全 文 ：植物学通报 2005, 22 (2): 198~202
Chinese Bulletin of Botany
①国家自然科学基金(30170086, 30370127)、863计划(2001AA645010-5)和转基因植物专项(JY03-A-20-01)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: mami@ibcas.ac.cn
收稿日期：2004-05-17 接受日期：2004-07-19 责任编辑：白羽红
技术与方法
提取蕨类植物蜈蚣草总 RNA的一种有效方法①
何振艳 徐文忠 杨学习 麻 密②
(中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学院重点实验室 北京 100093)
摘要 介绍了一种提取蕨类植物蜈蚣草(Pteris vittata L.)总RNA的有效方法。由于蜈蚣草富含多酚和
多糖，用普通的RNA提取方法很难获得高质量的RNA。本方法通过优化提取缓冲液的条件来抑制多
酚氧化，并利用RNA与多酚、多糖在不同浓度的2-丁氧乙醇中溶解度不同的特性来去除多酚和多糖。
本方法简便、快速，所提取的RNA质量较高，可直接用于cDNA合成、cDNA文库的构建以及RACE
等分子生物学操作。
关键词 蜈蚣草，蕨类植物，多酚，多糖，RNA提取
An Effective Method of Total RNA Isolation from a Fern
Plant— Pteris vittata L.
HE Zhen-Yan XU Wen-Zhong YANG Xue-Xi MA Mi②
(Key Laboratory of Plant Photosynthesis and Molecular Environmental Physiology, Institute of Botany, the
Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093)
Abstract Here we reported on an effective method for total RNA isolation from a fern plant,
Pteris vittata L. This method inhibits the oxidation of polyphenols by optimizing the conditions
of the extraction buffer. Most of the polysaccharides and polyphenols extracted with nucleic
acids are removed by taking advantage of differences in solubility of these compounds in the
solvent 2-butoxyethanol. The whole process can be completed with a convenient manipulation
in less than 2 hours. Isolated RNA has high purity and yield, and can be used for molecular
manipulation such as the cDNA synthesis, cDNA library construction and RACE.
Key words Pteris vittata L., Fern, Polysaccharides, Polyphenols, RNA isolation
2001年，《Nature》报道了世界上发现
的第一种砷超富集植物(hyperaccumulator)—
—蜈蚣草(Pteris vittata L.)(Ma et al., 2001)。
蜈蚣草属蕨类植物门、凤尾蕨科、凤尾蕨
属，广布于我国长江以南各地区。最近越来
越多的研究显示, 蜈蚣草和其他一些蕨类植物
所具有的特性对于土壤砷污染的治理和植物
砷抗性机制的研究都具有十分重要的意义(陈
同斌等, 2002; Raab et al., 2004)。
然而到目前为止，国内外尚无蜈蚣草砷
1992005 何振艳等: 提取蕨类植物蜈蚣草总RNA的一种有效方法
抗性分子机制研究的报道。其他蕨类植物有
关分子生物学的研究资料也很少。RNA提取
是进行分子生物学研究的必要前提。由于蜈
蚣草富含多酚和多糖，普通的RNA提取方法
(如盐酸胍法和TRIZOL法等)很难获得高质量
