全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (4): 449-454, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-11-09; 接受日期: 2008-03-18
基金项目: 国家 948项目(No.2004-4-60)
* 通讯作者。E-mail: yangkai8978@126.com
.实验简报.
AFLP引物组合数量对准确研究竹子系统关系的影响
李潞滨 1 , 郭晓军 2 , 彭镇华1 , 刘贯水 1 , 袁洪水2, 朱宝成 2 , 杨凯 3 *
1中国林业科学研究院林业研究所, 北京 100091; 2河北农业大学生命科学学院, 保定 071001
3北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室, 北京 102206
摘要 利用AFLP技术对26个竹子种类进行了多样性分析, 以探索引物组合数量对准确研究竹子类群系统关系的影响。实验
共随机选取10对AFLP引物, 并对所得10组AFLP标记数据随机组合后进行Nei氏遗传距离/UPGMA聚类分析。每对AFLP引物
扩增数据为一组, 随着用于聚类统计的AFLP标记数据随机组合数量的增加, 26个竹子种类的聚类关系趋向一致。这提示我们,
在系统学研究中, 足够数量的引物组合是获得供试材料间准确聚类关系的基础, 应采用对各AFLP引物组合数据随机累加后进
行聚类分析的方法, 以聚类关系为标准来确定用于分析供试品种的最少引物组合数量。
关键词 AFLP, 竹子, 亲缘关系, 引物组合
李潞滨 , 郭晓军 , 彭镇华, 刘贯水 , 袁洪水 , 朱宝成, 杨凯 (2008). A FLP引物组合数量对准确研究竹子系统关系的影响. 植物学通报
25, 449-454.
竹子系禾本科(Gramineae)多年生植物。我国是世
界上最主要的产竹国, 无论是竹子的种类、面积、蓄
积量, 还是竹材、竹笋的产量都位居世界首位。我国
竹子种类共有 39属 500余种, 竹林总面积约 4.20×106
hm2。竹类很少开花, 更少结果, 而花是竹亚科分属及
属以下分类等级的主要依据。竹类植物很少开花的特
性使得传统上依据生殖器官对禾本科植物进行分类的方
法在竹亚科中有时难以实现, 而且依据外部形态分类易
受环境因素及个体发育情况的影响, 其准确和可靠性都
会受到不同程度的限制, 特别是在对形态上相似的竹种
进行鉴定时更显不足。所以竹子的分类一直是分类学
研究中的一大难题(赵奇僧和汤庚国, 1993)。
近年来分子标记技术的快速发展为研究系统进化提
供了新的手段, 尤其是AFLP (amplified fragment length
polymorphism) 分子标记技术在 DNA 水平检测多态性
位点上, 具有稳定性高、重复性好和多态性高等特点,
而且不受外界环境因素的影响, 已被广泛应用于多种植
物的研究(Zhu et al., 1999; 祝军等, 2000; 易干军等,
2003b)。在利用 AFLP 技术进行植物种间和品种间的
系统学分析时, 文献报道选用的引物组合数量各不相
同。本研究利用 AFLP 技术对 26种竹子进行了亲缘关
系分析, 以聚类关系为标准探索了引物组合的数量对准
确研究竹子系统关系的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料采自中国林业科学院北京良乡竹藤资源圃, 共
26种, 其中刚竹属(Phyllos tachys Sieb. et Zucc.)竹种
23种, 苦竹属(Pleiob las tus Nakai)竹种 2种, 唐竹属
(Sinobambusa Makino ex Nakai)竹种 1种(表 1)。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
