全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (4): 497-505, w w w .chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.04.012
收稿日期 : 2008-04-28; 接受日期 : 2008-08-26
基金项目 : 国家自然科学基金 (No.30571472, No.30730077)、国家林业局 948项目(No.2007-4-01)和新世纪优秀人才支持计划
(No. NCET-07-0083)
*通讯作者。E-mail: yinw l@bjfu.edu.cn; x iax l@bjf u.edu.cn
.专题论坛.
转基因植物中标记基因研究概况
李俊 1 , 刘翠琼 2 , 尹伟伦 1*, 夏新莉1 *
1北京林业大学生物科学与技术学院, 北京 100083; 2北京林业大学研究生院 , 北京 100083
摘要 标记基因在植物基因工程中具有重要的作用。它在遗传转化中的关键作用是区分转化和非转化的细胞, 以筛选并鉴
定出转化的细胞、组织和转基因植株。目前, 已报道的标记基因种类很多, 划分标准也各不相同。出于对生态环境和转基因
食品的生物安全性考虑, 从传统的选择标记基因、与激素代谢相关的基因、与氨基酸代谢相关的基因、与糖类代谢相关的基
因、能解除化合物毒性(或胁迫)的基因、编码能产生特定荧光物质的蛋白酶类的基因、利用颜色差异性筛选转化体的相关基
因及抗性标记基因的敲除技术八个不同的方面, 综述了标记基因的种类、作用原理、应用价值及存在的问题。在标记基因的
综合应用方面, 详细总结了标记基因与组织(或器官)特异性启动子和MAT载体系统的结合应用, 以及b-葡萄糖苷酸酶作为多功
能标记基因的综合应用。最后, 对标记基因的发展前景进行了探讨分析。
关键词 生物安全性标记基因 , 转基因植物, 传统的选择标记基因
李俊 , 刘翠琼 , 尹伟伦 , 夏新莉 (2009). 转基因植物中标记基因研究概况 . 植物学报 44, 497-505.
植物的遗传转化研究主要是将具有优良性状的
外源目的基因导入植物基因组中, 通过标记基因筛选
出真正含有目的基因片段的转化体并使其完整再生 ,
从而获得遗传性状改良的转化植株。其中标记基因
在遗传转化中的关键作用是区分转化和非转化细胞 ,
以筛选和鉴定出转化的细胞、组织和转基因植株。目
前已报道的标记基因种类很多, 划分标准也各有不
同。依据筛选方法不同可分为选择基因 (s elec t i ve
gene)和报告基因(reporter gene)。前者通常指抗生素
和除草剂抗性基因 , 而报告基因有荧光素酶基因
(LUC)、葡萄糖苷酸酶基因(GUS )和绿色荧光蛋白基
因(GFP )等。有些基因则具有报告和选择双重功能,
如新霉素磷酸转移酶基因(NPTII); 甚至有些标记基因
本身就是目的基因 , 如草丁膦乙酰转移酶基因(Bar)。
依据非转化细胞在选择培养基上的生长状况, 可分为
正选择 (pos i t i ve s e l ec t i on )和负选择 (nega t i ve
select ion)两种选择体系。抗生素抗性基因、抗除草
剂抗性基因和能解除化合物毒性(或胁迫)的基因均属
于负选择体系 , 其余的如激素代谢基因、糖类代谢基
因和能产生特定荧光物质的蛋白酶类基因等属于正
选择体系。出于对生态环境和转基因食品的生物安
全性考虑 , 标记基因可分为传统的选择标记基因
(t raditional selective marker gene)和生物安全性标记
基因(biosafety marker gene)。近年来, 随着越来越多
的转基因植物田间实验的开展和转基因产品在市场
中的逐步投放, 使得转基因生物安全性问题成为社会
关注的焦点, 也引起了相关科学工作者的高度重视,
因此开展生物安全性标记基因的研究必然会成为一
种潮流。
1 传统的选择标记基因
选择标记基因是在选择压力下将转化体筛选出来。
目前传统的选择标记基因主要有两大类: 一类为抗生
素类标记基因 , 此类基因可以使抗生素失去活性 , 从
而解除抗生素对转化细胞在转录和翻译过程中的抑
制作用, 使转化细胞得以继续生长 , 例如新霉素磷酸
转移酶(neomycin phosphotransferase, NPTII)基因、
498 植物学报 44(4) 2009
链霉素磷酸转移酶(streptomycin phosphotransferase,
SPT)基因和潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phospho-
transferase, HPT)基因等。其中卡那霉素抗性(Kanr)
基因是转基因植物中广泛使用的一类标记基因, 但因
卡那霉素(kanamycin)选择剂对一些植物的发育存在
严重的副作用或因植物对其有较高的天然抗性等原
因而导致其选择效率低下(Mullins et al., 1990; Nehra
et al. , 1994)。另一类为抗除草剂类标记基因 , 其产
物能抵抗除草剂的杀灭作用, 使转化子从野生背景中
