全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (3): 273-282, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.03.003
收稿日期: 2008-10-20; 接受日期: 2009-02-09
基金项目: 863计划(No.2006aa10z166)、国家自然科学基金(No.307712888和No.40671096)和国家创新研究群体科学基金(No.
30821003)
* 通讯作者。E-mail: LL1025@cau.edu.cn
.特邀综述.
高等植物尿素代谢及转运的分子机理
曹凤秋, 刘国伟, 王伟红, 吴学民, 刘来华*
中国农业大学资源与环境学院, 北京 100193
摘要 尿素广泛存在于自然界中, 是易于被许多生物(如植物)利用的生长氮源。该文通过概述尿素在不同生命系统中存在的
基础生理意义及各类型尿素转运蛋白, 讨论了植物细胞中尿素合成与分解的各种途径及尿素在植物氮营养、代谢和运输中的
生理作用。迄今为止, 在植物中已发现了2类转运尿素的膜蛋白, 即MIPs和DUR3, 它们分别在低亲和力、高亲和力尿素运输
中发挥潜在作用。异源表达结果表明MIPs介导了尿素的被动迁移; 而AtDUR3则参与拟南芥根系对尿素的吸收。对MIPs和
DUR3转运尿素的酶学特征、亚细胞作用位点和表达调控状况等的研究表明: 它们的分子生物学功能与植物的氮营养及氮素
再分配和利用相关。
关键词 水孔蛋白, DUR3蛋白, 氮素, 脲酶, 尿素转运
曹凤秋, 刘国伟, 王伟红, 吴学民, 刘来华 (2009). 高等植物尿素代谢及转运的分子机理. 植物学报 44, 273-282.
尿素分子是许多生物体内氮代谢过程中重要的中间
产物, 广泛存在于自然环境中。其主要来源包括动、
植物残体的分解, 动物的排泄物以及现代农林业中尿素
氮肥的使用。据报道, 在自然界中, 有些水体(如湖泊、
河流)的尿素浓度达到0.1-3 mmol.L-1; 农用土壤中的
尿素浓度接近70 mmol.L-1 (Valladares et al., 2002;
Liu et al., 2003a)。施于土壤中的尿素, 因其半衰期为
1-8天(Liu et al., 2003a), 所以, 短期土壤中会有较高
浓度(如毫摩尔级)的尿素存在。
尿素对各种生物具有明显不同的生理学意义。脲
酶(urease)(或称尿素水解酶)是化学界首次通过结晶分离
得到的且晶体结构已被人们所认识的生物有机大分子。
它普遍存在于生物细胞(质)中, 此酶的催化活性需要金属
镍离子的参与; 在某些生物(如植物)的氮代谢循环中, 进
入胞质中的内、外源尿素分子经脲酶的作用被水解为
二氧化碳(CO2)和氨(NH3), NH3作为可直接利用的氮源
参与氮的再同化代谢。因此, 许多生物包括细菌、真
菌以及多细胞生物(如植物)的生长, 都能利用尿素作为唯
一的氮源(Valladares et al., 2002)。在动物的某些器
官(如肝脏)中, 尿素作为一种主要的含氮代谢废弃产物,
产生于线粒体尿素循环中的精氨酸脱氨反应, 最后经肾
脏排出体外, 以消除过剩氨基酸的富营养( S ands ,
2004)。 此外, 尿素在动物某些组织(如血细胞)中的形成
及运输对维持细胞和组织中的水分平衡具有重要的渗透
势调节作用(Sands, 2004)。某些常易引起人和动物疾
病的病原微生物(如幽门螺杆菌), 可以通过利用对外源尿
素的吸收和尿素在胞质中的水解, 进而提高细胞质中氨
离子的浓度来缓冲周围环境中的低pH值, 以增强其自
身在酸性环境(如胃)中生长和繁殖的能力(Weeks et al.,
2000)。
各种生命系统在利用尿素的生理功能过程中, 必然
涉及尿素分子在不同水平上的转运, 包括对外界尿素进
行跨细胞质膜的吸收、尿素在细胞中某些细胞器之间
的转运以及在细胞间和组织间的运输等。因此, 必然存
在一些专一性和非专一性的尿素转运蛋白。从单细胞
细菌到多细胞的哺乳动物中, 现已发现并克隆了多种不
同类型的转运尿素的膜蛋白, 其中一类为通道型膜蛋白,
如哺乳动物的UT (urea transporter)-A, -B, -C 型尿素
274 植物学报 44(3) 2009
转运蛋白、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的UreI、
耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的Yut以及
动植物中的某些水通道(water channel或aquaporin
(AQP)或major intr insic protein (MIP))。该类膜蛋
白以低亲和力控制尿素由高浓度向低浓度的跨膜运输,
其转运尿素的速率与底物浓度呈线性正相关。蛋白免
疫学定位鉴定或荧光蛋白标记定位法研究表明, 这类尿
素通道常常定位于细胞质膜及液泡膜上(如植物转运尿
素的水通道)( Weeks et al., 2000; Sebbane et al.,
