全 文 ：植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (6): 728-734, w w w .chinbullbotany.com
doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.06.011
收稿日期 : 2009-03-06; 接受日期 : 2009-09-03
基金项目 : 国家自然科学基金(No.30371148)、863计划(No.2006A A10Z182)、国家林业局 948项目(No.2005-4-34, No.2007-4-
02)和国家林业局公益林专项经费课题 (No.200701017)
* 通讯作者。E-mail: hf w ang@bjf u.edu.cn
.技术方法.
胡杨转基因体系的建立
范源伟 1 , 刘挨枝2, 王华芳 1 *
1北京林业大学生物科学与技术学院 , 林木育种国家工程实验室, 林木、花卉遗传育种教育部重点实验室 , 国家林业局树木花
卉育种生物工程重点开放性实验室 , 北京 100083; 2 内蒙古阿拉善盟农牧业局, 巴彦浩特 750306
摘要 胡杨(Populus euphratica)是唯一能在沙漠里生长的高大乔木树种, 建立其转基因体系可为胡杨抗逆分子机制与应用
技术研究提供基本方法。通过研究农杆菌介导的胡杨转GUS基因的技术体系得出以下结论: (1) 胡杨再生植株体系, 叶片在附
加1.0 mmol.L-1 6-BA和5.0 mmol.L-1 NAA的1/2MS培养基上不定芽诱导率较高; (2) 转基因体系, 胡杨叶片在含100 mmol.L-1
乙酰丁香酮的OD 600值为0.4-0.6的根癌农杆菌菌液中浸染15分钟, 共培养2天, GUS基因转化效率较高; (3) 转基因植株抗生
素筛选, 转GUS基因胡杨叶片用300 m g.L-1头孢霉素抑制农杆菌生长, 在含9 m g.L-1 G418的培养基上诱导不定芽以获得转
基因的抗性植株。
关键词 根癌农杆菌, GUS基因 , 胡杨 , 抗逆
范源伟 , 刘挨枝 , 王华芳 (2009). 胡杨转基因体系的建立 . 植物学报 44, 728-734.
胡杨(Populus euphrat ica), 极喜光, 耐旱、耐盐
碱、抗风沙, 喜温暖但也耐寒 , 是我国西北和中亚荒
漠半荒漠地区风沙前沿唯一天然分布的乔木树种。
它在干旱等环境恶劣地区具有修复生态、保障绿洲
农牧业生产和居民生活用材等作用 ( 孙雪新等 ,
1993)。其抗逆机制与性状改良的研究, 对于增强胡
杨耐逆性并提高生产和应用价值 , 具有重要理论和
战略意义。基因工程是克服物种生殖隔离 , 获得创
新品种的新技术手段。李伟等(2007)探讨了植物生
长调节剂的浓度对胡杨叶片分化以及卡那霉素、
G418、羧苄青霉素和头孢霉素 4种抗生素对胡杨叶
片再生不定芽和不定根的影响及其敏感浓度。本研
究以GUS为外源基因构建表达载体 , 建立农杆菌介
导的胡杨转基因体系, 包括转化受体(叶片和茎段)、
乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)浓度、预培养时间、
浸染时间、根癌农杆菌菌液浓度和共培养时间等转
基因技术参数, 为胡杨基因工程育种提供依据和技术
体系。
1 材料与方法
1.1 植物材料
胡杨(Populus euphratica Oliver)种子采自新疆 , 为王
新建教授惠赠。转基因叶片和茎段取自试管苗 , 试管
苗为本实验室繁育。
1.2 农杆菌菌株及Ti质粒
根瘤农杆菌为 GV3101, Ti质粒为pBin438, 为方荣祥
教授实验室构建。该质粒携带 GUS报告基因、35S
启动子、增强子 W 和筛选标记基因 NPTII(图 1)。
1.3 胡杨再生植株体系的建立
1.3.1 无菌培养体系的建立
胡杨实生苗生长变异大。为选择生长优势明显的植
株进行微型繁育和转基因, 将胡杨种子播于河沙为基
质的栽培箱内, 在温室养护。翌年春季植株萌芽后 ,
选择生长健壮、无病虫害且生长优势明显的实生苗
729范源伟等: 胡杨转基因体系的建立
嫩枝作为外植体。外植体用肥皂水刷洗后 , 再用自来
