全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (1): 80-84, w w w .chinbullbotany.com
收稿日期: 2006-12-30; 接受日期: 2007-04-27
基金项目: 黑龙江省科技计划项目(No.GB06B303)
* 通讯作者。E-mail: chpyang2006@126.com
.实验简报.
小黑杨花药培养植株转化胆碱氧化酶基因提高耐盐性
姜静 1 , 王雷 1 , 詹立平2 , 王玉成 1 , 刘桂丰1 , 杨传平 1 *
1东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 林木遗传育种黑龙江省重点实验室, 哈尔滨 150040
2 辽宁中医学院职业技术学院, 沈阳 110101
摘要 以小黑杨(Populus sim oni i ×P. n igra )花药培养植株无菌苗叶片为外植体, 通过根癌农杆菌(Agrob acterium
tumefaciens)介导法将胆碱氧化酶基因(codA)导入小黑杨中, 共获得4株转化株系, PCR扩增和Southern杂交检测结果全部
呈阳性, 表明codA基因已整合到小黑杨花药培养植株基因组中。荧光定量RT-PCR检测证明, codA基因在小黑杨花药培养植
株中获得表达。耐盐实验结果显示, 各转基因株系在0.6%的NaCl浓度下能够生长, 而非转基因对照小黑杨受盐害严重, 说明
codA基因的导入提高了转基因植株的耐盐性。
关键词 胆碱氧化酶基因, 小黑杨, 耐盐性
姜静 , 王雷 , 詹立平 , 王玉成 , 刘桂丰 , 杨传平 (2008). 小黑杨花药培养植株转化胆碱氧化酶基因提高耐盐性. 植物学通报 25, 80-84.
高等植物在盐胁迫下细胞内迅速积累脯氨酸和甜菜
碱等渗透保护物质, 进而增强耐盐性, 这是植物逆境生理
反应的特征之一。在研究过的百余种代谢物中, 甜菜碱
被认为是最好的渗透调节剂, 甜菜碱在植物细胞内的积
累使许多代谢中的重要酶类在渗透胁迫下能保持活性
(McCue and Hanson, 1990; 马德钦等, 1995; 陈少良
等, 2001; 贾庚祥等, 2002)。因此, 通过转基因技术把
有关甜菜碱合成酶基因导入非耐盐植物基因组中将增强
植物的抗逆性(Nucc io et al. , 1998; Sakamoto and
Murata, 2000; 沈义国等, 2001; 刘振林和戴思兰, 2004;
王春明等, 2004; 刘桂丰等, 2006)
细菌乙酰胆碱氧化酶(choline ox idase, COD)不需
任何辅助因子可将乙酰胆碱一步合成甜菜碱。因此,
codA基因被认为是植物耐盐基因工程中的有效基因, 广
泛用于植物的耐盐转基因研究。目前, codA 基因已经
被成功转入烟草、水稻和拟南芥等植物中, 均获得了耐
盐性提高的转基因植株(Hayashi et al., 1997; 何培民
等, 2001; Mohanty et al., 2002)。
有关小黑杨 codA 基因的导入未见报道。为了深入
了解逆境下甜菜碱对植物的保护作用, 我们采用农杆菌
介导法将 codA 基因转入小黑杨花药培养植株, 并检测
转基因植株的耐盐性。
1 材料与方法
1.1 材料
小黑杨(Populus s imonii×P.nigra)花药培养植株是由本
实验室经花药诱导获得的(刘桂丰等, 2002)。以MH附
加 0.5 mg.L-1 6-BA 和 0.01 mg.L-1 NAA 的培养基为
继代培养基, 约 20天继代 1次; 以MH附加 0.5 mg.L-1
6-BA和 0.05 mg.L-1 NAA 培养基为诱导叶片分化的培
养基; 0.2 mg.L-1 IBA 培养基为生根培养基。