2002; Liu et al. , 2003b; Sands, 2004)。另一类尿
素转运蛋白则为消耗生物能量且逆浓度梯度转运尿素
的膜蛋白, 如谷氨酸棒杆菌(corynebcterium glutam-
icum, Cg)的 urtABCDE操纵子系统。该操纵子编码
一种ABC (ATP-binding cassette)-型(即ABC-type
transporter)的尿素通透酶体系, 其中urtA亚基负责与
尿素结合, urtB和C分别编码尿素通透酶的2种亚基,
urtD和E分别编码2个ATP结合蛋白(Valladares et
al. , 2002)。该类尿素转运蛋白中还有一种为钠-溶质
共运蛋白家族(sodium-solute symporter family ,
SSS family)中的DUR3同源蛋白(Liu et al., 2003a;
More l et a l., 2008)。这种尿素转运蛋白具有在质膜
上的表达特征, 常以高亲和力促使尿素的跨膜运输, 而
且 DUR3 的表达通常受到生物缺氮环境 / 状况的诱
导。表1中归纳了目前在植物和某些微生物中已经发
现的可能的尿素转运蛋白。其中所列的水通道蛋白
(PIP-和TIP-型, 即plasma membrane intrinsic pro-
tein和tonoplast intrinsic protein)对尿素的运输功能
研究多基于对它们在异源表达系统(爪蟾(Xenopus
oocy te)卵母细胞和酵母菌(Saccharomyce cerevi-
siae))中的功能鉴定, 在植物中其运输尿素的生理学意
义有待进一步研究。目前, 在植物的基因组中尚未发
现 UreI、Yut和UT-型(未列入表中)尿素转运蛋白的
同源体。在已完成基因组测序的植物 ( 如拟南芥
(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)和玉米
(Zea mays)等)中, 虽然预测存在包含上百个成员的
ABC-型转运蛋白基因家族, 但这类蛋白是否转运尿素
还有待探讨。
1 植物的尿素-氮营养生理
1.1 尿素代谢
植物细胞中的尿素产生于含氮有机物的异化反应过程,
形成途径主要有2种, 即精氨酸的分解途径和酰脲、嘌
呤的降解途径(图1)。前一途径与动物中的尿素循环类
似, 在线粒体中进行, 精氨酸酶(arginase)催化精氨酸形
成鸟氨酸和尿素。在种子萌发和植物衰老过程中精氨
酸含量增加。多数被子植物的成熟种子中, 精氨酸含量
占总氮量的40%(Goldraij and Polacco, 2000)。有研
究发现, 在大豆(Glycine max)种子萌发时, 精氨酸酶被
诱导表达, 种子贮藏蛋白中的精氨酸发生净分解, 在缺乏
脲酶活性的大豆突变体中则有尿素积累(Goldraij and
Polacco, 2000), 表明精氨酸酶和脲酶协同作用对种子
萌发时的氮素利用和再分配具有重要的生理意义。在
精氨酸酶的作用下, 萌发种子贮藏蛋白中的精氨酸分解
成尿素, 进而经脲酶的作用产生可直接被同化利用的氨
态氮源, 供给幼苗的生长发育。反之, 在发育的种子胚
胎中, 精氨酸则作为氮源被贮存(Goldraij and Polacco,
1999, 2000)。关于精氨酸分解与贮存过程的调节, 人
们推测可能是通过改变相关的酶和底物在胞内不同细胞
器中的存在位点来实现。例如在种子萌发过程中, 胞质
中形成的精氨酸需被运输进入线粒体后才可分解生成尿
素, 而线粒体中的尿素则必须外流入胞质中方可被水解
形成可利用的氨(图1)。 此代谢过程提示人们有必要探
究代谢产物在各个细胞器间转运的分子机制。
此外, 精氨酸异化过程亦与多胺代谢相关, 其中尿素
是多胺生物合成过程中的副产物(图1)。刀豆氨酸是豆
科植物含有的非蛋白质氨基酸, 此次生代谢物的化学结
构与精氨酸相似。刀豆氨酸主要在种子中积累, 它既可
作为一种生物防御性物质抵御某些虫害, 也可作为氮源
供给胚胎发育。刀豆氨酸的分解产物为刀豆酸和尿素
(图 1)。
据推测, 在丛枝菌根共生(arbuscular mycorrhizal
(AM) symbiosis)系统中, 真菌的尿素循环途径与脲酶的
协同作用可能开启了氮素从真菌向植物体的转运(Bago
et al., 2001)。根据该模式, 精氨酸在精氨酸酶的作用
275曹凤秋等: 高等植物尿素代谢及转运的分子机理
下, 在内菌丝体真菌中产生尿素, 继而经脲酶反应生成铵
离子, 然后转移到寄主植物中。就真菌而言, 此过程可
能会较大程度地减少碳的损失, 因为经观察发现, 精氨酸
是AM真菌外部菌丝所含游离氨基酸的主要成分, 而且
真菌中的碳也未被发现从菌根转移到茎部。上述假说
虽然还需要进一步的实验证实, 但值得注意的是: 它可能
是生物转运尿素的另一种机制, 尿素跨越真菌膜和植物
膜的运输可能有利于提高尿素氮的利用效率。
植物产生尿素的第2条主要途径是酰脲(主要有尿囊
素和尿囊酸)代谢(图1)。酰脲由嘌呤分解产生, 它是一
些结瘤植物氮素的主要运输形态。酰脲主要积累在豆
科和非豆科植物幼苗及高氮碳平衡生长条件下的衰老子
叶中(Goldraij and Polacco, 2000)。在缺水条件下, 叶