水冲洗 30分钟, 70%乙醇表面消毒 30秒, 无菌水刷
洗 3遍, NaClO(分析纯, 有效氯 1/1 000, 原液为 5%)
消毒 20分钟, 无菌水刷洗 3遍。截取嫩枝中间带 1个
叶芽的长 0.5-1 cm茎段, 接种在MS(Murashige and
Skoog, 1962)基本培养基上培养 14天, 选择去污染
的外植体用于培养。培养基含 5.3 g.L-1 琼脂(强度:
1 300 g.cm-2)、0.1 g.L-1肌醇, 用 1 mol HCl和 1 mol
NaOH 调 pH值至 6.3(灭菌前)。
1.3.2 不定芽诱导
以 1/2 MS 为基本培养基 , 分别以植物生长调节剂
(0.5、1和 2.5 mmol.L-1 6-BA; 1、2.5和 5 mmol.L-1
NAA; 1、2.5和 5 mmol.L-1 2,4-D)进行正交实验设计
L9(34), 组合为 9种培养基。从试管苗中采集胡杨叶
片, 接种在 9个培养基上, 暗培养 20天。然后置于光
下培养 15天, 光照强度为 36 mmol.m-2.s-1, 温度为
(25±1)°C。统计不定芽发生数量 , 计算其诱导率。
1.3.3 试管苗生根
选择生长健壮、高15 mm的无根试管苗(Phan et al.,
2004)在生根培养基上培养。生根培养基组成为 1/2
MS+0.3 mg.L-1 IBA+ 0.1 g.L-1 肌醇 +5.3 g.L-1琼脂。
1.4 农杆菌介导的GUS基因转化体系
1.4.1 转基因胡杨材料的检测与分析
将胡杨叶片剪成创伤, 接种在1/2MS+1.0 mmol.L-1 6-
BA + 5.0 mmol.L-1 NAA + 1.0 mmol.L-1 2,4-D + 0.1 g.
L-1 肌醇 + 5.3 g.L-1 琼脂的培养基上培养 2天; 转移
到添加 100 mmol.L-1 AS 的 OD600值为 0.4-0.6的工
程菌中浸染 15分钟。用无菌滤纸吸干叶片表面的菌
液, 接种在1/2MS+1.0 mmol.L-1 6-BA + 5.0 mmol.L-1
NAA + 1.0 mmol.L-1 2,4-D + 0.1 g.L-1肌醇 + 5.3 g.L-1
琼脂的培养基上暗培养 2天, 进行 GUS 组织化学染
色分析。根据 Jefferson(1987)的方法, 将已浸染的待
检测组织置于X-Gluc染色液中37°C染色过夜, 脱色。
之后观察蓝色反应 , 有 GUS基因表达的材料被染成
蓝色, 统计 GUS基因表达率。GUS基因表达率 =(显
蓝色的外植体数 /被检测的外植体数)×100%。所有实
验均为每个处理检测 10个外植体, 重复 3次。
1.4.2 转基因的技术参数优化
1.4.2.1 乙酰丁香酮的最佳浓度
在根癌农杆菌活化过程中, 培养过夜的菌液转接至新
鲜的 YEB培养基中, 并分别添加 0、50、100、200和
300 mmol.L-1 AS, 按 1.4.1节所述的GUS染色检测方
法评价AS对胡杨转化率的影响 , 选择转化效率最高
的 AS 浓度为最佳浓度。
1.4.2.2 外植体类型
分别以叶片和茎段为转基因受体, 按上述方法进行转
化与分析, 根据转化率评价胡杨叶片和茎段对外源基
因转化的影响。
1.4.2.3 根癌农杆菌菌液浓度
农杆菌菌液浓度(用 OD600 值表示)分别为 0.2、0.4、
0.6、0.8、1.0和 1.2, 按上述GUS基因转化、检测和
分析方法评价根癌农杆菌菌液浓度对外源基因转化
的影响, 选择最佳菌液浓度。
1.4.2.4 预培养时间
将外植体分别预培养 0、1、2、3和 4天后, 进行GUS
转化、检测和分析, 选择转化率最高的处理为本实验
体系的最佳预处理。
1.4.2.5 浸染时间
外植体浸染农杆菌液的时间分别为 0、5、10、15、20
和 25分钟, 其它处理同 1.4.1节所述。选择 GUS 基
图 1 pBin438的 T-DNA 区段
Figur e 1 T-DNA region of pBin438
730 植物学报 44(6) 2009
因转化率最高的农杆菌浸染时间为该实验条件下的
最佳浸染时间。
1.4.2.6 共培养时间
