLF与不同S-单倍型
的 S-核酸酶的作用程度似乎有所不同。
可以肯定, 确认SLF即是自交不亲和反应中花粉决
定因子的证据仍需要来自于转基因实验, 而这项工作在
376 植物学通报 24(3) 2007
自交不亲和的膨大矮牵牛中得以完成。在对 P. inflata
S-位点的328 kb的区域进行充分搜索后鉴定到一个多
态的编码 F-box蛋白的基因 PiSLF(Sijacic et al.,
2004)。尽管也分离到另外2个与S-核酸酶连锁的编码
F-box蛋白的基因A113和A134, 但鉴于PhSLF编码的
蛋白在各单倍型间多态性(10.3%-11.6%)大于A113(3.
2%-5.1%)和A134(1.8%-3.4%), 而且与S-核酸酶的
物理距离更近(161 kb, 而其它基因至少在 180 kb至 4
M碱基对之间)(Wang et al.,2003), 因此PiSLF被视为
矮牵牛中最为可能的表达花粉决定因子的候选基因。
PiSLF的转基因研究的实验设计主要是根据一种被
称为“竞争性作用(competitive interaction)”的现
象。长期研究表明, 在具有基于 S-核酸酶自交不亲和
机制的植物中, 如果某一个株系的花粉由自交不亲和变
为自交亲和, 而花柱仍可维持禁止自交的能力, 那么至少
在茄科和玄参科中, 这种花粉的突变绝大多数(如果不是
全部)是由S-位点相关区段的重复所致, 这一重复被认
为很可能引入了另一个拷贝的花粉S-基因(Golz et al.,
1999, 2001)。最近, 在 Petunia axillaris中有一个品
系的花粉方面突变体被确认为有2个不同单倍型SLF基
因存在于单倍体的花粉内, 因而导致了花粉的自交不亲
和能力的丧失(Tsukamoto et al., 2005)。无独有偶, 在
四倍体植株中, 它们的花粉如果是杂合二倍体(如S1S2),
那么这种花粉对所有这个种内的野生型花柱都是亲和的,
而纯合的二倍体花粉(如S1S1)则仍然不能被有着相同单
倍型的花柱(如 S1Sx)所接受。这种情况也可以归于上
述所谓的“竞争性作用”现象。
因此, 将PiSLF的S2单倍型等位基因(PiSLF2)分别
转入多个S-单倍型(如S1S1、S1S2和S2S3)的P. inflata
植株, 这些转基因植株变为自交亲和(Sijacic et al.,
2004)。对这些转基因植物的自交后代基因型的分析结
果显示, 只有那些来源于S1或S3单倍型的转PiSLF2花
粉才会丧失其自交不亲和的特性从而产生自交后代, 而
那些来源于S2单倍型的转PiSLF2花粉仍然可以被S2单
倍型的花柱抑制。鉴于这些带有特异性的转基因表型
与“竞争性作用”现象完全一致, 人们可以确信 SLF
基因正是花粉 S- 基因。
同时, Qiao等(2004b)也对另一种自交不亲和的矮牵
牛 P. hybrida进行了转基因实验。首先, 将带有 S2核
酸酶和AhSLF-S2的可转化人工染色体(TAC)质粒转入
S3S3基因型的矮牵牛, 用转基因矮牵牛的花粉对 S3S3
的花柱授粉可以结籽。至此, SLF/SFB因其与 S-核酸
酶有较近的物理距离, 花粉特异表达, 不同单倍型编码的
蛋白间一定程度的多态性以及一些遗传学上的证据而被
认定为基于S-核酸酶的自交不亲和反应中的花粉决定
因子。
3 其它参与基于S-核酸酶的自交不亲和
反应的因子
S-位点编码了决定自交不亲和反应特异性的因子, 但是
整个自交不亲和反应的完成, 只有负责特异性的因子是
远远不够的, 在S-位点以外还存在着很多不与S-位点
连锁但参与自交不亲和反应的因子(Kondo e t a l . ,
2002)。
3.1 HT蛋白
一个研究较为详细的例子就是HT蛋白(McClure et al.,
1999; Kondo et al., 2002; O’Brien et al., 2002)。为
了寻找花柱中除S-核酸酶以外的参与自交不亲和反应
的因子, McClure 等(1999)利用Nicotiana的2个很相近
的种属进行花柱表达基因的差异筛选, 最终鉴定到一类