中酰脲的积累和代谢与固氮的反馈抑制机制有关(Todd
et al., 2006)。关于NH3和CO2是由尿囊酸直接分解
产生还是通过尿素的中间环节形成, 目前尚不清楚。倘
若尿囊酸脒基水解酶作用于尿囊酸, 则可产生一分子尿
素; 若尿囊酸酰胺水解酶分解尿囊酸, 则形成脲基乙醇
酸、CO2和NH3。脲基乙醇酸既可在脲基乙醇酸尿素
裂解酶的作用下产生乙醛酸和尿素, 也可经脲基乙醇酸
表 1 植物和微生物中已发现的转运尿素的膜蛋白
Table 1 Overview of urea-transporting proteins in plants and micro-organisms
转运蛋白名称 生物种类 位点 a 转运蛋白特征 跨膜域数目b 蛋白大小 c 基因登录号码 文献来源
高等植物中
AtTIP1.1 拟南芥 液泡膜 通道型 6 251 At2g36830 Liu et al., 2003b
AtTIP1.2 拟南芥 液泡膜 通道型 6 253 At3g26520 Liu et al., 2003b
AtTIP2.1 拟南芥 液泡膜 通道型 7 250 At3g16240 Liu et al., 2003b
AtTIP4.1 拟南芥 液泡膜 通道型 7 249 At2g25810 Liu et al., 2003b
NtAQP1 烟草 细胞质膜 通道型 6 287 AJ001416 Siefritz et al., 2001
NtTIPa 烟草 液泡膜 通道型 6 247 AJ237751 Gerbeau et al., 1999
ZmPIP1-5b 玉米 - 通道型 6 288 AJ271796 Gaspar et al., 2003
CpNIP1 西葫芦 - 通道型 - - - Klebl et al., 2003
AtDUR3 拟南芥 细胞质膜 主动式, Km: 14 694 AV524336 Liu et al., 2003a
3 mmol.L-1
OsDUR3 水稻 - - 15 721 AY463691 NCBI GenBank
ZmDUR3 玉米 - - 15 732 暂未发表 本文作者实验室
藻类植物中
PyUT1 条斑紫菜 - 类似DUR3 15 740 AB359179 Kakinuma et al., 2008
PyUT2 条斑紫菜 - 类似DUR3 16 680 AB359180 Kakinuma et al., 2008
真菌中
ScDUR3 酿酒酵母菌 细胞质膜 主动式, Km: 15 735 L19875 Liu et al., 2003a
14 mmol.L-1
PiDUR3 根卷伞菌 - 主动式, Km: 15 712 未登录 Morel et al., 2008
32 mmol.L-1
微生物中 d
urtABCDE 谷氨酸棒杆菌 细胞质膜 ABC-型, 19 1 729 AJ271599 Valladares et al., 2002
Ks: 0.11 mmol.L-1
FmdDEF 甲基营养嗜 细胞质膜 ABC-型 12 949 Y14964 Mills et al., 1998
甲基菌
HpUreI 幽门螺旋杆菌 细胞质膜 通道型 6 195 AJ239719 Weeks et al., 2000
Yut 假结核耶尔森菌 细胞质膜 通道型 10 330 AF412328 Sebbane et al., 2002
a: 组织或亚细胞水平上的表达位点; b: 使用CBS Prediction Servers预测跨膜a-螺旋区域; c: 蛋白质肽链含氨基酸残基数目; d: 限于篇
幅仅列出微生物中具代表性的尿素转运蛋白同源体
a: Tissue expression or subcellular localization; b: Transmembrane a-helices (predicted by CBS Prediction Servers); c: Peptide
size in numbers of amino acid residues; d: Only representative transporter homologues are listed due to article length limitation
276 植物学报 44(3) 2009
酰胺水解酶分解产生乙醛酸、CO2和NH3(Todd et al.,
2006)。在大豆中, 尿囊酸的这2种分解途径均存在, 但
是, 在依赖于固氮生长的条件下, 缺乏脲酶活性的突变体
会表现出生长受阻或减产, 可见, 尿囊酸酰胺水解酶分
解尿囊酸直接释放NH3的途径十分重要。
植物虽然能够通过上述多种途径合成尿素, 但在细
胞质中却很少有较高浓度的尿素积累, 因为脲酶(活性)在
胞质中呈组成型表达。脲酶在亚细胞水平上的表达特
征也说明, 尿素在胞质中形成或向胞质中转运是不可或
缺的。在所有与尿素生物合成相关的酶中, 仅知精氨酸
酶位于线粒体内, 而其它相关酶的亚细胞作用位点目前
尚不清楚。尿素可能形成于不同的细胞器中, 如线粒
体、内质网和过氧化酶体等(Werner et al., 2008)。因