富集出来, 例如草丁膦乙酰转移酶(phosphinothricin
acety ltransferase, PAT)基因、 2,4-D单氧化酶(2,4-D
monooxygenase, t fdA)基因和 5-烯醇丙酮酰莽草酸 -
3-磷酸合成酶(5-enolpyruvy l shik imate-3-phosphate
synthase, EPSPS)基因等。但有报道表明 , 将转入抗
除草剂类标记基因的植物释放后, 可能会导致环境中
除草剂施用量达到选择浓度 , 进而发生基因漂流、生
态平衡破坏和自然生物种群发生改变等一系列生物
安全性问题(Jaiwal et al., 2002)。总之, 这两类标记
基因均存在着潜在的生物安全性问题。
2 生物安全性标记基因
2.1 与激素代谢相关的基因
在离体条件下 , 植物体的培养需要加入外源激素。若
将激素代谢相关基因转入植物体内, 转化细胞则能自
己合成激素, 这样转化植株就能在不添加外源激素的
培养基中继续正常生长, 从而使转化体与非转化体形
成一定的表型差异 , 达到筛选出转化植株的目的 ; 并
且已有研究表明, 其选择效果优于某些抗生素抗性基
因(Joersbo, 2001)。这种类型的标记基因主要有异戊
烯基转移酶 (i sopen teny l t rans ferase , IPT)基因
(Ebinuma et al., 1997)(催化异戊烯基磷酸和单磷酸
腺苷缩合成异戊烯腺苷酸(细胞分裂素类物质), 利于
植物细胞的再生)、吲哚乙酰胺水解酶 (indole-3-ac-
e tami de hy drol as e, i aaH)基因(Eb i numa and
Komamine, 2001)(可以将色氨酸(t ryptophan)转化为
吲哚乙酸(indole acetic acid, IAA), IAA 可以促进器
官的发生)和 b-葡萄糖苷酸酶(b-glucuronidase, GUS)
基因(Okkels et al., 1997)(能水解葡萄糖苷酸(glucur-
onide), 释放出激动素(k inet in, KT), 从而促进转化细
胞的生长)。但这些选择标记基因通常会产生激素
过量的副作用 , 形成瘤状组织 , 使转化体难以再生出
形态正常的植株, 所以最终均会被敲除或使其功能
失活。
2.2 与氨基酸代谢相关的基因
某些支链氨基酸的合成需要经过天冬氨酸合成途径。
Jaiwal等(2002)认同合成支链氨基酸、赖氨酸、苏氨
酸、甲硫氨酸和异亮氨酸的天冬氨酸代谢途径中的
酶可用做选择标记这一结论。其中天门冬氨酸激酶
(aspart -okinase, AK)和二氢吡啶二羧酸合酶(dihydro-
dipicolinate synthase, DHPS)能够催化赖氨酸的合
成, 但另一方面微量(毫摩尔级)的赖氨酸也会对这 2
种酶产生反馈抑制作用 , 限制赖氨酸的积累 , 最终耗
尽甲硫氨酸而使细胞死亡(Mil ls et al., 1980)。随后,
Perl等(1992)发现来源于大肠杆菌(Escherichia coli)
的这2种酶对赖氨酸不敏感 , 可作为植物转化研究中
的筛选标记, 使生长在含有赖氨酸培养基中的转基因
植株能够存活 , 而非转基因植株则被淘汰。这一研究
为获得真正的遗传转化体提供了有利的选择依据, 进
而加速了基因转化研究的筛选进程。
2.3 与糖类代谢相关的基因
在离体条件下 , 植物生长属于异养型, 不能进行光合
作用, 必须在培养基中添加一定浓度的糖类才能够保
证植物体的正常生长; 所以根据植物细胞对不同糖类
碳源的代谢能力, 发展的利用糖类作为筛选剂的筛选
系统, 具有良好的发展前景。与糖类代谢相关基因的
编码产物是某种糖类的分解代谢酶, 转入这种基因的
细胞就能够利用筛选剂(糖类)作为主要碳源 , 在筛选
培养基上进行转化与非转化细胞的筛选(Joersbo and
Okkels , 1996)。因为只有转化细胞才能够在含有筛
选介质的培养基上呈现优势生长, 而非转化细胞由于
不能够分解代谢糖类而遭遇碳饥饿, 虽不死亡但其生
499李俊等: 转基因植物中标记基因研究概况
长受抑制, 势必遭遇淘汰, 最终达到高效选择的目的。
与糖类代谢相关的标记基因主要有木糖异构酶 (xyl-
ose isomerase, xy lA)基因(Haldrup et al. , 1998)(能够
催化木糖(xylose)转变成木酮糖(xylulose), 再经过磷
酸戊糖途径分解代谢, 为细胞生长所利用)、磷酸甘
露糖异构酶(phosphomannose isomerase, PMI)基因
(Weisser et al., 1996)(能够将甘露糖转化为易代谢的
6-磷酸果糖(fruc tose-6-phosphate, F-6-P), 避免了 6-
磷酸甘露糖(mannose-6-phosphate, M-6-P)的大量积
累, 产生ATP, 为细胞正常生长提供能量)和参与糖类
代谢的核糖醇操纵子(ribitol operon)at l和rt l(Lafayet te
and Parrott , 2001)(来自大肠杆菌 C菌株, 能够分解