在成熟花柱中特异表达、富含天冬酰胺的小蛋白——
HT蛋白。其中一个 HT基因经反义转化实验证明它对
自交不亲和反应是必需的, 抑制该基因的表达并不影响
S-核酸酶的转录或蛋白表达, 但却使花柱丧失了排斥自
己单倍型花粉的能力。在番茄中, 研究发现HT蛋白可
分为两类, 即HT-A和HT-B, 后者与自交不亲和反应密
切相关, 在亲和种属花柱中 H T - B 的表达明显降低
(Kondo et al., 2002)。在其它的茄科植物中也发现了
这类HT基因的存在, 并且根据同源关系也都可以分为
A类和B类。进一步研究发现只有降低花柱内HT-B的
表达, 才能使植株由自交不亲和变为自交亲和(O’Brien
et al., 2002)。这些结果都表明只有 HT-B一种亚型在
377张一婧等: 基于S-核酸酶的自交不亲和性的分子机制
自交不亲和反应中起作用。Goldraij等(2006)在最近一
项研究中赋予该基因产物一个重要作用——使不亲和花
粉管中的液泡破裂, 从而抑制花粉管生长, 但是具体机制
还有待研究。
3.2 120K蛋白
还有一个例子就是同样在花烟草中发现的 120K蛋白
(Lind et al., 1996; Cruz-Garcia et al., 2005)。120K
蛋白是一个分子量为120 kDa的糖蛋白, 它在花柱的细
胞外基质中非常丰富, 并可以进入正在生长的花粉管
中。实验发现, 120K蛋白可以在体外与S-核酸酶结合,
并且其RNAi的转化植株丧失了花柱自交不亲和性的表
型, 说明它参与自交不亲和反应, 并且当它被破坏时, 自
交不亲和反应就不能正常进行。
3.3 SSK1
Qiao等(2004a) 的免疫共沉淀和pull-down实验结果表
明: AhSLF-S2可能与 Ask-1和 Cul-1类似蛋白相互
作用, 形成类似Skp1/Cul或CDC53/F-box(SCF)复
合体。免疫共沉淀实验显示, 亲和授粉后的花柱中的
核酸酶可能被泛素化, 而用不亲和花柱粗提液培养的
花粉中的核酸酶没有泛素化。AhSLF-S2可能用通过
形成SCFAhSLF-S2复合体在亲和授粉过程中使S-核酸
酶泛素化。
因此, 我们进行了金鱼草SCF 复合体组分的分析。
Huang等(2006)以酵母双杂交的方法从cDNA文库中筛
到了 AhSSK1。SSK1(SLF-interacting SKP1-like1)
位于S-位点外, 是一类新的植物SKP1-like基因。GST
pull-down结果显示AhSSK1能够与 AhSLF和CUL1-
图 2 一种抑制剂假说示意图
S1单倍型的花粉授到 S1S2植株的柱头上后, 花柱道中的 S1核酸酶(蓝色)和 S2核酸酶(红色)共同进入 S1花粉管, 花粉管中 SI特异因子
(Pollen S)的特异识别, 导致异己的 S2核酸酶活性受到 RNA酶抑制剂的(RNase inhibitor)抑制, 而自己的 S1核酸酶则受到保护不被降解,
从而引起自交不亲和反应, 但是 Pollen S特异识别的机制还有待研究。
Figure 2 Schematic representation of the inhibitor model (Franklin-Tong and Franklin,2003)
Secreted S-RNases,S1 (blue) and S2 (red) are taken up into growing S1 pollen tube. A cytosolic pollen RNase ‘inhibitor’ (shown in
grey) could recognize and inactivate non-self S2 S-RNase, whereas self S1 S-RNase could be protected by pollen S product
remains active and is able to degrade the pollen tube rRNA. But, the mechanism of the pollen S product specificity remains unclear.