农杆菌(Agrobact eri um t ume fac i ens )菌株为
EHA105, 内含植物表达载体pGAH, 携带 codA基因(由
上海市农业科学院张大兵博士馈赠)。
1.2 实验方法
1.2.1 农杆菌介导的遗传转化
菌种的活化和工程菌液的制备按相关文献(王关林和方宏
筠, 2002)所述方法进行。小黑杨花药培养植株的遗传
81姜静等: 小黑杨花药培养植株转化胆碱氧化酶基因提高耐盐性
转化采用本实验室已建立的方法(杨传平等, 2001)。
1.2.2 PCR检测
采用CTAB法提取转基因及非转基因植株的总DNA, 采
用小量质粒快速抽提纯化试剂盒(购自上海华舜生物工程
有限公司)提取阳性对照 pGA H质粒。
以 c odA 基因两端序列为引物, 上游引物为 5 -
AACATCGAGAACCTGAGCGCGACAGG-3; 下游引物
为 5-AGCATCAACAGCTTCGGCGTATC-3。以pGAH
质粒上的目的基因片段为阳性对照, 非转基因植株的总
DNA 为阴性对照, 对转基因植株的总 DNA 样品进行
PCR扩增, 扩增产物用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 Southern 印迹杂交检测
将转基因植株和非转基因对照植株的总DNA 经 EcoRI
和HindIII双酶切, 在0.8%琼脂糖凝胶中电泳分离, 按标
准的 S ou t h e r n 印迹法进行转移(王关林和方宏筠,
2002)。以外源基因 codA 为探针, 按 Boehringer公司
的 DIG DNA Labell ing and Detection Kit进行 South-
e rn 杂交和检测。
1.2.4 外源基因转录水平的检测
用 SDS 法提取转基因及非转基因对照植株的总RNA,
经 DNase消化处理后进行反转录。以 cDNA 作为定量
P C R 模板, 选择杨树甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶基因
(GAPDH)作为内参基因, 在NCBI核酸数据库中检索, 获
得该基因的开放阅读框序列。用 Primer5.0软件设计内
参基因引物和外源基因引物(表 1 )。
实时荧光定量 PCR检测采用DyDAmoTm SYBR
Green qPCR Kit (购自 FINNZYMES 公司)。20 mL反
应体系中加入: 2×DyNAmo Master Mix 10 mL; 去离子
水 4 mL; cDNA 2 mL; 内参基因和外源基因的上游引物
和下游引物各 50 pmol.L-1。各反应均设 3次重复, 分
别设置水对照和总 RNA对照。使用实时数据采集模式,
循环反应参数为 94°C预变性 3分钟; 94°C变性 30秒,
58°C退火 30 秒, 72°C延伸 30 秒; 循环 40 次。分别
在 76°C和 85°C读板, 收集荧光, 绘制溶解曲线, 温度
由 58°C开始, 至 95°C停止。利用Opt icon Monitor
2.02软件保存和分析数据, 根据公式XN=2- △ CT计算外
源基因的相对定量(Kenneth and Thomas, 2001)。
1.2.5 转基因小黑杨花药培养植株的耐盐性测定
将 P CR 检测呈阳性的 4 个转化植株分别编号为 T1、
T2、T3和T4, 经过扩大繁殖后获得 4个转基因株系, 每
个株系扩繁 100余株。从每个株系中选出高 2 cm左右
的无根组培苗 60株, 分成 6组, 每组 10株, 分别移入
NaCl 浓度为 0(CK )、0. 4%、0. 5%、0. 6%、0. 7%
和0.8%的生根培养基(MH+ 0.2 mg.L-1 IBA + 20 mg.