此, 探索和鉴定各种细胞器膜中可能存在的尿素转运蛋
图 1 植物细胞中尿素的形成、分解及转运途径示意图
尿素既可产生于多种氮代谢途径也能通过位于质膜上的高(HAT, 如DUR3途径)、低(LAT, 如MIPs)亲和力运输系统从环境中进入细胞
内。植物中合成尿素的酶主要包括: (1) 精氨酸酶; (2) 胍丁胺酶; (3) 刀豆氨酸水解酶; (4) 脒基 /酰胺水解酶类, 如尿囊酸脒基水解酶和
尿素裂解酶(详见正文第 2节)。尿素可能通过液泡膜上的转运蛋白(如液泡膜内在蛋白, 即TIPs)在液泡和细胞质间被区间化。然而, 尿
素是否在液泡中贮存仍未知。尿素自线粒体向胞质中运输的途径目前尚不清楚。胞质中的尿素经脲酶水解为氨, 进而在谷氨酰胺合成
酶的作用下进入氮同化途径。
Figure 1 Simplified pathways of urea generation, transport and degradation in plant cells
Urea is derived either from metabolism or is taken up from the environment through high (HAT) and low (LAT) affinity transport
systems located in the plasma membrane. Urea-generating enzymes are (1) arginase, (2) agmatinase, (3) canavanine hydrolase,
and (4) namely allantoate amidinohydrolase amidinohydrolases, and urea-lyase (for details, see Section 2). Urea could be
compartmentalized between cytoplasm and vacuoles by tonoplast-targeted transporters such as TIPs. However, so far it is not
clear if urea is stored in vac uoles. The pathway for urea movement out of mitochondria is unknown. Cytosolic urea can be
hydrolyzed by urease to ammonia, which can be assimilated by glutamine synthetase.
277曹凤秋等: 高等植物尿素代谢及转运的分子机理
白, 对认识尿素在细胞中的区间化及其生理意义非常重
要。据报道, 植物在利用和再迁移种子中贮藏蛋白氮素
的过程中, 脲酶和精氨酸酶的协同作用将会促使来自酰
脲代谢的氮素再同化。此过程也表明, 尿素的形成和脲
酶的作用在植物氮代谢及其运输机理中具有重要的生理
意义, 特别是对于幼苗和衰老的叶片, 因为其中的含氮大
分子(如蛋白质和核酸等)的分解以及氮素的重迁移尤为
明显。 例如番茄(Lycopersicon esculentum)随着叶片
和植株的衰老, 脲酶的活性约增加10倍, 这应与衰老组
织中的氮素回收机制相关(Witte et al., 2002)。
1.2 尿素氮源的利用
尿素含氮量高(含N 46%)、化学性质相对稳定且生产成
本低, 因此, 为了提高作物的产量及品质, 尿素作为氮素
化肥而被广泛地应用于现代农业生产中。尤其在发展
中国家, 尿素的使用量已占氮化肥总量的 50%。尿素
施入土壤后, 会迅速被土壤微生物释放的脲酶水解为
CO2和NH3, NH3虽然能作为重要的氮源被植物吸收利
用, 但它也不可避免地会诱导多种失氮途径(如氨的挥
发、硝化和反硝化, 以及硝态氮的渗漏等), 导致大部分
尿素-氮损失于大气和土壤环境中。这也是作物对氮肥
的当季利用率很低的重要原因之一。
尿素是否可被植物迅速地利用, 取决于植物内外环
境中存在的脲酶活性。在植物细胞中, 已知能分解尿素
的酶有 2 类: 脲酶(或尿素酰胺水解酶(urea amidohy-
drolase))和尿素酰胺酶(urea amidolase)。二者均在细
胞质中将尿素水解为CO2和NH3, NH3/NH4+随即被谷氨
酸合成酶利用, 以供其它含氮大分子(蛋白质及核酸等)的
生物合成(图1)。现已发现脲酶(活性)广泛存在于其它
许多生物体(动物除外)中。但是, 在高等植物中, 仅有
尿素能被脲酶分解而进入氮同化途径。该酶在萌芽的
种子中含量很高, 但在营养器官中表达水平却较低(Todd
et al., 2006)。尽管如此, 有报道显示, 种子中的胚特
异性脲酶(embryo-specific urease)的作用并非主要是
同化尿素, 还与幼苗抵御植物病原菌的侵染有关。但
是, 与此相关的生物机理还有待深入研究(Becker-Ritt et
al., 2007)。
脲酶的生物催化活性需要镍离子和一些特定的辅助
蛋白(如拟南芥中的UreD、 UreF和UreG)参与(Witte et