采用改进的 SDS 法(Dellaporta et al., 1983)从竹子叶
片提取DNA; 用 Beckman紫外可见分光光度计(萨姆
布鲁克和拉塞尔, 2002)测定DNA样品浓度; 再用0.8%
的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量, 检测后样品置于
450 植物学通报 25(4) 2008
4°C 冰箱备用。
1.2.2 AFLP分析
AFLP 分析参照Vos 等(1995)的方法。使用 EcoRI和
MseI 2种限制性内切酶, 37°C酶切 3小时, 16°C连接
1.5-3 小时; AFLP预扩增采用 E00/M00引物组合, 将
预扩增产物稀释 20倍作为选择性扩增 DNA模板; 选择
性扩增采用(E+3)/ (M+3)引物组合, 其中 E 和M 分别表
示 EcoRI和MseI引物的共同序列, E 的共同序列为 5-
G ACTG CG TACCA ATTC-3 , M 的共同序列为 5 -
GATGAGTCCTGAGTAA-3。引物序列和组合见表 2。
1.2.3 数据处理
利用生物学统计软件NTSYS-pc 2.10e对数据进行分析
处理。以 0和 1的方式记录电泳图谱中条带位置, 有条
带的赋值 1, 无条带的赋值 0。数据录入NTedit 1.2后
获得每对引物AFLP标记数据, AFLP标记数据按引物对
顺序依次累加, 分别得到 1对至10对引物的AFLP标记
的数据文件。以 neighbor-joining (NJ) 距离为基础, 采
用 UP GM A 软件对数据进行聚类分析。
多态性比率 =(多态性 AFLP条带数 /总 AFLP条带
数)×100%。
2 结果与分析
2.1 AFLP扩增结果
随机选取 10对 AFLP 引物组合对试材进行分析(表 2)。
10对引物组合共扩增出 733个条带, 其中多态性条带
641条, 多态率为 87.45%(图 1)。多态率最高的引物组
合为M -G CG /E -CTA , 多态率最低的引物组合为M -
CAC/E -AGG。
2.2 聚类分析
利用 NTSYS-pc 2.10e软件, 将每对引物组合得到的
AFLP数据随机组合得到的 AFLP标记数据文件进行聚
类分析, 以 neighbor-joining (NJ)距离为基础, 采用
UPG MA 软件对数据进行聚类分析。
按实验进程, 当供试材料用 8对 AFLP 引物组合进
行分析时, 将其中 7对引物组合数据进行随机组合聚类
表 1 实验材料
Table 1 The bamboo species tested in the exper iment
No. Sc ientif ic name
1 Phyll ostachys platygl ossa Z . P. Wang et Z. H. Yu
2 Ph. f imbr ili gul a Wen
3 Ph. parvifoli a C. D. Chu et H. Y. Chou
4 Ph. gl auca McClure
5 Ph. nuda McClure f. localis C.P. Wang et Z .H.Yu
6 Ph. heteroc lada Oliver
7 Ph. sulphurea (Carr .) A. et C. Riv. cv. Viridis R. A. Young
8 Ph. i ncarnata Wen
9 Ph. pubescens Mazel ex H. de leh. cv. Taokiang W. C. Lin
10 Ph. b amb usoides Siebold et Zucc.
11 Pl eioblastus macul osoides Wen
12 Ph. aureosul cata McClure f. pekinensis J. L. Lu
13 Pl . amarus (Keng) Keng f.
14 Ph. i ridescins C.Y.Yao et S.Y. Chen
15 Ph. vivax McClure f. huanwenzhu J. L. Lu
16 Ph. propi nqua McClure
17 Ph. arcane McClure
18 Ph. angusta McClure
19 Ph. promi nens W. Y . Xiong
20 Ph. vir idi s (Young) McClure cv. houzeau McClure
21 Ph. heteroc lada Oliver
22 Si nob amb usa tootsi k (Sieb.) Makino
23 Ph. heterocycl a (Car r.) Mitford cv. heterocyc la
24 Ph. concava Z . H.Yu et C. P. Wang
25 Ph. gl auca McClure
26 Ph. dulci s McClure
表 2 10对AFLP引物选择性扩增结果
Table 2 The results of amplif ication us ing the selec ted 10
pairs of pr imers
No. Pr imer Polymorphic Total numbers Polymor-