L-1 Km)中进行胁迫实验。以未转基因小黑杨花药培养
植株为对照, 30天后统计各株系的生根及盐害情况, 计
算盐害指数。盐害级值确定: 无盐害症状为 0级; 轻度
盐害(有少部分叶尖及叶缘变黄)为 1级; 中度盐害(有约
1/2的叶尖及叶缘焦枯)为 2级; 重度盐害(大部分叶尖及
叶缘焦枯或脱落)为3级; 极重度盐害(叶落, 最终死亡)为
4级。盐害指数(D)=S (盐害级值 ×相应盐害级值株数)/
(总株数×盐害最高级值)×100%(孙仲序等, 2002)。
2 结果与分析
2.1 外源基因已整合到小黑杨花药培养植株基因
组中
小黑杨花药培养植株叶片经农杆菌 EHA105(pGAH)浸
染, 在含卡那霉素 50 mg.L-1的选择培养基上培养 3周
后, 在发生转化的叶片上产生绿色的愈伤组织。30天左
右由愈伤组织分化出不定芽, 再将不定芽转至生根培养
基中, 15-20 天内可生根。
表 1 转基因小黑杨定量PCR扩增所用引物序列
Table 1 Pr imer sequences f or real- time quantitative PCR of
transgenic Popul us simoni i×P. nigra
Gene Primer sequence Length of
name amplif ication
products(bp)
GAPDH 5-CCTGCATA AA GCA CAA CC-3
5-AGGGAGGAGTCTGA GAA TAA-3 190
codA 5-AATCGGGCTA CGACTGG-3
5-GCGTCCTCGTTGGTTTC-3 229
82 植物学通报 25(1) 2008
分别对所获得的4株卡那霉素抗性植株提取叶片总
DNA, 用特异引物进行 PCR扩增检测, 阳性对照及 T1、
T2、T3和 T4转化再生植株均扩增出 820 bp的特异谱
带, 而非转化对照植株则未出现扩增谱带(图 1)。上述
结果初步表明 codA基因已整合到所检测的 4株小黑杨
花药培养植株基因组中。
在 PCR检测的基础上, 以 codA为探针对转基因植
株进行 Southern印迹杂交检测。由图 2可知, 4个转基
因株系及阳性对照均获得了杂交谱带, 表明外源基因已
经整合到小黑杨花药培养植株的基因组中。
2.2 外源基因在mRNA水平的表达
采用实时荧光定量RT-PCR技术对获得的转基因株系进
行了分析。结果表明, 4个转基因株系在mRNA水平上
均能够表达, 但外源基因的表达量不同, T2表达量最高,
T4次之, T1最低(图 3)。
2.3 转基因小黑杨花药培养植株耐盐性的提高
将分子检测为阳性的 4个转基因株系无根苗分别移栽于
含不同浓度NaCl的生根培养基中培养, 根据生根率和盐
害指数综合评价转基因组培苗的耐盐能力。
由表 2、表 3和图 4、图 5可见, 非转基因对照植
株在 0.6% 的 NaCl 胁迫下, 盐害严重, 盐害指数高达
97.5%, 生根率仅为 10%, 表明非转基因对照植株在此
NaCl 浓度下不能正常生长。而转基因株系在浓度为
0.6% NaCl的培养基中表现轻度盐害, 4个株系的生根
率均在50%以上, 平均生根率为67.5%, 是对照的6.75
图 1 转基因植株PCR扩增电泳图谱
1: DNA标准样品; 2: 阳性对照; 3: 阴性对照; 4-7: 转基因植株
Figur e 1 PCR products of transgenic plants
1: DNA marker DL2000; 2: pos itive control; 3: negative control;
4-7: transgenic plants
图 2 转基因植株Southern印迹杂交检测图谱
1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3-6: 转基因植株
Figur e 2 Southern blots of transgenic plants
1: posit ive control; 2: negative control; 3-6: transgenic plants
图 3 各转基因株系 codA基因mRNA 表达水平的相对定量
Figure 3 Relative codA gene mRNA expression levels of
transgenic Popul us simoni i×P. ni gra lines
表 2 转基因小黑杨在不同浓度NaCl条件下的盐害指数
Table 2 Salt-harm index of transgenic Popul us simoni i×P. ni-
gra under diff erent concentration of NaCl
Exper iment Salinity(%)
material 0 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80
CK 0 15.0 37.5 97.5 100.0 100.0
T1 0 0 10.0 22.5 30.0 82.5
T2 0 2.5 12.5 22.5 40.0 82.5
T3 0 0 5.0 30.0 50.0 85.0
T4 0 0 2.5 17.5 20.0 60.0
83姜静等: 小黑杨花药培养植株转化胆碱氧化酶基因提高耐盐性
倍。胁迫实验表明, 4个转基因株系的耐盐性均有不同
程度的提高, 在 0.6% 的 NaCl 胁迫下能够生长。
3 讨论
自Rozwadowsk i等(1991)将 codA基因导入到大肠杆菌
(E. coli)甜菜碱合成突变体中, 使其改善了耐盐性以来,