浸染农杆菌之后的胡杨外植体共培养时间分别设为
1、2、3和 4天, 其它处理同 1.4.1节所述。
1.5 转基因材料对抗生素的敏感性
1.5.1 抑菌抗生素的敏感性
将胡杨叶片按上述优化方法进行农杆菌浸染, 共培养
2天后, 分别接种在头孢霉素(Cef)的浓度为 0、100、
200、300、400、500和 600 mg.L-1且已确定的不定
芽诱导分化的最佳培养基上, 将叶片远轴面朝下 , 40
天后统计愈伤组织诱导率(诱导率 =产生愈伤组织的
外植体数 / 接种的外植体数 ×100%, 下同)(秦爱光和
罗晓芳, 2007)。根据诱导率的大小确定合适的抗生
素浓度。
1.5.2 筛选抗生素的敏感性
在所确定的不定芽诱导分化最佳培养基中分别添加遗
传霉素(G418) 0、3、6、9、12和 15 mg.L-1, 接种叶
片外植体, 将叶片远轴面朝下, 40天后统计愈伤组织
诱导率。以植物叶片不能诱导产生愈伤组织的 G418
的最低浓度为本实验体系抗生素筛选的最佳浓度。
2 结果与讨论
2.1 不定芽诱导培养基
胡杨叶片在 9 个添加不同植物生长调节剂组合的
1/2MS培养基上暗培养 10天后, 从切口处产生少量
黄色的愈伤组织 , 20天后有不定芽分化(图 2)。其中,
1号和 6号培养基的不定芽诱导率最高, 为 100%; 6
号培养基上的不定芽发生数目平均为 5.1, 高于 1号
培养基(3.7)(表 1)。
2.2 转基因技术体系
2.2.1 乙酰丁香酮最佳浓度
在 YEB培养基中分别加入 0-300 mmol.L-1 5个浓度
的AS(表2), AS浓度从0增至100 mmol.L-1时, 转GUS
基因的胡杨叶片中 GUS基因表达率从 16.7%提高到
90%。之后, AS浓度增大至 300 mmol.L-1时, GUS基
因表达率随之下降至 46.7%。AS 对 GUS 基因的转
化有极显著影响 , 在该实验条件下 AS的最佳浓度为
100 mmol.L-1。
2.2.2 叶片和茎段的转化率
转 GUS基因胡杨材料被染成蓝色表明 , GUS基因已
经导入并在其中表达(图 3)。叶片和茎段的转化率分
别为 80%和 30%, 其差异极显著(P=0.01), 表明叶片
表 1 培养基中添加 6-BA、NA A和 2,4-D对胡杨叶片不定芽发生的影响
Table 1 Ef fec ts of 6-BA, NAA and 2,4-D added to media on shoots occurr ing from the excised leaves of Popul us euphrati ca
Code Concentration of supplements No. of No. of explants Shoot induction No. of
(mmol.L-1) explants w ith shoots frequency shoots on
occur ring (%) each explant
1 0.5 6-BA + 1.0 NAA + 1.0 2,4-D 30 30 100 3.7
2 0.5 6-BA + 2.5 NAA + 2.5 2,4-D 30 14 46.7 2.9
3 0.5 6-BA + 5.0 NAA + 5.0 2,4-D 30 7 23.3 1.6
4 1.0 6-BA + 1.0 NAA + 2.5 2,4-D 30 10 33.3 2.1
5 1.0 6-BA + 2.5 NAA + 5.0 2,4-D 30 3 10 1.3
6 1.0 6-BA + 5.0 NAA + 1.0 2,4-D 30 30 100 5.1
7 2.5 6-BA + 1.0 NA A + 5.0 2,4-D 30 0 0 0
8 2.5 6-BA + 2.5 NAA + 1.0 2,4-D 30 11 36.7 2.4
9 2.5 6-BA + 5.0 NAA + 2.5 2,4-D 30 0 0 0
731范源伟等: 胡杨转基因体系的建立
图 2 胡杨植株再生体系
(A) 愈伤组织诱导 ; (B) 不定芽发生 ; (C) 不定芽扩繁 ; (D) 不定芽生根