的 RNA。在对多种 RNA提取方法进行比较
和改进的基础上(Manning, 1991；Schneider
et al., 1991；Sharma et al., 2003；Zhang et
al., 2003)，我们摸索出一种提取蕨类植物蜈
蚣草总 RNA的有效方法。用该方法提取的
RNA可直接用于 cDNA合成、cDNA文库构
建以及 RACE等分子生物学操作。
1 材料与方法
1.1 实验材料和试剂
蜈蚣草(Pteris vittata L.)采自我国湖北矿
区，移栽在温室培养。取幼嫩叶片作为RNA
提取材料。
各种试剂均为 RNA实验专用。TRIZOL
购于 Invitrogen公司；Clontech PCR-SelectTM
cDNA Subtraction Kit 和 SMARTTM RACE
cDNA Amplification Kit购于Clontech公司。
1.2 RNA提取
1.2.1 改进的RNA提取法 将0.5 mL提取
缓冲液(100 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.3；500
mmol.L-1 EDTA，500 mmol.L-1 NaCl； 2%
SDS; 5 mmol.L-1 DTT, pH 8.3)加入到1.5 mL
离心管中, 加入 1.5%(V/V)β -巯基乙醇。将
100 mg新鲜的蜈蚣草叶片用液氮冷冻研磨后,
迅速转到温浴的缓冲液中，剧烈震荡离心
管，使组织与提取液充分混匀；70 ℃温浴
6分钟, 迅速置于冰上。待冷却后，12 000 g
离心 10分钟，小心取出上清液；向上清液
中加入 0.1 mL 5 mol.L-1 NaCl， 混匀后，加
入1/2体积的水饱和酚和1/2体积的氯仿,在旋
涡振荡器上剧烈振荡 2 分钟， 12 000 g离心
10分钟,小心取出上清液。向上清液中加入
1/4体积的2-丁氧乙醇和1.5%(V/V)的β-巯基
乙醇，混匀，冰浴 10分钟；12 000 g离心
10分钟，小心取出上清液；向上清液中加入
1体积的2-丁氧乙醇和1.5%(V/V)β -巯基乙
醇，充分混匀后静置 10分钟，12 000 g离
心 10分钟，倒掉上清液。用 50%的 2-丁氧
乙醇洗涤沉淀 2次，加入适量的 DEPC处理
水溶解 RNA。
1.2.2 硫氰酸胍一步法提取总 RNA 参考
《分子克隆实验指南》的方法(Sambrook et
al., 1992)。
1.2.3 TRIZOL法提取总RNA TRIZOL总
RNA提取试剂盒购于 Invitrogen公司，严格
按照试剂盒说明书操作。
1.3 RNA质量检测
用紫外分光光度计检测 RNA纯度和浓
度, 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA
的完整性。
1.4 cDNA文库构建
以1.2.1节中所述方法分别制备经砷诱导
的处理和对照的 RNA，并构建差异表达的
SSH(suppressive subtraction hybridization)
cDNA文库(按试剂盒提供的方法操作)。合成
的 cDNA质量可以验证 RNA的质量。
1.5 RACE
用 1.2.1节中所述的 RNA提取法制备的
RNA进行RACE (rapid amplification of cDNA
ends)实验(按试剂盒提供的方法操作)，对蜈
蚣草 ABC Transporter基因进行克隆。以
RACE结果来验证 RNA的质量。
2 实验结果
2.1 RNA质量的检测
首先用琼脂糖凝胶电泳检测所制备的
RNA的质量。图 1中 3~7泳道为以 1.2.1节
所述的改进方法提取的不同样本的蜈蚣草
RNA。各个样本质量均一，28s rRNA亮度
高于18s rRNA或者与之相当, 说明提取过程
中没有降解现象发生。在电泳检测中看不到
200 22(2)
DNA污染,说明 RNA较纯净。表 1为不同方
法提取的蜈蚣草总RNA的纯度及含量。改进
方法提取的蜈蚣草 RNA其 OD260/OD280为
1.97± 0.01，说明 RNA纯度较高。硫氰酸
胍一步法和TRIZOL法提取的蜈蚣草RNA有
凝胶状沉淀，很难溶于水，其 OD260/OD280
分别为 1.09和 1.03，表明 RNA不纯，有很
多杂质，多酚多糖类去除不干净。电泳结果
呈弥散状，无明显条带(图 1的 1和 2泳道)，
表明 RNA 已降解。
2.2 不同方法提取的RNA合成的cDNA
比较
图2分别是不同方法提取的RNA合成的
cDNA电泳图。泳道 1是用改进方法(如 1.2.