combinations bands of AFLP phism (%)
bands
1 M-AGC/E-CAC 56 62 90.32
2 M-CAA/E-A GA 56 66 84.85
3 M-CAC/E-A GG 63 82 76.83
4 M-CTA/E-CAT 100 103 90.09
5 M-CTT/E-CTT 57 67 85.07
6 M-GCG/E-CTA 100 105 95.23
7 M-AGA/E-CAG 39 47 82.98
8 M-GCT/E-CTC 66 80 82.50
9 M-CTA/E-GCG 50 58 86.20
10 M-GCA/E-GCC 53 63 84.13
Total 641 733 87.45
451李潞滨等: AFLP引物组合数量对准确研究竹子系统关系的影响
图1 扩增产物
在5%聚丙烯酰
胺凝胶电泳后
银染结果
引物组合: M-
CTA/E-CAT; 1-
26 : 竹种编号
(见表 1 ) ; M:
DNA分子标记
Figure 1 The
s ilver s tained
results of se-
lective amplif i-
cation reaction
in 5% denatur-
ing polyacryla-
mide gel
Th e p r i me r
combinations :
M-CTA /E-CA T;
1-2 6: Cod e
f or ba mbo o
materials (see
Ta ble 1) ; M:
DNA markers
分析, 共得到 8种聚类结果均不同于 8对引物组合聚类
分析结果, 分别有 5-6个品种出现差异; 当供试材料用
9对引物组合进行AFLP分析时, 将其中8对引物组合数
据进行随机组合聚类分析, 共得到9个聚类结果, 其中5
种聚类结果与 9对引物组合聚类结果相同, 有 2-5个品
种出现差异; 当供试材料用10对引物组合进行AFLP分
析时, 将其中9对引物组合数据进行随机组合聚类分析,
共得到 10个聚类结果, 其中 9种聚类结果与 10对引物
组合聚类结果相同, 有 2个品种出现差异。限于篇幅本
文仅列出最后统计结果(图 2A-J, 图 3)。
3 讨论
在利用AFLP技术进行植物多样性和系统进化的研究中,
研究者依各自研究目的不同采用的引物组合数量是不一
样的(表 3)。如果仅从区分品种的角度, 由于 AFLP 技
术的高效性, 研究者仅用少数几对引物就可达到研究目
的。Cervera等(1998)对来自西班牙的 67个葡萄品种
进行了 AFLP 分析, 仅用 2对引物就发现基因型相同的
品种可能有不同的品种名, 而相同品种名可能有不同的
基因型, 从而很好地解决了同名异物和同物异名的问
题。Tignon等(2000)应用 AFLP技术鉴别苹果品种, 采
用 1对AFLP引物组合产生了52个多态性标记, 能够鉴
别 28 个待测苹果品种。本研究也得出相似的结果, 依
据AFLP指纹图谱仅用1对引物组合就能区分出全部26
个竹种的差异。
在植物系统进化研究中, 由于 AFLP 引物 5端核心
部分与接头互补, 而引物 3端加 1-3个选择性碱基, 在
进行AFLP-PCR扩增的时候, 上下游引物对模板序列都
有一定的选择, 所以 AFLP 是一种半随机的PCR扩增。
尽管 AFLP 技术检测的位点数较多, 但是这种选择性导
致在进行系统学研究过程中, 对基因组DNA酶切片段的
452 植物学通报 25(4) 2008
图 2
Figure 2
A B
D
E
C
F
HG
Coef f icient Coef f icient
453李潞滨等: AFLP引物组合数量对准确研究竹子系统关系的影响
图 2 10对引物AFLP分析时 9对引物组合数据随机组合的聚类分析结果 (1-26: 竹种编号(见表 1) )
Figur e 2 The system cluster dendrogram of 9 combinated pairs of A FLP primers w hich gathered randomly from 10 pairs of A FLP
data (1-26: Code for bamboo materials (see Table 1))
一部分进行了选择性分析, 即对基因组的检测是半随机
的选择性扫描。尽管这对遗传背景比较接近的品种影
响很小, 但在研究遗传背景差异较大的品种时, 可导致很
大的偏差, 所以仅用少数几对引物的数据进行分析必将
导致分析结果出现偏差。在本研究利用 AF LP 技术探
讨竹类植物系统关系的过程中, 确定遗传背景十分接近
的品种间的亲缘关系需要的引物组合数量很少, 仅用1
对引物就可确定黄纹竹和早园竹间的亲缘关系, 即使将
检测的引物组合数量增加到10对, NJ距离也仅有0.05
的差异; 而其它品种的亲缘关系要达到一定的引物对数
量时才能确定下来。从本研究的结果看, 随着随机选
取的AFLP引物组合数量的增加, 供试竹种的聚类关系
逐渐趋于一致。
在以系统学关系分析为目的的研究中, 应采用尽可
能多的不同引物组合分析供试竹种(样品), 尤其是对竹类
这种基因组较大的植物, 更应该采用尽可能多的引物组
合进行分析。但在实验设计过程中, 很难确定应该使
用多少个引物组合才能准确确定样品间的亲缘关系 ,
同时增加过多的引物组合将会使实验费用增加。因