378 植物学通报 24(3) 2007
like相互作用, 可能形成包括 SSK1、CUL1、SLF和
Rbx1的SCF复合体。至于SSK与SLF是否形成SCF
泛素连接酶并引导底物蛋白S-核酸酶进入蛋白酶体降
解过程 , 尚需要进一步的证据。蔷薇科中是否存在
SSK1的类似蛋白质, 尚无报道。
3.4 PhSBP1
PhSBP1(P. hybrida S-核酸酶-binding protein1)是一
个从矮牵牛(P. hybrida)花粉 cDNA文库中筛选得到的
RING-finger蛋白(Sims and Ordanic, 2001)。PhSBP1
在酵母中非特异地与不同单倍型的S-核酸酶的N端(包
括HVa和HVb)作用, 它在各种组织中广泛表达, 其基因
也并不与 S-位点连锁。这些证据都表明, PhSBP1不
可能是花粉决定因子。作为一个 RING-f inger蛋白,
PhSBP1被推测可能作为一个泛素连接酶行使对S-核
酸酶标记多聚泛素链的功能(Sims and Ordanic, 2001)。
Hua和 Kao(2006)通过酵母双杂实验证明, PiSBP1
(Petunia inflata SBP1)可能在体外与 PiSLFs、S-
RNases、PiCUL1及E2泛素结合酶作用, 但还需要相
关的遗传学和体内生化分析研究证据支持。
4 基于S-核酸酶的自交不亲和反应的分
子机制
普遍认为, S-核酸酶的细胞毒性是自交不亲和反应中抑
制花粉管生长的关键因素。那么, 核酸酶是如何进入花
粉管并发挥作用的呢？目前有 2种假说。(1)受体假说,
认为花粉管细胞膜或细胞壁上有S-核酸酶特异的受体
结合, 只有自己单倍型的核酸酶可以进入花粉管; (2)抑
制剂假说, 认为在花粉管细胞的细胞质内存在抑制剂, 抑
制除了自己单倍型以外的S-核酸酶的活力, 最终保留自
己的 S-核酸酶的活力(图 2)。
Luu 等(2000)利用免疫定位技术发现S-核酸酶在花
柱内生长的自己和异己的花粉管细胞质内都存在, 表明
花粉管摄入S-核酸酶是没有单倍型特异性的, 从而否定
了受体假说。
S-核酸酶进入异己的花粉管细胞质后是怎样失去细
胞毒性作用的呢？具体的分子机理是什么？这些疑问吸
引着研究人员对花粉SI特异因子SLF/SFB等F-box蛋
白的未知功能进行深入分析。
5 泛素化系统
5.1 泛素化系统简介
提及F-box蛋白的功能, 必须先介绍一下2004年诺贝
尔化学奖得主的主要贡献, 即泛素介导的蛋白降解过
程的发现。瑞典皇家科学院的 Lars Thelander教授
在诺贝尔奖颁奖仪式上做了如下演说: “通过研究细
胞提取液中需能的蛋白降解过程, 今年的3位获奖人
在20世纪80年代初成功地发现一类全新的蛋白降解
定律。他们找到一个使用3种不同的酶给将被降解的
蛋白加上‘死亡标签’的系统。在这一过程中 , 能
量被用来激活这种标记, 保证了细胞对这个过程的精
确控制。”
这种“死亡标签”就是泛素(ubiquitin), 一个由 76
个氨基酸组成的高度保守的小分子量蛋白, 因其广泛分
布于各类细胞而得名。当然, 在原核生物中并没有发现
泛素的存在。上面演说中提到的3种酶, 分别是泛素激
活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)、泛素结合酶
(ubiquitin-conjugating enzyme, E2)和泛素连接酶
(ubiquitin ligase, E3)。E1水解 ATP以获取能量, 并
通过其活性位置的半胱氨酸残基与泛素的羧基末端形成
高能硫酯键而激活泛素, 然后 E1将泛素转交给 E2, 能
与活化泛素——E2中间体作用的E3则特异性地识别待
降解的底物蛋白, 并将E2上的泛素转移到底物蛋白上。
以上过程多次循环往复, 将底物蛋白标记上多聚泛素链
(一般至少连续标记 4个泛素)被 26S 蛋白酶体(26S
proteasome)识别并降解(Hershko and Ciechanover,
1998; Pickart, 2001)(图 3)。
泛素-蛋白酶体系统介导的蛋白降解在真核生物细
胞中不可或缺。这一系统负责清除异常和废物蛋白,
维持着游离氨基酸的供给; 降解细胞内关键调控因子,
从而关闭某一个通路或网络, 使细胞适应新的环境和
发育阶段。
379张一婧等: 基于S-核酸酶的自交不亲和性的分子机制
图 3 泛素 -蛋白酶体系统
Figure 3 Ubiquitin-proteasome system mediated protein degradation (http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/
2004/public.html)
380 植物学通报 24(3) 2007
5.2 SCF复合体泛素连接酶(E3)