al., 2005)。使用脲酶抑制剂、缺镍处理和脲酶基因突
变均会导致脲酶活性降低, 以及组织中尿素含量增高
(Witte et al., 2002)。由此表明脲酶在分解和同化尿素
过程中具有重要作用。而尿素酰胺酶, 目前仅发现存在
于细菌、酵母和藻类中,此酶以脲基甲酸酯(allophan-
ate) 为中间产物, 利用ATP分解产生的能量将尿素分解
为CO2和NH3 (Kanamori et al., 2004)。
鉴于尿素是全球范围内施用量最大的氮素化肥, 故
认识尿素的酶水解特征具有重要的农业生产意义。尿
素在土壤中分解为氨供植物吸收, 使植物获得尿素中的
氮源。但是, 土壤中脲酶的高活力也会产生大量有害的
氨及其氧化物(如NO、N2O和NO3-), 从而导致生态环
境的严重破坏并造成经济损失。此外, 据报道, 施用尿
素可明显地引起表层(2 cm)土壤pH值瞬时增加; 在短期
盆栽实验中, 施用尿素亦可导致土壤 pH值显著改变
(Condon et al., 1998)。然而, 据Nohrstedt等(2000)
报道, 在13年的观测中, 森林土壤的pH值和一些大量
营养元素(如钙、镁和钾)的浓度并未因施用尿素而受到
明显的影响。至于在长时间尺度上估测施用尿素氮肥
是否会对农业土壤的性质产生影响, 目前还缺乏足够的
实验数据, 值得进一步研究。
尿素氮肥主要施于农业土壤中, 作物可以通过根部
吸收氮营养。然而, 在生产实践中, 尿素亦常用于叶面
喷施, 以实现对作物氮素营养的最佳管理。尤其是在作
物生长受到胁迫的条件下(如盐害和干旱胁迫等), 根系发
育严重受阻, 采用尿素叶面施用方法, 将会有效地缓解因
根系功能受阻而导致的氮营养缺乏。此外, 在开花期采
用尿素叶面喷施, 将有助于提高作物种子中的氮(或蛋白质)
含量。许多植物均能够迅速吸收叶面施用的尿素。然而,
尿素在细胞质中积累过多则会对叶片产生毒害作用。
2 植物中尿素转运蛋白存在的生理学
依据
经典的理论认为: 植物利用尿素作为氮源是因为尿素易
278 植物学报 44(3) 2009
被土壤微生物释放的脲酶水解为CO2和NH3, NH3可以
作为氮源被植物吸收。这一理论导致人们忽略了对植
物能够直接吸收尿素分子的可能性及其相关机理的研
究。然而, 一些早期的植物生理学及营养学研究数据则
支持尿素能够被直接吸收进入植物细胞的观点。当水
稻由于缺镍引起脲酶活性降低时, 供应根部尿素浓度为
3 mmol.L-1的营养液, 便能使水稻地上部尿素积累浓度
高达70-75 mmol.L-1; 此外, Liu等(2003b)还观察到水
稻根部吸收积累尿素的总量与植株的水分蒸腾量呈线性
正相关。这些结果表明, 在无土壤微生物存在的条件
下, 外源尿素很可能被植物根系直接吸收, 并在未降解的
情况下转运至地上部。当对小麦(Triticum aestivum)的
地上部施用尿素时, 使用脲酶抑制剂— —苯基磷二酰胺
(phenyl phosphorodiamidate, PPD), 则可导致小麦叶
片中尿素含量增高, 且伴有严重的叶尖坏死症状, 再次表
明尿素分子能够被直接吸收进入(叶片)细胞。在缺失脲
酶(活性)的大豆和马铃薯(Solanum tuberosum)突变体
中, 也有关于植物能够直接吸收尿素氮源的类似报道
(Witte et al., 2002)。
由于尿素的分子量较小且其水溶液呈中性, 因此, 长
期以来人们一直认为尿素分子与水分子类似, 易于通过
自由扩散的方式跨生物膜进入细胞。然而, 20世纪80
年代初, 学术界逐渐认识到尿素分子很可能通过不同的
运输途径进入植物细胞。例如, 在低等植物轮藻(Chara
australis)的巨型细胞中, 利用C14尿素吸收测定法和电
生理膜片钳测试技术, 发现与细胞吸收尿素相关的动力
学常数至少有2种, 表明可能存在2类不同的转运体系,
即需要能量且逆电化学梯度的主动吸收尿素途径和膜蛋
白促进型的尿素跨膜扩散的被动运输系统(Liu et al.,
2003a)。以上研究证明, 在植物细胞中存在依赖于膜蛋
白的以高、低亲和力运输尿素的途径。对高等植物小
麦和烟草(Nicotiana tabacum)的研究发现, 小麦根细胞
质膜以及烟草的质膜和液泡膜均对尿素具有不同程度的
通透性。此外, Liu等(2003a)对拟南芥的研究发现, C14
标记的尿素流入其悬浮细胞的量受细胞膜质子泵ATP
酶解耦联剂CCCP的抑制。这些结果说明, 尿素进入高
等植物细胞的途径中至少有一类需要能量。
最近, Kojima等(2007)利用N15标记尿素, 首次对拟
南芥根吸收尿素的生理学机理进行了定量化研究。结
果表明, 在低浓度尿素下, 缺氮的野生型拟南芥根系吸收
尿素具有典型的酶动力学特征(其Km值约为4 mmol.L-1);
当外界尿素浓度约为17 mmol.L-1时, 根对尿素的吸收达
到饱和状态; 但当尿素浓度介于0.2-1.2 mmol.L-1时, 尿
素进入根细胞的量与外界浓度则呈线性动力学关系。因
此, 拟南芥吸收尿素的动力学特征(常数)揭示了高等植物
具有跨细胞质膜转运尿素的高、低亲和力系统。
3 高亲和力转运尿素机制— —植物DUR3
同源蛋白对尿素的主动运输