此在实验过程中应将不同AFLP引物组合扩增的标记
数据随机累加分析, 当达到增加引物组合数而样品间
聚类关系不变时, 进一步增加引物组合数量将对聚类
关系影响很小。因此建议采用这种方法来研究物种间
的亲缘关系。
图 3 10对引物系统聚类图(1-26: 竹种编号(见表 1) )
Figur e 3 The system clus ter dendrogram of 10 pairs of A FLP
pr imers data (1-26: Code for bamboo materials (see Table 1))
表 3 不同植物种间和品种间系统学分析所采用的引物组合数量
Table 3 The quantity of pr imer combinations w hich are
adopted in the genealogy analysis of dif ferent plant varieties
or species
Plants Quantity of primer Reference
combination (pairs)
Li tchi chi nensis Sonn. 3 易干军等, 2003a
Gi nkgo bi lob L. 8 Wang et al., 2006
Cymbi dium hooker ianum 9 朱根发等, 2007
Rchb. f.
Fragaia ananassa Duch. 10 张运涛等, 2006
Pi nel lia Tenore 13 成玉等, 2006
Wild Chinese orchids in 16 张俊祥等, 2006
Yunnan province
I J
Coef f icient Coef f icient
454 植物学通报 25(4) 2008
Effect of the Quantity of AFLP Primer Combinations on Accurately
Identifying Bamboo Genetic Relationships
Lubin Li1, Xiaojun Guo2, Zhenhua Peng1, Guanshui Liu1, Hongshui Yuan2, Baocheng Zhu2, Kai Yang3*
1Re sea rch Institute of Forest ry, Ch inese Acad emy of Forest ry, Bei jin g 1 000 91, Chi na; 2Co lle ge o f L ife Sci ences, Ag ricu ltu re
Un ive rsi ty o f Hebe i, Bao din g 0 7100 1, Chi na; 3Be iji ng Key Lab ora tory of Ne w Techn olo gy in Agri cul ture Ap pli cat ion , Be iji ng
Un ive rsi ty of Agri cul ture, Bei jin g 10 220 6, Chi na
Abstract To inves tigate the eff ec t of the quantity of primer combinations on identif ying genetic relationships among bamboo
spec ies accurately , w e analyzed the divers ity of 26 bamboo species w ith amplif ied f ragment length polymorphism(AFLP) . We
selec ted 10 pairs of AFLP primer, and the 10 primer combinations of AFLP markers w ere analyzed by Nei’s genetic distance/unw
eighted pair group method analysis (UPGMA) . Each pair of primers resulted in a group designation, and the relations among the 26
spec ies w ere conf irmed consistently w ith an increased number of random combinations of AFLP markers used as a clustering
statis tic . For study of phy logenetics, a suff icient quantity of primer combinations can reveal exac t c lustering relations. The method
of accumulating random combinations of AFLP primers and clustering analysis w as applied, and the least number of combinations
for testing breeding w as confirmed by c lus ter ing relations.