Figur e 2 Es tablishment of plant regeneration in vi tro of Populus euphrati ca
(A) Callus induction; (B) Shoot regeneration; (C) Multiplication; (D) Rooting
图 3 GUS基因在胡杨转化材料中的瞬时表达
(A) 野生型叶片(对照) ; (B) 转基因叶片 ; (C) 野生型茎段(对照) ; (D) 转基因茎段
Figur e 3 Expression of GUS gene in leaves and stems of Popul us euphratica trans formants
(A) Wild-type leaves (control); (B) Transgenic leaf; (C) Wild-type stem (control); (D) Transgenic stem
732 植物学报 44(6) 2009
更适合作为转基因材料。
2.2.3 预培养时间
胡杨叶片预培养 0-4天的各处理中 GUS基因表达率
没有显著差异。未进行预培养的叶片, GUS 基因表
达率为 96.7% (表 2), 转化率最高。这表明, 在该实
验条件下胡杨叶片可以不进行预培养。
2.2.4 农杆菌菌液浓度
用以OD600值表示的6个浓度的根癌农杆菌菌液浸染
胡杨叶片, GUS基因表达率差异显著。OD600值为0.
4时, 叶片中 GUS 基因表达率最高, 达 100%(表 3)。
当 OD600值为 0.6时, GUS 基因表达率为 66.7%, 其
余 4个浓度菌液浸染的叶片, GUS 基因表达率均较
低。不同菌液浓度对胡杨转 GUS基因的影响差异极
显著(P=0.01), OD600值为0.4-0.6的农杆菌菌液浓度
较为合适。
2.2.5 浸染时间
胡杨叶片浸染农杆菌5-25分钟的5个处理之间, GUS
基因表达率差异不显著。但当浸染时间为 15分钟时,
30个叶片中有 17个叶片检测到 GUS基因的表达, 转
化率高达 56.7%(表 3), 因此该浸染时间较为合适。
2.2.6 共培养时间
转 GUS 基因的胡杨叶片共培养 1-4 天, 对 GUS 基
因的表达有显著影响。30个共培养 2天的转基因叶
片中有 29 个检测到 G US 基因表达 , 转化率高达
表 3 农杆菌菌液浓度、浸染时间和共培养时间对 GUS基因转化胡杨的影响
Table 3 Ef fects of Agrobac terium tumefaci en dens ity, infection time, co-culturing t ime on GUS gene transf ormation in Populus
euphrati ca
No. of explants A. tumefaci en Infection Co-culturing
Density No.of transf ormed Infec tion time No.of transf ormed Co-culturing No.of transf ormed
(OD60 0 ) explants (min) explants time(d) explants
30 0.2 2 cC 5 8 bAB 1 11 bB
30 0.4 30 aA 10 12 abAB 2 29 aA
30 0.6 20 bB 15 17 aA 3 8 bcBC
30 0.8 3 cC 20 10 abAB 4 3 cC
30 1.0 1 cC 25 5 bB
30 1.2 0 cC
同列中大写字母不同为差异极显著 (P=0.01), 小写字母不同为差异显著 (P=0.05) (邓肯氏新复极差法检验 )
Different capital letters in the same column indicated signif icant dif ferences at the level P = 0.01, and low ercase letters indicated
signif icant differences at the level P = 0.05 (Duncan’s new multiple range test).