泛素化系统的3个酶中, 泛素连接酶(E3)数量最大, 结构
也最为复杂。大致可以分为 2类, 即HECT(Homology
to E6AP C Terminus)类和 RING(Really Interesting
New Gene)类(图 4)。这 2类 E3得名于它们所含有的
结构域, 也就是HECT结构域或RING结构域。HECT
类一般都是单亚基的。RING类泛素连接酶有单亚基和
多亚基 2 大类。
SCF复合体是植物中最大的一类多亚基E3家族。
在拟南芥和水稻中, F-box蛋白均超过700个, 同时它也
被研究得最多而且最深入。已知 SCF复合体由 4种蛋
白组成: SKP1、CUL1、F-box蛋白和RBX1(RING box
1)。在这个复合体中, CUL1作为支架结合 RBX1和
SKP1(Zheng et al., 2002), 而作为接头的 SKP1则结
合各种各样的介导底物特异性的F-box蛋白以形成多种
SCF复合体。目前已知的SCF复合体的靶蛋白包括转
录因子、细胞周期调控因子以及各种在发育和信号转
导过程中发挥作用的元件(Hershko and Ciechanover,
1998; Smalle and Vierstra, 2004; Moon et al., 2004;
Ni et al., 2004; Petroski and Deshaies, 2005)。
F-box蛋白得名于它在N端的一个保守的呈松散状
约 40个残基的F-box结构域。这一结构域被认为是F-
box蛋白中主导与SKP1作用的区域(Schulman et al.,
2000)。F-box蛋白的 C端, 往往负责底物识别的特异
性。因此, F-box蛋白的这一区域也蕴藏着多种蛋白 -
蛋白互作结构域, 比如Leu-rich repeat、Kelch和WD-
图 4 E3结构示意图
(A) HECT类 E3: HECT结构域位于蛋白的 C端, 大约由 350个氨基酸组成, 其中含有泛素结合位点和泛素 -E2中间体结合位点；
(B)单亚基 RING/U-box类的 E3: U-box结构域与 RING在结构上相似, 而它们的区别在于U-box不像 RING一样通过结合锌来稳定自身
结构, 这些 RING/U-box单亚基 E3在催化泛素转移到底物蛋白的赖氨酸残基时充当 Ub-E2的停泊位点, 并伴随着构象变化;
(C) SCF复合体, 多亚基 RING类的典型代表, 由 SKP1、CUL1、F-box蛋白和 RBX1(RING box 1)4种蛋白组成;
(D) APC复合体, 多亚基 RING类代表, 其结构在各类 E3中最为精细, 核心组分至少有 11种。
Figure 4 Organization and structure of E3s (Vierstra, 2003)
(A) HECT E3s are originally identified by the presence of a conserved 350-amino acid C-terminal HECT domain (for Homology to E6-
AP C-Terminus), which contains the binding site for the Ub-E2 complex;
(B) Ring/U-box E3s. Instead of using zinc chelation by cysteine or histidines, U-boxes presumably exploit other intramolecular
interactions to stabilize a finger-like motif. The Ring/U-box E3s do not directly participate in Ub ligation but serve as a docking
platform with the Ring finger interacting with Ub-E2 that allosterically activates the transfer of Ub to the substrate lysine(s);
(C) SCF E3s are complexes of four polypeptides that together have Ub-ligase activity, consisting of SKP1、CUL1、F-box protein
and RBX1(RING box 1);
(D) The most elaborate of the E3s is the anaphase promoting complex (or APC), which contains 11 or more subunits that together
form the core ligase activity.