至今已有许多学者对 codA基因的功能进行了研究。实
验证明, 转codA基因的植物由于甜菜碱的积累, 增强了
植物的耐盐性和耐低温性(Hayashi et al. , 1997; 何培
民等, 2001; Mohanty et al. , 2002)。
本研究将土壤细菌(A. globiformis)的 codA基因通
过农杆菌介导法转入小黑杨花药培养植株中, 通过筛选
获得了 4个转基因株系。分子检测证明, codA 基因已
整合到小黑杨花药培养植株基因组中, 并且在mRNA水
平上均得到不同程度的表达。在此基础上对组培苗进
行了 NaCl胁迫实验, 结果表明, 获得的 4个转基因株系
的组培苗在浓度为 0.6%的NaCl胁迫下盐害较轻, 平均
盐害指数比非转基因对照低76.28%, 平均生根率是对照
的 6.75倍, 表明 codA基因的导入提高了转基因小黑杨
花药培养植株的耐盐性。
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表 3 转基因小黑杨在不同浓度NaCl条件下的生根率
Table 3 Root ratio of transgenic Populus s imoni i×P. nigra
under different concentration of NaCl
Exper iment Salinity(%)
material 0 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80
CK 100 100 60 10 0 0
T1 100 100 70 70 30 0
T2 100 100 60 50 10 0
T3 100 100 60 50 20 0
T4 100 100 80 100 30 30
图 4 生根培养的小黑杨
(A) 生根培养的转基因小黑杨;
(B) 浓度为0.6%的NaCl培养基上生长的转基因小黑杨(左)和非转
基因对照小黑杨(右)
Figur e 4 Popul us si monii × P. nigra cultured on medium f or
induc ing roots
(A) transgenic Popul us simoni i×P. ni gra f or inducing roots;
(B) transgenic (left) and non- transgenic ( right) P.simonii × P.
ni gra on culture medium containing 0.6% NaCl
图 5 0.6% NaCl胁迫下转基因小黑杨及对照的生根状况
(A) 浓度为 0.6%的NaCl生根培养基上生长的转基因小黑杨;
(B) 非转基因对照小黑杨
Figur e 5 Transgenic Popul us s imonii × P. ni gra and control
cultured on medium containing 0.6% NaCl f or inducing roots
(A) transgenic Populus simonii × P. ni gra on medium contain-
ing 0.6% NaCl for inducing roots;
(B) non- transgenic P.simonii × P. ni gra (control)
84 植物学通报 25(1) 2008
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Abstr act Choline oxidase gene (codA) w as introduced into the haploid plants of Populus simonii × P. nigra by Agrobac teri um-
mediated approach, w ith axenic leaves used as explants. PCR and Southern blot analysis confirmed four kanamyc in- resis tant
transgenic plants, in w hich codA success fully integrated into the genome of Popul us s imonii × P. ni gra haploid plants . Real-time
quantitative PCR revealed that the transgene w as expressed in the transgenic plants at diff erent levels . Salt tolerance tes t
demonstrated that the 4 transgenic plants could grow normally at 0.6% salinity, but nontransgenic plants suffered severely from
the same salinity . Thus, the express ion of codA gene improves the salt-stress tolerance of these transgenic poplar plants.
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* Author for correspondence. E-mail: chpyang2006@126.com
(责任编辑: 白羽红)