代谢核糖醇(adonitol))。它们均在植物转基因工程研
究中得到了良好应用, 且筛选效果显著(Haldrup et al.,
1998; Li et al., 2007)。但在使用以糖类作为筛选剂
的选择体系时 , 应考虑在筛选培养基中依植物种类
不同需同时加入几种不同类型的碳源这一特殊要求 ,
以确保转化体的正常生长 , 并且所需糖类的浓度配
比也需做进一步优化。因此, 该选择体系在植物转
基因工程中的全面推广应用还需要从多个方面加以
完善。
2.4 解除化合物毒性(或胁迫)的基因
化合物解毒酶可以催化对细胞生长有毒(或胁迫)的化
合物转变成无毒(或胁迫)的化合物, 即催化筛选介质
从一种有毒(或胁迫)的物质转变为一种无毒(或胁迫)
且能够被转化植株利用的物质, 使只有转化的细胞才
能够在有毒(或胁迫)的化合物培养基上正常生长 , 而
非转化细胞则最终被杀死。这类标记基因的发展多
与对逆境的改进(或消除)有关, 如今恶劣的生态环境
亟须改善, 其发展必然越来越受到重视。与此相关的
基因主要包括甜菜碱醛脱氢酶(beta ine aldehy de
dehydrogenase, BADH)基因 (Daniel l et al., 2001)(能
够催化有毒的甜菜碱醛(betaine aldehyde, BA)转变成
无毒的渗透调节物质甜菜碱 (glyc inebetaine, GA))、
有机汞裂解酶(organomercurial lyses, merB)基因和
汞离子还原酶(mercurius reducase, merA)基因(Rugh
et al. , 1996; Bizi ly et al., 1999)(可将高毒性的甲基
汞转化为比其毒性低的二价离子汞和甲烷, 继而还原
为金属汞, 达到降低毒性的目的)、谷氨酸 -1-半醛转
氨酶(glutamate-1-semialdehyde- aminotransferase,
GSA-AT)基因(Gough et al., 2001)(能够催化谷氨酸 -
1-半醛(glutamate-1-semialdehyde)转化成δ -氨基 -
〥-酮戊酸(amino lavulinic acid, ALA), 保障叶绿素生
物合成的正常进行)。这些基因均在不同的实验中被
初步验证了作为筛选标记的可行性, 显示了其广阔的
应用前景。然而, 迄今为止关于甜菜碱醛脱氢酶基因
与谷氨酸-1-半醛转氨酶基因作为选择标记的成功报
道均来自叶绿体基因组的遗传转化研究; 而叶绿体的
遗传转化体系目前尚不成熟, 这势必会成为进行植物
转化研究的限制因素。所以, 考虑通过多种途径将这
2种基因转入植物体内必将会更全面且更充分地体
现它们的价值。
2.5 能够产生特定荧光物质的蛋白酶类基因
在植物基因转化研究中, 可以通过检测植株是否有特
定荧光物质产生, 来区分转化体与非转化体。目前,
能用在这种检测转化体方法上的标记基因主要有两
类: 其催化产物具有光学性质的酶类和自身具有光学
活性的非酶蛋白类, 即荧光素酶(luciferase, LUC)基
因(Leeuwen et al., 2000)(该基因需要催化特定底物
氧化才能够发出荧光, 并且其催化的发光反应能够用
生物发光检测仪进行灵敏和快速地检测, 可被广泛应
用于报告基因的分析研究)、b- 葡萄糖醛酸苷酶 (b-
glucuronidase, GUS)基因(Murray et al., 2004)(能够
水解b-葡萄糖醛酸苷的带有光学活性基因的衍生物 ,
以 4-甲基伞形酮 -D-葡萄糖醛酸苷(4-methylumbell i-
ferone-D-glucuronide, 4-MUG)为底物, 产生的4-甲基
伞形酮(4-methy lumbelliferone, 4-MUB)具有荧光, 其
检测灵敏度达 fmol级)和绿色荧光蛋白(green fluores-
cent protein, GFP)基因(Pérez-Clemente et al. , 2005)
(从维多利亚水母(Aequorea vic toria)中分离纯化, 在
荧光酶的参与下被 Ca2+激活, 蛋白质的共价键发生
一定的变化从而形成不稳定的中间体, 中间体分解
500 植物学报 44(4) 2009
后, 释放能量产生荧光 , 而且GFP生色基团的形成无
种属特异性, 在原核和真核细胞中均能表达 , 其表达
产物对细胞基本上没有毒害作用, 不影响细胞的正常
生长和功能, 能用于动、植物的多重转化研究)。虽
然它们的作用机理不同, 但均属于通过观察转化受体
是否发出特定荧光来检测转化基因的表达情况, 具有
相同的判断标准。其中, GFP 作为标记基因的应用
则更简便, 无需任何外源底物(或辅助因子)、不需使
用同位素且不需要测定酶的活性, 可直接通过活体检
测筛选出转化体 , 因此, GFP已被成功地转入多种植
物体内(Jordan, 2000; Slater et al., 2001), 而且 GFP
在生态检测研究中还具有重要的应用价值(沈宝成等,
2007)。但由于GFP对细胞几乎没有毒副作用 , 不影
响细胞的正常生长和功能, 致使转化细胞不具有生长