381张一婧等: 基于S-核酸酶的自交不亲和性的分子机制
40等。也有大量的植物 F-box蛋白的C端并不含已知
的上述常规的结构域(Gagne et al., 2002; Smalle and
Vierstra, 2004)。
目前已对 20多种植物F-box蛋白的功能有了初步
研究。读者可参见最近一篇综述(Lechner et al., 2006),
本文不再赘述。
5.3 泛素化系统与内吞作用
作为“死亡标签”, 泛素化对于清除废物蛋白及调控细
胞通路转化具有重要意义。然而, 近年来不断有证据表
明, 泛素化也是蛋白在膜系统间运输的关键环节(图5)。
研究表明, 胞质和内质网中的蛋白水平主要通过前
面提到的泛素 -蛋白酶小体系统调节, 而大部分膜蛋白
(包括所有已知的酵母膜蛋白和大部分哺乳动物的膜蛋
白)的降解则是经泛素化修饰, 内吞(endocytosis)进入溶
酶体实现的。而且, 与泛素 -蛋白酶小体系统不同的是,
泛素化介导的内吞绝大多数采取单泛素化形式
(monoubiquitination), 而被蛋白酶小体降解的蛋白都是
多聚泛素化的(polyubiquitination)(Bonifacino and
Weissman, 1998; Bonifacine and Traub, 2003; Hicke
and Dunn, 2003; d’Azzo et.al., 2005)。
5.3.1 膜受体的内吞和信号转导
在泛素化介导的内吞蛋白中, 膜受体是研究最充分的一
图 5 泛素化调控的蛋白转运
(A) 质膜蛋白经过单泛素化(monoubiquitination)修饰后内化(internalizaition)进入初级内体(early endosomes);
(B) 被单泛素修饰的膜蛋白进入次级内体(late endosomes), 又称多囊体(multivesicular bodies, MVBs);
(C) 泛素化对包膜病毒(enveloped viruses)从宿主细胞中出芽(budding)释放具有重要作用;
(D) (多)泛素化调控蛋白从反式高尔基体(trans-Golgi network, TGN)进入溶酶体(酵母和动物)/液泡(植物);
(E) 泛素对执行内吞作用相关蛋白的修饰和调控。
Figure 5 Regulation of protein transport by ubiquitin signals (Hicke and Dunn, 2003)
(A) Monoubiquitin serves as a regulated internalization signal that can be appended to a plasma membrane protein to trigger entry
into primary endocytic vesicles budding from the plasma membrane.
(B) Monoubiquitin serves as a signal for the entry of transmembrane proteins into late endosomes/MVB vesicles.
(C) Ubiquitination is important for the budding of enveloped viruses.
(D) (Poly)ubiquitination regulates the sorting of proteins at the trans-Golgi network to the lysosome/vacuole.
(E) Ubiquitin modifies and regulates components of the endocytic machinery.