Liu等(2003a)通过对动物和微生物中已知的尿素转运蛋
白基因的同源性搜索和分析, 发现在模式植物拟南芥的
基因组中存在基因At5g45380(现已命名为AtDUR3), 其
所编码的膜蛋白与酵母菌主动运输尿素的ScDUR3具有
40%的同源性, 该膜蛋白含有694个氨基酸残基, 预测
具有14个跨膜区域。在结构上, AtDUR3属于钠 /溶质
共运的SSS家族。目前, 该家族包含 100多个来自原
核和真核生物的成员基因, 可划分为11个亚家系(Jung,
2002), 但是在该家族中无一成员与AtDUR3具有较高的
相似性(最高的仅约 16 % )。已知的动物和微生物的
SSS蛋白能够通过对钠的共运输而催化对多种溶质(如
氨基酸、糖、核酸、维生素、肌醇和尿素)的跨膜转
运。但在多种情况下, 推测SSS蛋白可能只转运 1种
底物或1组结构相似的底物 (Jung, 2002)。
目前, 在已测序的高等植物中, 发现DUR3同源基
因皆以单一的基因模式(singleton)存在于基因组中, 如拟
南芥的AtDUR3、水稻的OsDUR3(AY473691)、玉米
的 ZmDUR3 (ZmSSStuc11-12-04.11168.1)及葡萄
(Vitis vinifera)的 VvDUR3 (CAO66700)等。在生理功
能上, AtDUR3的表达能够恢复酵母菌Dscdur3突变体
在酸性条件下较好地利用外源尿素(2 mmol.L-1)作为唯
一氮源而生长的能力(Liu et al., 2003a)。较低的pH值
(而非钠离子)能够明显增强尿素向有AtDUR3表达的蛙
卵细胞中内流, 同时可观察到指向胞内的电流(Liu et al.,
279曹凤秋等: 高等植物尿素代谢及转运的分子机理
2003a); Liu等(2003a)测出AtDUR3在蛙卵中转运尿素
的Km值约为 3 mmol.L-1。双微电极电压膜片钳法研
究表明, 就底物专一性而言, 在有AtDUR3表达的蛙卵
中, 除尿素和硫脲外, 葡萄糖、半乳糖、肌醇和脯氨酸
等一些可能的SSS家族的转运底物均不引起明显的细
胞内向电流(Liu et al., 2003a)。这说明AtDUR3是一
个耦联质子(流), 能够以高亲和力主动运输尿素的蛋白,
故称之为尿素 /质子共运蛋白(urea/proton symport-
er)。在多细胞生物中, AtDUR3是第1个被克隆并被鉴
定的主动运输尿素的转运蛋白。最近有报道表明, 酵母
的ScDUR3不仅能转运尿素, 而且也能运输多胺(如精
胺, Km = 21.2 mmol.L-1; 腐胺, Km = 479 mmol.L-1)
(Uemura et al., 2007)。多胺在植物生长发育和响应外
界胁迫(如虫害和营养胁迫)的过程中具有极其重要的作
用(Groppa and Benavides, 2008), 但目前在植物中尚
未发现多胺转运蛋白。因此, 植物的DUR3同源蛋白是
否也具有类似于ScDUR3的多胺转运功能, 值得进一步
研究。
AtDUR3主要在缺氮的拟南芥根(表皮)细胞质膜上
表达(Kojima et al., 2007)。其转录水平随着植物缺氮
程度的增加而升高, 植物缺氮后供给尿素, AtDUR3
mRNA水平明显增加, 但NO3-和NH4+则抑制缺氮所诱
导的 AtDUR3 mRNA的上调表达(Kojima et a l. ,
2007)。因此, AtDUR3既是植物响应缺氮胁迫的组分
之一, 又是一种受底物(尿素)诱导的转运系统, 这与硝酸
盐转运蛋白NRT2;1基因的表达调控机制类似 (Kojima
et al., 2007)。
最新的研究表明(Kojima et al., 2007), 在拟南芥中
AtDUR3具有转运尿素分子的功能, 尤其在缺氮时, 它与
拟南芥(根)吸收利用尿素氮有关。在低浓度尿素条件
下, 被T-DNA插入敲除的Atdur3突变体表现出叶片失
绿及花青素积累的典型缺氮症状。N15-尿素吸收实验
也进一步证明, 缺氮后对植株根系供给毫摩尔级浓度的
尿素态氮, AtDUR3功能的缺失将导致植株中尿素的积
累量降低, 仅为野生型植株的20%-30%。此外, 当外
界尿素浓度小于200 mmol.L-1时, Atdur3突变体吸收尿
素的曲线呈直线型, 而野生型则呈饱和的动力学吸收曲
线, 且Km值约为 4 mmol.L-1, 这与在蛙卵基因表达系
统中测定的AtDUR3对尿素的Km值(~3 mmol.L-1)相近
(L iu e t al. , 2003a; Kojima et a l. , 2007)。因此,
AtDUR3应该是高等植物中主动吸收/运输尿素的主要
转运蛋白(Kojima et al., 2007)。
土壤中尿素的浓度多为微摩尔级, 因此, AtDUR3为
植物直接吸收和利用土壤中低浓度的尿素氮源提供了一
种较为便利的途径。为了深入认识 AtDUR3的功能与
植物氮素利用率的关系, 作者认为有必要进一步研究在
AtDUR3过量表达下的转基因植物对尿素-氮的利用情
况以及AtDUR3的表达调控机制, 其中也包括探究细胞
中氮的主要同化产物—— 谷氨酰胺的作用。其原因是