优势, 所以周围的非转化细胞的生长经常超过转化细
胞, 以致很难分离出纯的转化细胞 (Hraska et al. ,
2006)。这种无毒副作用的特点 , 既是GFP的优点也
是其缺陷, 所以恰当地判断出检测转化体的观察临界
时期非常重要。
2.6 利用颜色差异性筛选转化体的相关基因
在植物遗传转化研究中, 通过直接观察转化受体及其
细胞的颜色特征来判断转化子是一种非常直观且简
便的筛选手段。各种植物均具有在体内不停地进行
复杂的花色素苷合成的功能, 而花色素苷生物合成调
节基因(anthocyanin biosynthes is s timulatory gene)
则是其中的一个关键因子, 其编码的蛋白是花色素苷
合成酶转录过程中的一个激活因子, 能够在组织内促
进花色素苷的生物合成, 而花色素苷基因能够在植物
的不同器官和组织中表达, 致使细胞中产生红色素
(Holton and Cornish, 1995)。所以, 在基因转化过程
中, 若将这种调节基因转入植物体内 , 则会使细胞变
成红色, 用一般的解剖镜甚至肉眼就可以观测到转化
结果, 无需因进行组织化学检测而杀死植物组织 , 是
一种不需要任何生色底物的活体显色(包满珠, 1997)。
目前, 能作为筛选标记使用的调节因子主要有C1/Lc
(McCormac et al., 1998)和 C1-R(Klein et al., 1989)。
通过基因枪(或农杆菌介导)的转化方法可以使转化体
的不同器官(或组织)显示红色, 以表明转化体与非转
化体的差别。这些基因已被应用到植物遗传转化研
究中, 其中对单子叶植物的研究较多 , 双子叶植物方
面也有一些成功的报道 (Lloyd et al. , 1992; Quat tro-
cchio et al., 1993)。但此种筛选方法也存在不足之
处, 不能避免基因枪法转化植株所带来的整合基因组
后稳定性遗传的几率较低的现象发生。
2.7 抗性标记基因的敲除技术
在基因转化研究中, 抗性标记基因的敲除是指使转基
因植物只含有目的基因, 而不具有标记基因或其它辅
助序列 , 这是近年来无抗性标记基因研究的热点
(Natarajan and Turna, 2007)。这种基因敲除技术
(knocking-out technique)有利于对同一个植物品种进
行多次转基因操作 , 以实现多次转化 ; 同时可消除公
众对选择标记基因生物安全性潜在危害的忧虑。目
前, 比较有效的标记基因敲除技术体系主要有: 共转
化系统(co-transformation system)(Zhao et al. , 2007)、
位点特异性重组系统(s ite-spec ific recombinat ion
system)(Grfnlund et al. , 2007)、染色体内同源重组
体系(int rachromal homologous recombination sys tem)
(Zubko et al., 2000)和转座子介导的再定位系统(tran-
sposon-mediated reposit ioning system)(Darbani et al.,
2007)4种, 并且这些敲除体系最终均能够使转化体不
携带任何标记基因而只含有所需的目的基因片段, 成
为真正意义上的无标记基因的转基因植物。依据作
用原理不同, 这些敲除技术可划分为分离敲除与重组
敲除两类; 共转化系统属于第 1类, 其余 3种则属于
第 2类(吕慧涓和龚祖埙 , 2004)。但这几种体系均存
在转化工作量大、耗时长和体系发展不成熟的缺陷
(Ebinuma et al., 2001; de Vet ten et al., 2003; Cuellar
et al., 2006); 且共转化法只能用于有性繁殖的植物
以实现遗传分离 , 延长了育种时间 , 不适合世代交替
时间长的植物物种(如木本植物类)。
501李俊等: 转基因植物中标记基因研究概况
3 标记基因的综合应用
3.1 与组织或器官特异性启动子的结合应用
选择标记基因的组织特异性表达是利用组织或器官
特异性表达的启动子(tissue/organ-specific promoter)
来控制选择标记, 使标记基因只能在转基因植物某个
特定生长期的组织或器官中表达, 并表现出发育调节
的特性。用从石刁柏(Asparagus officinalis)中分离的
创伤诱导表达的启动子AoPR1所进行的植物转化研
究报道就是一个成功的例子(Özcan et al., 1993), 为
转基因植物生物安全性的提高作出了一定的贡献。
然而, 此种方法只能解除标记基因表达产物的影响,
即降低标记基因在转化体中所有部位和所有发育阶
段的持续、高效的表达几率 , 减少能量的消耗 , 但筛
选标记并未被真正消除, 而且也不能用同一选择标记
系统进行再次转化(董文琦等, 2004)。这些问题的存
在影响了该类标记基因的广泛应用。
3.2 与MAT载体系统的结合应用
在转基因研究中 , 与激素代谢相关的标记基因, 如
IPT和 ROL的过量表达均会引起植物不定根的增加 ,
使转化植株出现畸形 , 从而产生表型差异。MAT载体