382 植物学通报 24(3) 2007
类。酵母和一些哺乳动物当中的 G 蛋白耦联受体(G
protein-coupled receptor, GPCR)受到信息素刺激后, 胞
质端迅速被泛素化, 内吞进入初级内体、次级内体, 最
终在液泡中被降解(Tanowitz and von Zastrow, 2002;
Wojcikiewicz, 2004)。酪氨酸受体激酶(receptor ty-
rosine kinases, RTKs)在结合配体后也会通过泛素化修
饰、内吞调控信号的传递(Dikic and Giordano, 2003;
Haglund et al., 2003; Marmor and Yarden, 2004)。
免疫系统相关的一些膜受体蛋白的泛素化对于调控
免疫系统具有重要作用(Booth et al., 2002; Naramura
et al., 2002; Goto et al., 2003)。树突状细胞(dendritic
cells, DC)是已知体内功能最强、唯一能活化初始T细
胞(naive T lymphocyte)的专职抗原提呈细胞。当受到
抗原刺激后, DC分化成熟, 细胞表面MHCII类分子表达
提高是其成熟的重要特征之一。研究表明, 正常情况下,
细胞表面的组织相容性复合体II(major histocompatibil-
ity class II, MHCII)被泛素化修饰后进入内膜系统, 当接
受刺激后, 其泛素化受到抑制, 使得MHCII类分子在细
胞表面积累(Shin et al.,2006)。有趣的是, 一些病毒为
了逃避宿主细胞的识别, 居然借用了这一方式来下调宿
主细胞中关键的免疫分子。在正常细胞中, MHCI类分
子稳定存在于质膜中, 病毒入侵后, 合成了相关的E3, 通
过泛素化修饰MHCI使之迅速被内吞并被溶酶体降解
(Coscoy et al., 2001; Hewitt et al., 2002)。
泛素化介导的膜受体内吞同样参与了大量神经系统
信号调节。比如秀丽隐杆线虫( C a e n o r h a b d i t i s
elegans)的谷氨酸受体, 哺乳动物神经元甘氨酸受体的内
吞都受到泛素化调控(Buttner et al., 2001; Burbea et al.,
2002)。果蝇神经系统的轴突导向作用是通过其膜受体
Robo蛋白结合轴突生长的导向信号实现的(Keleman et
al., 2002)。转化生长因子β(transforming growth fac-
tor-β, TGF-β)受体和Notch信号传递途径组件都存在
泛素化介导的内吞, 这进一步证实了该机制在发育调控中
的普遍性(Ebisawa et al., 2001; Jehn et al., 2002)。
5.3.2 通道蛋白的内吞和营养供给
通道蛋白构成了另一大类受泛素化介导的内吞调控的蛋
白。酵母的氨基酸通透酶(amino acid permeases)、
肽转运载体(peptide transporters)和糖转运载体(sugar
transporters), 以及一些哺乳动物的离子通道蛋白的降解
都是经过泛素化介导内吞实现的(Rotin et al., 2000;
Katzmann et al., 2002)。
5.3.3 细胞的粘附和极性生长
泛素化介导的内吞还参与了细胞的粘附和极性生长。
上皮组织粘连结合的重要因子E-cadherin在一定条件下
(比如有丝分裂期间)发生泛素化并被内吞, 从而实现了胞
间重构(Fujita et al., 2002)。泛素连接酶 Itch可以泛
素化细胞表面紧密连接蛋白Occludin, 介导其进入溶酶
体, 通过控制 Occludin蛋白量调控细胞的极性生长
(Traweger et al., 2002)。
纤维连接蛋白(fibronectin,FN)是一种细胞间的锚定
蛋白, 它可通过细胞之间粘性的部分形成丝状的纤维, 把
相邻细胞连接起来。纤维连接蛋白在细胞的粘附、移
动、生长、分化等方面发挥着重要的作用(Pankov and
Yamada, 2002)。表面FN的丢失是细胞发生癌变的一
个重要特征, 它可能是通过蛋白转录水平降低和蛋白降
解共同实现的(Kornblihtt et al.,1996)。Ray等(2006)
发现在诱变条件下(UV和X射线), FN会发生泛素化修
饰、内吞并最终在溶酶体中降解, 执行这一作用的泛素
连接酶是 SCF β -TrCP。
富含半胱胺酸的柱头 /花柱粘着素(stigma/stylar
cysteine-rich adhesin, SCA) 是一种花粉管粘着蛋白
质。Kim 等(2006)发现 SCA能够内吞经过MVB最终
进入花粉管液泡, 而结合胞外基质(extracellular matrix,
ECM)中游离的泛素能提高SCA的粘附能力和进入花粉
管的效率。
5.3.4 膜蛋白质量控制
众所周知, 泛素-蛋白酶系统对于控制胞质和内质网中蛋
白质质量具有关键作用。而泛素化介导的内吞很可
能是控制膜蛋白水平的重要手段, 突变和错误折叠的