Ke y w ords AFLP, bam boo , g ene tic rel ati onship s, p rim er com bina tio ns
Li LB, Guo XJ , Peng ZH, Liu GS, Yuan HS, Zhu BC, Yang K (2008 ). E ffect of th e qu anti ty o f AFLP prim er combi nat ions on accu rate ly
id ent ifyi ng bam boo gen eti c rela tio nshi ps. Ch in Bull Bo t 25 , 44 9-45 4.
* Author for correspondence. E-mail: yangkai8978@126.com
(责任编辑: 孙冬花)
参考文献
成玉 , 陈成彬 , 薛梅 , 陈力 (2006). 应用AFLP技术探讨半夏属五
个种的亲缘关系. 云南植物研究 28, 559-564.
易干军 , 霍合强 , 陈大成 , 黄自然 , 蔡长河 , 邱燕萍 (2003a). 荔枝
品种亲缘关系的AFLP分析. 园艺学报 30, 399-403.
易干军 , 谭卫萍 , 霍合强 , 张秋明 , 李建光 (2003b). 龙眼品种(系)
遗传多样性及亲缘关系的 A FL P分析. 园艺学报 30 , 2 72-
276.
张俊祥 , 李枝林 , 范成明 , 程少丽 , 赵明富 , 何月秋 (2006). 云南
野生兰属主要种间亲缘关系的AFLP分析. 园艺学报 33, 1141-
1144.
张运涛 , 冯志广 , 李天忠 , 董静 , 王桂霞 , 张开春 , 韩振海 (2006).
草莓品种亲缘关系的AFLP分子标记分析. 园艺学报 33, 1199-
1202.
赵奇僧 , 汤庚国 (1993) . 中国竹子分类的现状和问题. 南京林业大
学学报(自然科学版) 17(4), 1-8.
朱根发 , 李冬梅 , 郭振飞 (2007). 大花蕙兰遗传多样性及亲缘关系
的AFLP分析. 园艺学报 34, 417-424.
祝军 , 王涛 , 李光晨 , 赵玉军 , 张文 , 周爱琴 (2000). 苹果AFLP分
析体系的建立. 中国农业大学学报 5(3), 63-67.
萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 DW (黄培堂等译) (2002). 分子克隆实验
指南(第 3版). 北京: 科学出版社. pp. 385-396.
Ce rve r a M T, Cabe zas JA, Sancha JC, M ar tkne z TF,
Mar tkne z-Zapate r JM (1998) . Application of A FLP to the
characterization of grape Viti s vinifera L. genetic resources.
A case study w ith accessions from Rioja (Spain). Theor Appl
Genet 97, 51-59.
De llapor ta SL, Wood J, Hick s JB (1983) . A plant DNA mini
preparation vers ion. Plant Mol Biol Rep 1, 19-21.
Tignon M, Kettmann R, Wat illon B (2000) . AFLP use f or the
identif ication of apple cultivars and mutants. Acta Hortic 521,
219-226.
Vos P, Hoge rs R, Ble eke r M, Reijans M, van de Le e T,
Hornes M, Frijters A, Pot J, Paleman J, Kuiper M, Zabeau
M (1995). A FLP: a new technique for DNA f ingerprinting.
Nucleic Acids Res 23, 4407-4414.
Wang L, Xing SY, Yang KQ, Wang ZH, Guo YY, Shu HR (2006).
Genetic relationships of ornamental cultivars of Ginkgo biloba
analyzed by AFLP techniques. J Genet Genomics 33, 1020-
1026.
Zhu SL, Mont i LM , Avitabile A, Rao R (1999). Evaluation of
genetic diversity in chinese soybean germplasm by AFLP.
Noticiario De Recursos Fitogeneticos (ITALIA) 119, 10-14.