系统(multi-auto-transformat ion vector system, MAT)
就是利用 IPT或 ROL所产生的形态学上的差异而将
其作为选择标记构建 2种载体, 即 IPT型MAT载体和
ROL型MAT载体; 再通过结合位点特异重组R/RS体
系(Ballester et al. , 2007)或玉米(Zea mays)的转座元
件(Cui et al., 2000)敲除插入载体的标记基因 , 获得
无筛选标记的转基因植株(Zelasco et al., 2007)。 MAT
载体系统使多次转化变为可能, 且不需要进行有性杂
交, 转化当代就能够获得无标记基因的转化体, 大大
缩减了时间, 特别适用于林木等生育期长或以营养器
官作为繁殖手段的遗传转化研究。
3.3 b-葡萄糖苷酸酶作为标记基因的综合应用
b-葡萄糖苷酸酶(b-glucuronidase, GUS)是从大肠杆
菌中分离出的一种非常稳定的酶 , GUS 活性检测的
灵敏性高且操作简单 , 对植物体也没有任何伤害 , 因
此GUS基因是转基因研究中最常用且安全性很高的
一种标记基因。它的水解底物主要有 3类, 即对硝基
苯基 -b-D- 葡萄糖醛酸苷 (p -n i - t ro phe ny l -b-D-
glucuronide, p-NPG)、4-甲基伞形酮酰 -b-D-葡萄糖
醛酸苷(4-methylumbelli fery l-b-D-glucuronide, 4-MUG)
和 5-溴 -4-氯 -3-吲哚 -b-D-葡萄糖醛酸苷(5-bromo-4-
chloro-3-indoyl-b-D-glucuronide, X-Gluc), 其相应的表
达产物可用分光光度定量分析、荧光定量分析和组
织化学定位分析 ; 多种分析方法使 GUS作为标记基
因在遗传转化研究中得到了广泛应用, 而且表现出比
抗生素抗性标记更高的筛选优势 ( J oe rs bo a nd
Okkels, 1996)。但该基因的背景表达可能来自组织
中类似 GUS物质的活性, 也可能来自残余农杆菌中
GUS基因的表达, 从而影响了对真正转化体的辨别 ,
并且随着组织的衰老, 其表达量也会逐渐减少。因
此, 在进行转基因植物GUS活性检测时, 可以通过添
加 20%的甲醇来抑制内源的 GUS活性, 这还有利于
提高测定体系的稳定性(Kosugi et al. , 1990)。Vanc-
anneyt 等(1990)根据真核生物具有原核生物不具有
的内含子剪切特性的原理, 向 GUS基因中引入了一
段植物内含子 , 结果在农杆菌中没有检测到明显的
GUS活性, 从而表明含有内含子的 GUS基因能够更
加有效地筛选转化体。
4 研究展望
标记基因在植物遗传转化工程中发挥着重要的作用 ,
为获得真正的转入优良性状基因的转化体提供了有
利的判断依据。因此, 标记基因的发展成为基因工程
的研究热点。目前已报道的标记基因种类很多 , 其优
势及局限性也各不相同。因此在遗传转化工作中 , 应
根据具体要求 , 选择合适的标记基因, 以达到事半功
倍的效果。
目前, 传统的抗性标记基因仍被广泛地应用于转
基因研究中, 其成熟的技术体系和广泛的适用性 , 使
得转化工作能够更加顺利地开展 (Ramessar et al. ,
502 植物学报 44(4) 2009
2007)。但存在的抗生素敏感性、除草剂的大量使用
以及抗性标记基因潜在的生态环境和食用安全性等
问题, 已成为社会关注的焦点(Zubko et al., 2000); 而
且转基因植株一旦能够成功再生, 标记基因便不再有
用, 甚至可能有害(Puchta, 2000)。因此, 对生物安全
性标记基因的研究显得非常重要。生物安全性标记
基因的优点主要在于选择剂的无毒副作用, 且在多数
情况下有利于转化植株的再生, 从而提高了转化效
率。另外, 本文所列举的几类生物安全性标记基因多
数已作为目的基因在遗传转化研究中被广泛研究和
应用, 甚至已获得水果、蔬菜和粮食作物等可食用性
转基因产品(贾庚祥等, 2002)。这不仅可以缓解目前
的生物安全性潜在危害问题, 同时还有可能达到标记
基因与目的基因兼用的功效。然而, 标记基因的存在
始终不利于多重转化, 也无法将多个优良性状累积在
转化体内; 特别是现在, 抗逆性转基因植物的研究备
受关注, 这使得多抗基因的转入成为迫切需求。所
以, 标记基因敲除技术为此提供了一个很好的解决方
案, 能够完全有效地消除转基因植物中存在的标记基
因, 省去了对标记基因及其产物的安全性评价工作,
并进一步保证细胞能够正常生长、发育和分化; 而且
还避免(或减少)了因与标记基因使用同一个启动子而
影响目的基因正常表达等的发生, 也有利于进行多种
性状的组合。在实际操作中 , 无选择标记的技术体系
作为一种新兴事物 , 难免会有其不足之处 , 需要进一
步完善, 但其发展前景广阔。总之, 培育具有生物安
全性标记基因(或无选择标记基因)的转基因植株是未
来植物转基因工作的重要发展方向, 也是确保转基因
技术安全应用的有效手段。
参考文献
包满珠 (1997). 植物花青素基因的克隆及应用 . 园艺学报 24,
279-284.