膜蛋白会被运输到溶酶体中降解( R e g g i o r i a n d
Pelham, 2002)。
383张一婧等: 基于S-核酸酶的自交不亲和性的分子机制
5.4 泛素-蛋白酶小体途径与泛素-溶酶体途径:
多聚泛素化能否介导内吞？
首先, 我们需要明确几个基本概念: 单泛素化(monoubi-
quitination)、多泛素化(multiubiquitination)与多聚泛
素化(polyubiquitination)。
蛋白可以被一个泛素分子或多泛素链修饰, 分别称
作单泛素化和多聚泛素化。泛素分子通过至少3个Lys
位点, 即 Lys29、Lys48和 Lys63形成多泛素链。不
同类型的泛素化修饰介导靶蛋白进入不同的细胞途径,
由Lys48位相连形成的泛素链将介导底物蛋白, 包括内
质网膜蛋白、细胞核和细胞质蛋白通过 26S蛋白酶小
体降解; 而介导内吞的泛素化一般采取单泛素化的形式,
靶蛋白分子多个 Lys的单泛素化会产生多泛素化。可
见, 虽然都是由多个泛素分子修饰, 多泛素化与多聚泛素
化本质上是不同的(Hicke and Dunn, 2003; d’Azzo et
al., 2005)。但是, 由于两者通过简单的酶联免疫检测
难以区分, 导致人们对一些现象判断失误。比如之前发
现, 表皮生长因子受体(epidermal growth factor
receptor, EGFR)可以与泛素连接酶c-Cbl作用, 被多个
泛素分子修饰后进入溶酶体降解, 从而得出多聚泛素化
能够介导EGFR内吞的结论(Stang et al., 2000; Longva
et al., 2002)。但是, 更为精细的实验证明, 泛素分子
是以单体的形式与EGFR的多个Lys相连, 而不是以泛
素链的形式存在的(Haglund et al., 2003; Mosesson et
al., 2003)。
关于多聚泛素化能够介导内吞的报道主要来自酵母
的膜转运蛋白。研究较多的有氨基酸通透酶(am ino
acid permease)Gap1p(Springael et al.,1999, 2002;
Ingham et al., 2004)和尿嘧啶通透酶(uracil permease)
Doa4 (Galan and Haguenauer-Tsapis, 1997)。与进
入26S蛋白酶小体的蛋白不同, 修饰这些蛋白的泛素链
是通过 Lys63位相连的。最近, Duncan等(2006)通过
引入Lys-48R和Lys-63R点突变的泛素分子, 证明卡波
济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated
herpesvirus, KSHV) 编码的泛素连接酶K3能够依次结
合 2 个不同的泛素结合酶(E2 ) , 使宿主细胞表面的
MHC1类分子经过单泛素化修饰后, 紧接着被多聚泛素
化修饰, 最终内吞进入溶酶体。泛素链是通过泛素分子
Lys-63连接的, 而且, 多聚泛素化对于MHC1有效内吞
降解是不可或缺的。当然, 这种机制的普遍性还有待更
多实验证据。
6 核酸酶的命运
已有的证据表明, S-核酸酶进入异己的花粉管后会与
SLF结合并被泛素化(Qiao et al., 2004a; Hua and Kao,
2006)。泛素化的核酸酶将面临怎样的命运？其活性是
如何受到抑制的呢？
Qiao 等(2004a)发现蛋白酶小体抑制剂MG132能
够抑制体外萌发的亲和花粉管的生长, 而对自己花粉管
的生长没有影响, 暗示了蛋白酶小体在降解亲和授粉中
进入花粉管的 S-核酸酶发挥了作用。
最近, 一项在花烟草中进行的基于细胞生物学水平
的研究为我们回答这一问题又提供了新的视角。
Goldraij 等(2006)通过免疫荧光定位实验发现, S-核酸
酶从细胞外基质进入到花粉管后, 会被运输到花粉的液
泡中, 而被液泡所包裹的S-核酸酶就不能行使其细胞毒
素的作用。随着自交不亲和反应的进行, 在异交的花粉
管中, 这种类似液泡的内膜结构始终保持完整, 被“禁
锢”在里面的 S-核酸酶始终不能发挥其细胞毒性, 因
此异交花粉管就可以正常生长; 而在自交的花粉管中, 液
泡膜由于某种机制会被破坏, S-核酸酶因此被释放到细
胞质中, 其细胞毒性就得以发挥, 自交花粉管的生长就会
受到抑制。但是, 在自交的花粉管中, 液泡膜的解体会
不会是由于花粉管的生长被抑制后花粉管发生解体所造
成的呢？也就是说, 液泡的破裂究竟是花粉管生长被抑
制的原因还是结果, 这还有待更精细的研究。而且, 与
之相悖的是, Luu等(2000)通过免疫金标实验发现, 不管
在自己还是异己的花粉管中, S-核酸酶都集中在细胞质
内, 液泡中几乎没有 S-核酸酶的存在。当然, S-核酸
酶进入花粉管后的分布应该是一个动态的过程, 这还需
要更加细致的观察和实验。
不论怎样, 以上这些结果都是非常有趣的——S-核
酸酶被抑制到底是由于被降解, 还是由于被限制, 还是二
384 植物学通报 24(3) 2007
者兼而有之? 这引发了人们对核酸酶命运新一轮的思考
和研究。
值得一提的是, 作为花粉 SI 的特异性决定因子,