Morel 等(2008)发现, 真菌PiDUR3的表达受植物内源
谷氨酰胺的抑制。 此外, 在植物衰老叶片和萌发的种子
中, AtDUR3均有较高的转录水平(Liu et al., 2003a)。
如果在这些组织中形成的尿素需要运输到其它生长部位,
则AtDUR3在植物的氮素再利用和循环中也可能具有重
要的分子生理功能。
4 低亲和力的尿素转运机制——水通道
蛋白对尿素的运输
植物获取土壤中或转运体内不同浓度的尿素需要不同亲
和力的运输系统。与已发现的转运氨、硝酸根和氨基
酸的运输蛋白类似, 在植物细胞中可能存在除AtDUR3
以外的其它类型的尿素转运蛋白或基因。
在拟南芥基因组中, 存在一个编码35个膜蛋白的基
因家族, 即主要内在蛋白基因家族(major int r ins ic
protein, MIP family), MIP蛋白序列与动物的水通道或
水孔蛋白高度相似。迄今为止, 在植物界中发现的MIP
蛋白质可分为4个亚家系: 质膜内在蛋白(plasmamem-
brane intr ins ic prote ins, PIP)、液泡膜内在蛋白
(tonoplast intrinsic protein, TIP)、根瘤26-类似 的内
在蛋白(nodulin-26-like intrinsic proteins, NIP)和碱性
小分子内在蛋白(small basic intrinsic protein, SIP)。
水通道蛋白通常含有6个跨膜a-螺旋, 5个区间环(A-
E), 其中B和E环形成小型螺旋且部分嵌于膜中。B和
280 植物学报 44(3) 2009
E均含有天冬氨酸 -脯氨酸-丙氨酸(NPA motif)以及芳
香族氨基／精氨酸(ar/R)的保守序列, 被视为重要的底物
选择性过滤器结构。在总体结构上, 功能性的水通道为
四亚基聚合体, 并形成狭窄的通道(Forrest and Bhave,
2007)。人体红细胞中的AQP1(原名CHIP28)是首次被
鉴定的水孔蛋白, AQP1在蛙卵中的表达导致细胞对水
的通透性剧增 (Preston et al., 1992)。基于对基因功
能在异源表达系统中的鉴定, 人们相继发现了一些转运
尿素和甘油等中性小分子的水孔蛋白(如人的APQ3, 6,
7, 9 , 10; 烟草的 NtAQP1 和 NtTI Pa 以及玉米的
ZmPIP1-5b) (Liu et al., 2003b; Gaspar et al., 2003)。
但是, MIP蛋白在植物中促使尿素转运的生理作用还有
待进一步研究。
Liu等(2003a, 2003b)利用酵母菌基因功能互补实
验, 在基因组(cDNA库)尺度上对拟南芥中可能存在的尿
素转运蛋白基因进行了全面筛选。除AtDUR3基因外,
研究者又分离并发现了4个新的膜蛋白基因, 它们均与
植物吸收尿素有关(Liu et al., 2003b)。Liu等(2003b)
通过对它们的基因序列、转录调控机制、蛋白质表达
位点以及基因产物转运尿素的生化特征等一系列的深入
研究, 结果表明, 这 4个基因(即At2g36830、At3g-
26520、 At3g16240和At2g25810)所编码的膜蛋白
(AtTIP1;1、AtTIP1;2、AtTIP2;1和AtTIP4;1)具有水
通道的序列特征。它们在2种不同的异源表达系统(即
酵母菌和蛙卵)中均能够引起不受pH值(5-8)影响的尿
素跨膜运输。同时也证明, TIP2;1所引起的尿素在蛙卵
中的吸收积累总量与外界尿素浓度(0-30 mmol.L-1)成
正比。这种直线型的依赖于底物浓度的动力学吸收方
式, 反映了典型的通道促进式尿素运输途径, 这通常也是
低亲和力转运蛋白对底物的运输特征。利用绿色荧光
蛋白(即GFP)进行标记, 发现这4个基因的产物主要靶
位于液泡膜上, 但在质膜上也能观察到较弱的GFP信
号; 至于这4种水通道蛋白能否同时靶位于2种不同的
生物膜上, 并在水分和氮素胁迫的条件下发挥其生理功
能(Vera-Estrella et al., 2004; 杨惠敏等, 2005; Forrest
and Bhave, 2007), 还有待进一步研究。此外, AtTIP1;
1、AtTIP1;2、AtTIP2;1和AtTIP4;1在整个植物体
中均有较高水平的转录表达, 但它们在根部的转录调控
机制与AtDUR3相似, 即受植物体内部氮营养状况的调
节(Liu et al., 2003b)。由此推测, 这 4 个水通道蛋白
可能是高容量(high-capacity)(或低亲和力(low affinity))
尿素运载蛋白的最佳候选者。倘若如此, 此类通道蛋白
可能既承担了对尿素进行跨质膜运输/吸收的功能, 又担
负了将细胞质中的尿素转移并贮存于液泡中的职责, 这
样在需要时可将尿素从液泡转运至胞质中作为氮源利用,
进而防止了高浓度尿素在胞质中产生毒害作用(图 1)。
目前, 关于水通道对NH3和NH4+的通透能力, 学术界一
直存在争议。例如小麦的3个TIP2水孔蛋白曾被鉴定
为低亲和力的NH3(或NH4+)运载体(Holm et al., 2005);
Loque等(2005)通过对拟南芥的研究, 认为AtTIP2;1和