董文琦 , 屈冬玉 , 王海波 (2004). 消除转基因植物中选择标记
的研究进展 . 中国生态农业学报 12, 29-34.
贾庚祥 , 朱至清 , 李银心 (2002). 甜菜碱与植物耐盐基因工程 .
植物学通报 19, 272-279.
吕慧涓 , 龚祖埙 (2004) . 转基因植物中标记基因的剔除 . 植物
生理与分子生物学学报 30, 121-126.
沈宝成 , 李梅 , 石纪成 , 张木清 , 米湘成 , 魏伟 (2007). 绿色荧
光蛋白及其在 GMOs 生态监测中的应用. 植物学通报 24,
134-140.
Balle ster A, Cervera M , Peña L (2007). Eff icient production of
transgenic citrus plants using isopenteny l transferase posi-
tive selection and removal of the marker gene by site-specif ic
recombination. Plant Cell Rep 26, 39-45.
Bizily SP, Rugh CL, Sum me rs AO, Me aghe r RB (1999) .
Phy toremediation of methy lmercury pollution; merB expres-
sion in Arabidopsis thaliana confers resistance to organomer-
curials. Proc Natl Acad Sc i USA 96, 6808-6813.
Cue llar W, Gaudin A, Solór zano D, Casas A, Nopo L,
Chudalayandi P, Medrano G, Kreuze J, Ghislain M (2006).
Self-excision of the antibiotic resis tance gene NPTII us ing a
heat inducible Cre-loxP system from transgenic potato. Plant
Mol Biol 62, 71-82.
Cui M L, Takayanagi K, Kam ada H, Nishimura S, Handa T
(2000). Transf ormation of Antir rhinum majus L. by a rol- type
multi-auto-transformation (MAT) vector system. Plant Sci 159,
273-280.
Daniell H, Muthukumar B, Lee SB (2001). Marker free transgenic
plants: engineering the chloroplast genome w ithout the use of
antibiotic selection. Curr Genet 39, 109-116.
Darbani B, Eimanifar A, Stewart Jr CN, Camargo WN (2007).
Methods to produce marker-free transgenic plants. Biotechnol
J 2, 83-90.
de Vetten N, Wolter s AM , Raemak ers K, van der M eer I,
Stege RT, Heere s E, Heere s P, Visse r R (2003). A trans-
formation method for obtaining marker-free plants of a c ross-
pollinating and vegetatively propagated crop. Nat Biotechnol
21, 439-442.
Ebinuma H, Sugita K, Matsunaga E, Yam akado M (1997).
Selection of marker-free transgenic plants using the isopenteny
trans ferase gene. Proc Natl Acad Sci USA 94, 2117-2121.
Ebinum a H, Kom am ine A (200 1) . MA T (Mult i-A uto-
503李俊等: 转基因植物中标记基因研究概况
Trans f ormation) vec tor s ys tem. The oncogenes of
Agrobacteri um as positive markers for regeneration and se-
lection of marker-free transgenic plants. In Vitro Cell Dev Biol
Plant 37, 103-113.
Ebinuma H, Sugita K, M atsunaga E, Yamada EK, Kom amine
A (2001). Systems for the removal of a selection marker and
their combination w ith a positive marker . Plant Cell Rep 20,
383-392.
Gough KC, Haw es WS, Kilpatrick J, Whitelam GC (2001).
Cyanobacter ial GR6 glutamate-1-semialdehyde aminotrans-
ferase: a novel enzyme-based selec table marker for plant
trans formation. Plant Cell Rep 20, 296-300.
Grfnlund JT, Stem mer C, Lichota J, Merkle T, Grasse r K
(2007). Functionality of the b /six site-specif ic recombination
sys tem in tobacco and Arabidopsis: a novel tool for genetic
engineering of plant genomes . Pl ant Mol Bi ol 63, 545-
556.
Haldrup A, Petersen SG, Ok kels FT (1998). Positive selection:
plant selection principle based on xy lose isomerase, an en-
zyme used in the food industry. Plant Cell Rep 18, 76-81.
Haldr up A, Pe te rs e n SG, Ok ke ls FT (1998). The xylose
isomerase gene f rom Thermoanaerobacter ium thermosulfur-
ogenes allow s eff ective selection of transgenic plant cells
using D-xylose as the selection agent. Plant Mol Biol 37, 287-
296.