SLF/SFB在核酸酶通过内膜系统运输的过程中参与了
哪些途径, 对于异己核酸酶降解发挥了怎样的作用？我
们还知之甚少。本实验室的一些工作可能为解决这些
问题提供了线索: Qiao等(2004a)通过酶联免疫检测, 发
现进入异己花粉管的核酸酶会与SLF结合并被多个泛素
分子修饰; Wang和Xue(2005)通过免疫电镜实验, 发现
AhSLF-S2在体外萌发花粉管中的定位与膜系统相关
联。核酸酶的泛素化与其在内膜系统运输的关系及
SLF在其中的作用是本领域近期的一个研究重点。
随着人们对自交不亲和反应分子机制这一课题更深入
的研究, 相信它会以越来越清晰的面貌展现在我们面前。
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388 植物学通报 24(3) 2007
(责任编辑: 白羽红)
Molecular Control of S-RNase-based Self-incompatibility
Yijing Zhang, Yongbiao Xue*
Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China
Abstract To avoid inbreeding and promote out-crossing, many flowering plants have adopted self-incompatibility (SI) systems,
through which incompatible (self or genetically related) pollen is recognized and rejected, whereas compatible (non-self) pollen is
allowed to grow in the style to deliver the germ cells to the ovary for double fertilization. Among various SI systems, gametophytic
SI in Solanaceae, Scrophulariaceae and Rosaceae appears to be the most common whereby the specificity of SI response is
controlled by a single polymorphic S-locus. Recent studies have shown that the S-locus is organized in a haplotype fashion and
carries at least two genes determining the recognition specificity: S-ribonucleases expressed in the pistil (pistil-S) and S-locus F-
box (SLF) genes in the pollen (pollen-S). Here we discuss recent data on the possible molecular mechanisms eliciting the S-RNase-
based self-incompatibility response.
Key words endocytosis, F-box, self-incompatibility, ubiquitin
Zhang YJ, Xue YB (2007). Molecular control of S-RNase-based self-incompatibility. Chin Bull Bot 24, 372-388.
* Author for correspondence. E-mail: ybxue@genetics.ac.cn
《应用生物技术大系》征稿启事
为介绍和推广应用生物技术领域的新成果、新思路、新方法和新技术，带动应用生物技术研究的快速发展，科学出
版社自 2007 年起将正式启动《应用生物技术大系》丛书的出版。
本丛书以医药生物技术、工业生物技术、农业生物技术、环境生物技术、海洋生物技术、生物资源与安全等领域
作为主要出版方向，读者对象定位于生物技术与生物工程相关专业的科研工作者、高等院校师生、技术人员以及企业研
发人员等。为确保丛书的质量水准，我们已组织国内相关研究领域的知名专家组成了专家指导委员会，参与图书项目的
论证。
《应用生物技术大系》目前已被列为“十一五”国家重点图书出版规划。为了让更多优秀的专家学者参与本套丛书
的编写，现向社会公开征集书稿，热忱欢迎从事工业、医药以及农业生物技术研究的专家学者踊跃投稿。
稿件内容要求围绕应用生物技术的某一个研究方向展开，体现国内外最新的研究进展，并具有一定的前瞻性或实用
性。可以是编著，也可以是译著。读者定位要明确，字数在 1 0 0 万字以内。
我们真诚期待您的关注和参与！
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