全 文 ：植物学通报Chinese Bulletin of Botany 2007, 24 (5): 609-613, www.chinbullbotany.com
收稿日期: 2007-01-12; 接受日期: 2007-04-05
基金项目: 福建省科技计划项目(No. JY-03-B-30-20)
* 通讯作者。E-mail: xldeng207@126.com
.实验简报.
口蹄疫抗原决定簇融合基因转化生菜及表达
邓小莉 1*, 常景玲 2
1平原大学应用生物系分子生物学实验室, 新乡 453003; 2河南科技学院生物工程系分子生物学重点实验室, 新乡 453003
摘要 以3-5天苗龄的散叶大速生生菜(Lactuca sativa var. capatata)无菌苗子叶为外植体, 通过根癌农杆菌介导, 将携带O
型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21- O14 -A21-HBcAg导入生菜。研究结果表明, 含有20 mg.L-1潮霉素(Hyg)的S2 培养基
(MS+1.5 mg.L-1 6-BA+0.2 mg.L-1 IAA+20 mg.L-1 Hyg +300 mg.L-1 Cb)为子叶外植体转化后诱导愈伤和芽再生的最适培
养基, 经抗性筛选, 将抗性芽切下于S3 培养基(1/2MS+20 mg.L-1 Hyg)上诱导生根。通过PCR 和Southern杂交分析证明, 基
因已经整合到生菜基因组中。RT-PCR检测初步表明, O21-O14 -A21-HBcAg基因可以在生菜中正常转录。
关键词 根癌农杆菌, 口蹄疫抗原决定簇, 基因表达, 生菜
邓小莉, 常景玲 (2007). 口蹄疫抗原决定簇融合基因转化生菜及表达. 植物学通报 24, 609-613.
植物反应器与微生物和动物反应器相比, 最大的优
点是可以大规模、廉价和安全地生产动物蛋白或疫苗
(Hiatt et al., 1989; Mason et al., 1996), 特别是用于免
疫和治疗性疫苗的生产已随着研究的深入越来越显示出
其独特的优势(Arntzen, 1998; Tacket et al., 1998)。
据不完全统计, 国外已经有几十种药用蛋白质或多肽在
植物中得到成功表达, 其中包括人的细胞因子、表皮生
长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单
克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等(Mason et al.,
1992; Higo et al., 1993; Matsumoto et al., 1993)。
散叶大速生生菜(Lactuca sativa var. capatata)为
菊科莴苣属植物, 是一种由国外引进的生食蔬菜, 具有较
高的营养价值。它生长周期短, 整株可以生食, 再生和
转化率较高 , 关于生菜的遗传转化已有成功的报道
(Michelmore et al., 1987; Curtis et al., 1999; McCabe
et al., 1999; 刘敬梅等, 2001; 左晓峰等, 2001)。
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是一种由口
蹄疫病毒(foot and mouth diseasevirus, FMDV)引起的
主要感染偶蹄目动物, 传染性极强的人畜共患的急性传
染病, 被国际兽疫局(OIE)列为A类传染病(Domingo et
al., 1992)。该传染病传播途径广, 感染率和死亡率高,
往往带来巨大的经济损失。除动物死亡造成直接经济
损失外, 动物在患病期间, 肉和奶产量减少且种用价值丧
失。由于猪、牛和羊等主要的家畜均可感染此病, 因
此可能形成大规模地流行(Knowles and Samuel,
2003)。
口蹄疫病毒通过直接和间接接触的方式传染。直
接接触主要是通过消化道感染, 或经皮肤和黏膜等侵入
在偶蹄目动物间传染。间接接触主要通过污染的草料
或饮水而感染, 其次空气也是重要的传播媒介(Knowles
and Samuel, 2003)。患病动物在消化道的皮状黏膜、
口、舌、唇、蹄间隙和蹄冠缘、乳房及皮肤的其它
无毛发处等部位发生水泡和溃烂。人和非偶蹄目动物
也可感染此病, 但症状较轻。因此, 将口蹄疫抗原决定
簇融合基因O21-O14-A21-HBcAg导入可以生食的生菜中
并使其表达, 培育出以植物作为生物反应器来大规模生
610 植物学通报 24(5) 2007
产疫苗的转基因蔬菜具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
供试材料为美国大速生生菜(Lactuca sat iva var .