Holton TA, Cor nish EC (1995) . Genetics and biochemistry of
anthocyanin biosynthes is. Plant Cell 7, 1071-1083.
Hr ask a M , Rakousky S, Curn V (2006) . Green f luorescent
protein as a vital marker for non-destructive detection of trans-
formation events in transgenic plants. Pl ant Cell Ti ssue Or-
gan Cult 86, 303-318.
Jaiwal PK, Sahoo L, Singh ND, Singh RP (2002). Strategies to
deal w ith the concern about marker genes in transgenic plants:
some environment-f riendly approaches. Curr Sc i 83, 128-
136.
Joersbo M (2001). Advances in the selection of transgenic plants
using non-antibiotic marker genes . Physiol Plant 111, 269-
272.
Joersbo M, Okkels FT (1996). A novel principle for selection of
transgenic plant cells: positive selection. Plant Cell Rep 16,
219-221.
Jordan MC (2000). Green f luorescent protein as a visual marker
for w heat transformation. Plant Cell Rep 19, 1069-1075.
Klein TM , Roth BA, Fromm ME (1989). Regulation of anthocya-
nin biosynthetic genes introduced into intact maize tissues by
microprojectiles. Proc Natl Acad Sc i USA 86, 6681-6685.
Kosugi S, Ohashi Y, Nakajim a K, Arai Y (1990). A n improved
assay for b-glucuronidase in transformed cells: methanol al-
most completely suppresses a putative endogenous b-glucu-
ronidase activity. Plant Sci 70, 133-140.
Lafayette PR, Parr ott WA (2001). A non-antibiotic marker f or
amplif ication of plant trans formation vectors in E. col i. Plant
Cell Rep 20, 338-342.
Leeuw en WV, Hagendoorn MJM, Ruttink T, van Poecke R,
van der Plas LHW, van der Krol AR (2000). The use of the
lucif erase repor ter system for in pl anta gene expression
studies. Plant Mol Biol Rep 18, 143a-143t.
Li HQ, Kang PJ, Li ML, L i MR (2007). Genetic transformation of
Torenia fournieri using the PMI/mannose selection system.
Plant Cell Tissue Organ Cult 90, 103-109.
Lloyd AM , Walbot V, Davis RW (1992). Arabidopsis and Nicoti-
ana anthocyanin production activated by maize regulators R
and C1. Science 258, 1773-1775.
McCorm ac AC, Wu H, Bao M, Wang YB, Xu RJ, Elliott M C,
Chen DF (1998) . The use of v isual marker genes as cell-
specif ic repor ters of Agrobac teri um-mediated T-DNA deliv-
ery to w heat (Tr iticum aestivum L.) and barley (Hordeum
vulgare L.) . Euphytica 99, 17-25.
Mills WR, Lea PJ, Miflin BJ (1980). Photosynthetic formation of
the aspartate family of amino acids in isolated chloroplas ts.
Plant Physiol 65, 1166-1172.
Mullins M G, Tang FCA, Facciot ti D (1990) . Agrob acterium-
mediated genetic transf ormation of grapev ines: transgenic
plants of Vitis rupestr is Scheele and buds of Viti s vinifera L.
Biotechnology (NY) 8, 1041-1045.
Murray F, Br ettell R, Mat thew s P, Bishop D, Jacobsen J
504 植物学报 44(4) 2009
(2004). Comparison of Agrobac terium-mediated transforma-
tion of f our barley cultivars using the GFP and GUS repor ter
genes. Plant Cell Rep 22, 397-402.
Natarajan S, Turna J (2007). Excision of selectable marker genes
f rom transgenic c rops as a concern f or environmental
biosaf ety. J Sci Food Agric 87, 2547-2554.
Ne hr a NS, Chibbar RN, Leung N, Caswe ll K, Mallar d C,
Steinhause r L, Baga M , Kartha KK (1994). Self -f er tile
transgenic w heat plants regenerated from isolated scutellar
tissues follow ing microprojectile bombardment w ith tw o dis-
tinct gene constructs. Plant J 5, 285-297.
Okkels FT, Ward JL, Joersbo M (1997). Synthesis of cytokinin
glucuronides for the selec tion of transgenic plant cells. Phy-
tochemi stry 46, 801-804.
özcan S, Firek S, Draper J (1993). Selec table marker genes
engineered for specif ic expression in target cells for plant
trans formation. Biotechnology (NY) 11, 218-221.
Pére z-Cle mente RM , Pére z-Sanjuán A, Gar cía-Férr iz L ,
Be lt rán JP, Cañas LA (2005). Transgenic peach plants
(Prunus persica L.) produced by genetic transformation of
embryo sec tions using the green f luorescent protein (GFP) as
an in vivo marker. Mol Breed 14, 419-427.
Perl A, Galili S, Shaul O, Ben-Tzvi I, Galili G (1992). Bacter ial
dihydrodipicolinate synthase and desensitized aspar tate
kinase: tw o novel selec table markers for plant transformation.