AtTIP2;3可能促使NH3向液泡中转运。显然, 这些研
究结果均涉及如何估测和认识MIP蛋白在植物氮营养吸
收利用中的作用, 以及MIP蛋白转运尿素在何种程度上
与生理条件相关。
5 结语
尿素存在并产生于植物的内、外环境中, 对植物吸收外
部氮源供其生长发育以及维持植物体内的氮代谢平衡和
再利用等具有重要的生理意义。 然而, 近年来学术界才
逐渐认清植物对尿素吸收/转运的分子机理。现有的研
究表明, 高等植物拥有多种不同类型的运输系统, 并能以
高、低亲和力跨越不同的生物膜转运尿素和其它含氮
化合物。鉴于环境中出现的多种可被利用的氮素形态
(或植物体中合成的各种含氮化合物), 多种类型转运蛋白
的存在使植物有可能对氮素进行有效地获取利用、组
织间分配以及胞内区间化(韩燕来等, 2003)。由于农业
中尿素化肥的广泛使用, 导致在土壤中一定浓度(推测为
微摩尔级至毫摩尔级)的尿素及其分解产物(NH3)和随后
形成的氧化产物(NO3-)同时存在。倘若施用尿素缓释
肥及使用化学抑制剂降低土壤中脲酶和硝化酶等的活性
便可减少氮的损失, 并可提高植物氮素的利用率, 那么应
使植物在尿素未被土壤中的微生物分解之前, 更有效地
直接吸收和利用尿素。因此, 研究和阐明植物转运和同
281曹凤秋等: 高等植物尿素代谢及转运的分子机理
化尿素的分子生理机制, 不仅对从理论上认识与尿素相
关的植物氮素营养具有重要的意义, 而且可为探索提高
作物尿素态氮的利用效率开辟新的思路或途径。
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College of Resources and Environmental Sciences, China Agricultural University, Beij ing 100193, China
Abstract Urea occurs in nature and serves as a rapidly available nitrogen (N) source for the growth of many organisms,
including plants. This review gives a brief overview of the fundamental physiological significance of urea occurrence and its
permeable proteins in various living systems. Mechanisms for urea generation and degradation in plants are discussed, and
physiological roles of urea in plant N nutrition, metabolism and transport are highlighted. Two types of plant membrane transporters,
namely MIPs and DUR3, potentially play roles in low- and high-affinity urea transport, respectively. MIPs mediate passive urea
movement and were primarily investigated in heterologous gene-expression systems; AtDUR3 was shown to participate in urea
uptake in Arabidopsis roots. Transport characteristics, transcriptional regulation, and the subcellular localization of MIPs and DUR3
suggest the relevance of urea transport through these transporters in N nutrition and redistribution in planta.
Key words aquaporin, DUR3 protein, nitrogen, urease, urea transport
Cao FQ, Liu GW, Wang WH, Wu XM, Liu LH (2009). Molecular processes of urea metabolism and transport in higher plants. Chin Bull
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* Author for correspondence. E-mail: LL1025@cau.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)
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