capatata), 种子购自新乡市科达种子公司。
1.1.2 质粒和菌株
农杆菌 EHA105(含质粒pCAMBIA1301-O21-O14 -A21)
由厦门大学生命科学学院陈亮教授惠赠。质粒
pCAMBIA1301-O21-O14-A21的结构见图 1。
0.5-0.8, 即为浸染液。
将生菜无菌苗子叶切去边缘和基部, 在叶片表面划
痕后放入菌液中浸染20分钟, 灭菌滤纸吸干菌液, 接种
于共培养培养基S1中(MS+1.5 mg.L-1 6-BA +0.2 mg.
L-1 IAA+20 mmol.L-1 As), 28°C, 黑暗培养 3天, 然后
转移接种至诱芽筛选培养基 S2中 (MS+1.5 mg.L-1
6-BA+0.2 mg.L-1 IAA+20 mg.L-1 Hyg +300 mg.L-1
Cb), 25°C, 光照强度 4×10-5 mol.m-2.s-1, 每天 14小
时光照长度进行诱芽培养, 每 2周继代 1次。诱芽筛选
期间, 一些浸染外植体褐化死亡, 另一些浸染外植体边缘
会长出抗性愈伤, 进一步长出嫩绿的小芽。待长出的芽
为 1-2 cm 时, 及时将芽拔下转入生根培养基 S3 (1/2
MS )中诱导生根。将生根的植株先移入蛭石中炼苗6-
10天后, 再移入土壤, 于室温自然光照下生长。从开始
诱芽到长出芽苗和生根的时间大约为 35-45天不等。
1.2.3 PCR 法检测转基因生菜
CTAB法提取抗性植株叶片DNA, 以P1和P2 为特异引
物进行 PCR扩增。引物设计: 根据融合基因内部序列
设计1对特异引物P1和P2, 其序列如下: 上游引物P1:
5-GGCGATTTGCAGGTGTTG- GC-3; 下游引物P2: 5-
CGGGAATCTCAATGTT-AGAAGC-3。
PCR反应程序为: 94°C变性5分钟、94°C 45秒、
52°C 45秒、72°C 1分钟、35个循环、72°C 5分
钟。预期的 PCR产物长度为 800 bp左右。PCR扩增
产物用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 转基因植株的 Southern杂交分析
取PCR阳性株、非转化植株和质粒的PCR产物 10°C
进行胶浓度为 1%的琼脂糖凝胶电泳分离, 然后转至
Hybond-N+膜上进行杂交。本实验采用 Bio-Rad公司
的Dig High Prime DNA Labeling and Dection Starter
Kit1试剂盒, 所有操作均按照试剂盒操作指南进行。
1.2.5 RT-PCR检测
取阳性株的幼嫩叶片0.1 g, 用异硫氰酸胍法提取叶片总
RNA。反转录采用TaKaRa公司的Oligo(dT)及逆转录
图 1 融合基因O21-O14-A21-HbcAg植物表达载体结构
Figure 1 Plant expression vector encoding the fused gene
O21-O14-A21-HbcAg
1.2 方法
1.2.1 无菌实生苗的培养
将生菜种子用75%的乙醇表面消毒30秒, 无菌水冲洗
1次; 再用15%的次氯酸钠消毒15-20分钟; 无菌水冲
洗4-6次, 每次1-2分钟; 将消毒过的种子摆放在铺有
2-3层滤纸的灭菌培养瓶中, 25-28°C, 4×10-5 mol.m-2.