表 2 A S浓度和叶片预培养时间对 GUS基因转化胡杨的影响
Table 2 Effects of AS concentrations in YEB medium and pre-culture time of leaves on GUS gene transformation in Populus euphratica
No. of explants A S treatment Pre-culture
AS concentration No. of GUS Pre-culture No. of GUS
(mmol.L-1) trans formation explants time(d) trans formation explants
30 0 5 cC 0 29 a
30 50 15 bB 1 27 ab
30 100 27 aA 2 24 b
30 200 20 bAB 3 27 ab
30 300 14 bB 4 27 ab
同列中大写字母不同为差异极显著 (P=0.01), 小写字母不同为差异显著 (P=0.05) (邓肯氏新复极差法检验 )
Different capital letters in the same column indicated signif icant dif ferences at the level P = 0.01, and low ercase letters indicated
signif icant differences at the level P = 0.05 (Duncan’s new multiple range test).
733范源伟等: 胡杨转基因体系的建立
96.7%(表 3), 与其它 3 个共培养时间的差异极显著
(P=0.01)。
2.3 转基因材料的抗生素敏感性
2.3.1 抑菌抗生素的敏感性
头孢霉素(Cef)用于抑制农杆菌生长 , 当其浓度从0增
加至 300 mg.L-1时, 有 25个叶片再生不定芽, 诱导
率高达 83.3%(表 4); Cef浓度持续增加至 600 mg.L-1
时, 不定芽诱导频率随之下降至 0, 同时抑制不定芽
的伸长和生长。因此在该实验条件下, Cef 浓度为
300 mg.L-1较为合适。
2.3.2 筛选抗生素的敏感性
转GUS基因胡杨叶片在G418浓度为0-15 mg.L-1的
培养基上, 愈伤组织的诱导率及其状态见表 4。随着
G418浓度从 0增加到 9 mg.L-1, 愈伤组织诱导率从
100%下降至 0。在 G418浓度为 3 mg.L-1 的培养基
上, 30个叶片中有 15个叶片发生愈伤组织 , 诱导率
为 50%, 叶片失绿呈米黄色 , 干枯死亡; 愈伤组织为
浅黄色, 且随着培养时间的延长 , 没有观察到不定芽
分化; 当培养基中 G418浓度大于 9 mg.L-1时已完全
抑制愈伤组织形成 , 叶片发黄并褐化死亡。
2.4 讨论
胡杨转基因所涉及的基本问题是植株再生体系、转
基因技术和转基因材料的筛选鉴定。与胡杨植株再
表 4 头孢霉素及 G418浓度对转 GUS基因胡杨叶片不定芽发生和愈伤组织诱导的影响
Table 4 Ef fects of cefotaxime (Cef) and G418 concentrations on shoots occur rence and calli induc tion from trans formed leaves
of Popul us euphrati ca
No. of Cef G418
explants Concentrations No. of explants Concentrations No. of explants Grow th state
(mg.L-1) w ith shoots (mg.L-1) w ith callus
occur ring induc tion
30 0 0 0 30 Calli tender
30 100 21 3 15 Calli et iolating
30 200 23 6 8 Leaves light yellow color, calli less
30 300 25 9 0 No callus, leaves yellow ish
30 400 15 12 0 No callus, leaves yellow ish and brow ning
30 500 8 15 0 No callus, leaves w ith marginal vitrif ication
30 600 0
生体系有关的基本培养基已有 3种: MS(谷瑞升等 ,
1999)、1/2M S(Phan et al. , 2004)和 MP 2(赵鹏,
2007)j。鉴于植物选择性吸收矿质的生理特征 , 只要
培养基的营养组成变动不超出植物选择性吸收能力
范围, 一般不会产生明显的生理差异。关于培养基中
植物生长调节剂对胡杨器官分化的影响, 谷瑞升等
(1999)报道, 不定芽再生对生长调节剂浓度的要求不
很严格, 反应也不很敏感 , 维持 6-BA 与 NAA的比值
至关重要。本研究通过 6-BA、NAA、2, 4-D的正交
实验 L9(34)的结果(表 1)表明, 2号和 6号培养基中 6-
BA与NAA的比值相同但浓度不同 , 对不定芽诱导差
异明显, 这种差异可能与细胞的来源和所处的部位有
关, 即特定部位的细胞中生长素和细胞分裂素的浓度
和比例决定着该特定细胞生长分化的方向。
影响农杆菌介导转化的因素是多方面的。为了
获得实验室中可操作的胡杨转基因技术体系, 以报告
基因 GUS代替目的基因进行转化。结果表明, 叶片
浸染后的共培养时间、AS浓度和菌液浓度等显著影
响 GUS基因转化, 是关键因素。而叶片预培养时间
对实验结果的影响不显著, 类似情况在烟草(Nicot i-
ana tabacum)、豇豆(Vigna unguicu lata)和苜蓿
(Medicago sativa)叶片中均有过报道(王关林和方宏
筠,1998)。浸染时间在 5-25分钟的 5个处理之间差异
j赵鹏 (2007) . 胡杨植株再生与转基因技术体系研究. 硕士
学位论文 . 北京 : 北京林业大学 .