Biotechnology (NY) 11, 715-718.
Puchta H (2000). Removing selectable marker genes : taking the
shortcut. Trends Plant Sci 5, 273-274.
Quatt rocchio F, Wing JF, Leppen H, Mol J, Koe s RE (1993).
Regulatory genes controlling anthocyanin pigmentation are
functionally conserved among plant species and have distinct
sets of target genes. Plant Cell 5, 1497-1512.
Ram es s ar K, Pe re mar ti A, Góm ez-Gale r a S, Naqvi S,
M or alejo M , Muñoz P, Cape ll T , Chr is tou P (2007) .
Biosafety and risk assessment f ramew ork for selectable
marker genes in transgenic crop plants: a case of the science
not supporting the politics. Transgenic Res 16, 261-280.
Rugh CL, Wilde HD, Stack NM , Thomps on DM, Summe rs
AO, Meagher RB (1996). Mercuric ion reduction and res is-
tance in transgenic Arabidopsis thal iana plants express ing a
modif ied bacterial merA gene. Proc Natl Acad Sc i USA 93,
3182-3187.
Slater A, Zhang CL, Che n DF, McCormac AC, Scott NW,
Elliot t MC (2001). Use of the GFP reporter as a vital marker
for Agrobacterium mediated transformation of sugar beet (Beta
vulgaris L.) . Mol Biotechnol 17, 109-117.
Vancanneyt G, Schmidt R, O’connor-Sanchez A, Willmitzer
L, Rocha-Sos a M (1990). Cons truction of an intron-contain-
ing marker gene: splicing of the intron in transgenic plants and
its use in monitoring early events on Agrobac terium-mediated
plant transformation. Mol Gen Genet 220, 245-250.
Weisser P, Kramer R, Spre nger GA (1996). Expression of the
Escher ichia coli pmi gene, encoding phosphomannose-
isomerase in Zymomonas mob ilis, leads to utilization of man-
nose as a novel grow th substrate, w hich can be used as a
selec tive marker. Appl Environ Microbi ol 62, 4155-4161.
Ze lasco S, Ress egott i V , Confalonier i M, Carboner a D,
Calligari P, Bonadei M, Bisoffi S, Yamada K, Balestrazzi
A (2007) . Evaluation of MAT-vec tor system in w hite poplar
(Populus alba L.) and production of ipt marker-free transgenic
plants by ‘single-step transformation’. Plant Cell Tissue Or-
gan Cult 91, 61-72.
Zhao Y, Qian Q, Wang HZ, Huang DN (2007). Co-transformation
of gene express ion cassettes via particle bombardment to
generate safe transgenic plant w ithout any unw anted DNA. In
Vitro Cell Dev Biol Pl ant 43, 328-334.
Zubko E, Scutt C, Meye r P (2000). Intrachromosomal recombi-
nation betw een attP regions as a tool to remove selectable
marker genes from tobacco transgenes. Biotechnology (NY)
18, 442-445.
505李俊等: 转基因植物中标记基因研究概况
Marker Genes in Transgenic Plant Research
Jun Li 1, Cuiqiong Liu2, Weilun Yin1*, Xinli Xia1*
1 Co lle ge of Bio log y Scie nce an d Tech nol ogy, Beijin g Fore stry University, Beij ing 10 008 3, Chi na
2 Gradu ate Sch ool of Bei jin g Fore stry Un ive rsi ty, Bei jin g 1 000 83, Chi na
Abstr act Marker genes are w idely studied and used in plant genetic engineer ing. To dis tinguish transformed and untrans formed
cells and t issues , this review provides a summary of marker genes in terms of classif ication, w orking principles , application and
problems. Based on biosafety considerations, eight dif ferent aspec ts of marker genes are discussed, including traditional selective
marker genes ; marker genes related to hormone metabolism, amino acid metabolism, and sacchar ide metabolism; proteins w ith
detoxif ying ac tiv ity, as w ell as specif ic f luorescence proteins, and the knock-out technique of antibiotic marker genes. Marker
genes connec ted w ith t is sue- or organ-spec if ic promoters, the multi-auto- transf ormation (MAT) vec tor system and b-glucu-
ronidase as a mult ifunctional marker gene, as w ell as the prospects of marker genes are also discussed.
Ke y words bi osa fety ma rke r g ene , t ransgen ic pla nt, tradit ion al sel ect ive marker ge ne
Li J, Liu CQ, Y in WL, Xia XL (200 9). Marker ge nes in tra nsg enic pl ant re search. Ch in Bull Bo t 44 , 49 7-50 5.
* Author for correspondence. E-mail: y inw l@bjfu.edu.cn; xiaxl@bjf u.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)
更 正
本刊2009年44卷3期273-282页“高等植物尿素代谢及转运的分子机理”一文中, 由于排版和校对疏漏, 导致部分计
量单位出现错误, 现更正如下: 273页左栏5行和6行中, “mm ol.L-1”应为“mmol.L-1”。编辑部向该文作者和广大读者致
歉。