s-1, 每天10小时光照条件培养。1-2天后种子萌发, 取
3-5天苗龄的 2片子叶作为实验材料进行遗传转化。
1.2.2 根癌农杆菌介导的叶盘法转化生菜和抗性植
株的筛选
将-20°C冻存的含有重组质粒pCAMBIA1301-O21-O14
-A2-HbcAg 1的农杆菌EHA105在LB/ Km 的平板上划
线, 28°C 过夜培养, 挑取单菌落于 LB 液体培养基,
28°C, 5×g振荡培养至菌液浓度为OD600约1.0, 1 503×g
离心 5分钟收集菌体, 用 1/2 MS液体培养基洗涤 2次,
重悬于1/2 MS液体培养基中使该菌体稀释至OD600为
611邓小莉等: 口蹄疫抗原决定簇融合基因转化生菜及表达
酶 AMV-RTase, 反转录出mRNA的 cDNA第一链, 然
后以此为模板, 进行 PCR扩增反应。反应体系和反应
条件与 1.2.3节中的 PCR扩增分析相同。
2 结果与分析
2.1 结果
2.1.1 抗性植株的获得及 PCR 鉴定
以无菌苗子叶为外植体, 其中, 对照子叶外植体在无潮霉
素的S2培养基中再生率可达90%, 经农杆菌侵染处理的
外植体在含潮霉素的S2培养基中出芽比对照稍迟, 且每
块外植体上的芽数也少于对照。在 5-40 mg.L-1潮霉
素浓度敏感性实验中, 芽的再生率随潮霉素浓度提高而
降低, 达到30 mg.L-1后芽再生困难。当潮霉素浓度为
20 mg.L-1时, 出芽多, 芽长势最好(邓小莉和李慧,
2006)。经抗性筛选和诱导生根, 共获得 66株抗性植
株。取幼嫩的抗性植株叶片提取 DNA 做PCR检测, 抗
性植株扩增出长度约为540 bp清晰的预期条带(图2)。
本实验中共检测到转基因阳性植株 28 株, 转化率为
50%, 初步说明目的基因已整合到生菜基因组中。
2.1.2 目的基因在生菜基因组中的整合
将 PCR产物转膜, 进行 Southern杂交, 转化植株与质
粒为模板的PCR产物均与探针特异性结合, 显示一致的
条带, 说明目的基因已经整合到转化植株的基因组中, 同
时也证实了PCR检测阳性结果的正确性。图3为PCR
产物的 Southern杂交结果。
2.1.3 RT-PCR检测
为了进一步证明O21-O14-A21-HBcAg基因在转基因植株
中的转录表达情况, 取3株阳性植株提取基因组总RNA,
用DNase I消化DNA, 再通过逆转录反应合成cDNA, 进
行RT-PCR检测(图4)。结果显示3株都能够扩增出540
bp 左右的条带, 与 Southern杂交结果一致, 初步表明
目的基因在转录水平上进行了表达。
2.2 分析
选择编码强免疫原性的抗原决定簇基因是保证疫苗成功
图 2 转基因生菜的 PCR检测
M: DNA分子量标准; 1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3-6: 转基因植株
Figure 2 PCR analysis of transgenic lettuce plants
M: DNA ladder marker; 1: positive control; 2: negative control;
3-6: transgenic lettuce
图 3 PCR产物的 Southern杂交
1: 质粒 pCAMBIA1301-O21-O14-A21 PCR产物; 2: 阴性对照; 3-6:
转基因植株叶片 DNA的 PCR产物
Figure 3 Southern blotting analysis of transgenic lettuce
plants
1: plasmid pCAMBIA1301-O21-O14 -A21; 2: negative control;
3-6: transgenic lettuce
图 4 转基因生菜总RNA的RT-PCR检测
1: 未转化植株; 2-4: 转化植株; M: DNA分子量标准
Figure 4 RT-PCR analysis of transgenic lettuce plants
1: non-transgenic lettuce; 2-4: transgenic lettuce; M: DNA lad-
der marker
612 植物学通报 24(5) 2007
的前提。同时, 利用转基因植物生产口服疫苗具有其独
特的优势——植物细胞壁的耐胃肠降解性。这是由于
植物细胞外面包裹着由纤维素和糖类组成的厚厚的不易
被蛋白酶消化的细胞壁, 可以保护疫苗抗原免受或至少
部分免受胃肠道内环境的降解, 从而使利用转基因植物
来生产口服疫苗成为可能, 特别是可生食水果和蔬菜更
能满足口服疫苗的要求和标准(Tacket and Mason,
1999)。转基因植物生产口服疫苗生产成本低、使用方
便、安全, 特别是大范围给药时优点更明显。生菜可
以生食, 为廉价生产可食疫苗提供了一条新途径。通过