734 植物学报 44(6) 2009
不显著。但从表 3可看出, 浸染 15分钟的处理组转化
率最高, 浸染时间低于或高于该时间, 转化率都较低,
因此 15分钟可作为最佳浸染时间。统计学上的差异
不显著可能与实验设计的浸染时间间隔较短有关, 可
在以后的实验中加以注意。
农杆菌介导的外源基因转化, 浸染材料共培养之
后抑制农杆菌生长、诱导转基因植株再生、筛选鉴
定转基因新品种是连续的基本过程。李伟等(2007)将
胡杨叶片、茎段和根分别接种到添加 Cef、Kan和
G418的 MS 培养基上培养 , 观察叶片、茎段和根分
化率以确定其最佳浓度。而本实验以浸染农杆菌、共
培养的材料进行抑菌抗生素浓度选择; 根据 GUS基
因表达检测结果确定转基因材料和再生植株筛选的
抗生素浓度, 这种方法可能更接近实际操作过程。尽
管本研究获得了 8株 G418抗性植株, 但根据转基因
育种程序还需要进一步对GUS基因与胡杨基因组整
合及稳定表达进行检测与筛选。
Transformation of Populus euphratica
Yuanwei Fan1, Aizhi Liu2, Huafang Wang1*
1Nat ional Eng ineering L abora tory for Tree Breed ing, Key Laboratory of Genet ics a nd B reedi ng in Fore st Trees and Orname ntal Plan ts,
Min istry of Educa tion, Col lege of Bi olog ical Scien ces and B iotechnolo gy, Beiji ng Fo rest ry Un iversity, Beij ing 1 0008 3, Ch ina
2Ag ricultu re and An imal Hu sba ndry Bu rea u o f Al ash an Lea gue of Inn er Mong oli a, Baya nho t 7 503 06, Chi na
Abstr act The unique arbor tree spec ies Popul us euphratica can grow w ell in arid deser t. We established an Agrobac ter ium-
based trans formation sys tem for this species using a GUS gene as the repor ter . Shoots of P. euphratica w ere regenerated from
leaves placed on 1/2 MS supplemented w ith 1.0 mmol.L-1 6-BA and 5.0 mmol.L-1 NAA, leaves w ere infected for 15 min in a solution
of A. tumefaciens w ith 0.4-0.6 OD600 and 100 mmol.L-1 A S, and then co-cultured for 2 days. A. tumefaciens w as inhibited w ith 300
mg.L-1 Cef, and transgenic tis sues and shoots w ere selected w ith 9 mg.L-1 G418.
Ke y w ords Agrob acteri um tumefacien s, GUS g ene, Po pul us eup hra tica, st ress tole ran ce
Fa n YW, Liu AZ, Wang HF (200 9). Transformat ion of Po pul us eup hra tica. Chi n Bull Bo t 44 , 72 8-73 4.
* A uthor for cor respondence. E-mail: hfw ang@bjf u.edu.cn
(责任编辑: 白羽红)
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