将口蹄疫抗原决定簇融合基因转化生菜, 经PCR 检测、
Southern杂交和RT-PCR检测可知, 口蹄疫抗原决定簇
融合基因已经在生菜基因组中得到整合并初步验证在转
录水平上可以表达。通过阳性株的无性繁殖可以扩大
阳性植株的数量。
以转基因生菜来生产口服疫苗, 其关键是目标基因
稳定整合进入生菜基因组, 进而表达出功能性蛋白质。
本研究选用易于生食的生菜作为受体系统, 通过叶盘侵
染转化法进行口蹄疫抗原决定簇融合基因O21-O14 -A21-
HbcAg的转化研究, 获得了转基因再生植株, 并对转基
因再生植株进行了分子生物学分析。我们的实验表明,
O21-O14 -A21 融合基因可以在生菜中整合并表达。研究
已经取得了第一步的结果, 今后的研究重点将转入融合
基因表达的调控和目标蛋白质的功能分析。
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613邓小莉等: 口蹄疫抗原决定簇融合基因转化生菜及表达
(责任编辑: 孙冬花)
Transformation and Expression of FMD Antigenic-determinant
Fused Gene in Lactuca sativa var. capatata
Xiaoli Deng 1*, Jingling Chang 2
1Laboratory of Molecular Biology, PingYuan University, Xinxiang 453003, China
2Key Laboratory of Applied Molecular Biology, Department of Biology Engineering, Henan Science-
Technical College, Xinxiang 453003, China
Abstract The FMD antigenic-determinant fused gene (O21-O14 -A21-HbcAg) was introduced into lettuce (Lactuca sativa var.
capatata) by co-culturing excised cotyledon explants with Agrobacterium tumefaciens. The best transformation efficiency was
obtained on co-culture with the selective medium S2 (MS + 1.5 mg.L-1 6-BA + 0.2 mg.L-1 IAA + 500 mg.L-1 Cb) containing 20 mg.
L-1 hygromycin. Roots were induced on S3 (1/2 MS + 20 mg.L-1 Hyg). Integration of FMD antigenic-determinant fused gene O21-O14
-A21-HBcAg into the genome of lettuce plants was confirmed by PCR and Southern blotting analysis. Expression of the fused gene
at the transcriptional level was shown by RT-PCR.
Key words Agrobacterium tumefaciens, FMDV antigenic determinant, gene expression, Lactuca sativa var. capatata
Deng XL, Chang JL (2007). Transformation and expression of FMD antigenic-determinant fused gene in Lactuca sativa var. capatata.
Chin Bull Bot 24, 609-613.
* Author for correspondence. E-mail: xldeng207@126.com
《遗传学报》和《遗传》杂志
《遗传学报》、《遗传》杂志是中国遗传学会和中国科学院遗传与发育生物学研究所主办、科学出版社出版的核心
期刊, 已被美国化学文摘(CA)、生物学数据库(BIOSIS)、生物学文摘(BA)、医学索引(Medical Index)、俄罗斯文摘杂志
(AJ)以及 NCBI、CABI 等 20 多种国内外重要检索系统与数据库收录。刊登内容包括遗传学、发育生物学、基因组学、
细胞生物学以及分子进化。读者对象为基础医学、农林牧渔、生命科学领域的科研与教学人员、研究生、大学生、中
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