1节所述)提取的RNA合成的 cDNA，其大小
在 0.5~2 kb以上；而在凝胶检测中几乎看不
到用硫氰酸胍法提取的RNA合成的cDNA以
及用TRIZOL法提取的RNA合成的 cDNA。
说明改进方法提取的 RNA质量高，有较高
转录活性。
2.3 改进方法提取的蜈蚣草RNA用于RACE
方法克隆基因
用 1.2.1节中所述的 RNA提取法制备的
R N A 进行 R A C E 实验，对蜈蚣草 A B C图 1 不同方法提取的蜈蚣草总RNA的琼脂糖凝
胶电泳图
1. 硫氰酸胍法提取的 RNA; 2. TRIZOL法提取的
RNA; 3~7. 改进方法(如 1.2.1节所述)提取的RNA
Fig. 1 Agarose eletrophoresis of the total RNA iso-
lated by different methods
1. RNA extracted by the method of guanidinium
thiocyanate; 2. RNA extracted by the method of
TRIZOL; 3~7. RNA extracted by the described method
in 1.2.1
表 1 不同方法提取的蜈蚣草总RNA的纯度及含量
Table 1 The purity and concentration of the total RNA isolated by different methods
Improved method Guanidinium thiocyanate Method of TRIZOL
OD260 0.3061± 0.005 0.1124± 0.002 0.1004± 0.003
OD280 0.1551± 0.004 0.1034± 0.008 0.9792± 0.004
OD260/OD280 1.97± 0.01 1.09± 0.02 1.03± 0.02
Total RNA(mg RNA.g-1 FW) 453.00± 5.92 166.35± 2.96 148.591± 4.44
图 2 cDNA的凝胶检测
M. Marker, Фx174/HaeⅢ(1.3 kb, 1.1 kb, 0.9 kb, 0.6
kb, 0.3 kb)
1. 用改进方法(如 1.2.1节所述)提取的RNA合成的
c D N A；2 . 用硫氰酸胍法提取的 R N A 合成的
cDNA；3. 用TRIZOL法提取的RNA合成的 cDNA
Fig. 2 Agarose eletrophoresis assay of cDNA
M. Marker, Ф x174/HaeⅢ (1.3 kb, 1.1 kb, 0.9 kb,
0.6 kb, 0.3 kb); 1. cDNA synthesized from RNA iso-
lated by the described method in 1.2.1; 2. cDNA syn-
thesized from RNA isolated by the method of
guanidinium thiocyanate; 3. cDNA synthesized from
RNA isolated by the method of TRIZOL
2012005 何振艳等: 提取蕨类植物蜈蚣草总RNA的一种有效方法
T r a n s p o r t e r 基因进行克隆。3 R A C E 和
5RACE以及全长基因的克隆(图3)都取得了成
功。这证明RNA质量较高，可以满足RACE
技术的要求。
3 讨论
3.1 防止酚类化合物被氧化的对策
多次实验结果表明，硫氰酸胍提取液以
及 TRIZOL试剂不适合于蜈蚣草 RNA的提
取。因为这类强变性剂会使蕨类植物蜈蚣草
细胞破碎后释放出大量的多酚和多糖。多酚
类物质在酸性pH(pH4～6)条件下极易氧化使
匀浆液变为褐色。被氧化的多酚化合物(如醌
类)能与 RNA稳定地结合,导致 RNA活性丧
失，在用苯酚、氯仿抽提时会导致 RNA的
丢失，或形成不溶性复合物(Schneider et al.,
1991)。
针对蜈蚣草RNA提取中的困难，本改进
方法提高了研磨缓冲液的pH值(8.3)，同时加
入了还原剂二硫苏糖醇(DTT)和β -巯基乙
醇，有效地防止了多酚类物质的氧化。在用
硫氰酸胍和 TRIZOL等方法提取蜈蚣草的
RNA时，会出现极为严重的褐化现象，而
应用本方法却很少发生此现象。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的CO-N=基有很
强的结合多酚化合物的能力, 本研究也曾尝试
使用这种多酚的螯合剂。在 1.2.1节中所述
的RNA提取缓冲液中加入PVP，但无明显的
作用。在硫氰酸胍提取液以及 TRIZOL试剂
中加入 PVP，一定程度上可以减轻褐化效
应，但不能彻底去除这类化合物。硫氰酸胍
提取液以及 TRIZOL试剂都是酸性溶液，而
改进的提取缓冲液是碱性溶液，这说明用
PVP去除多酚时pH值可能是一个重要的影响
因素。也有研究表明在pH 8.0以上时PVP结
合多酚的能力会迅速降低(Loomis et a l . ,
1966)。
3.2 多糖及多酚的去除
多糖的污染是提取蜈蚣草RNA时遇到的
另一个棘手的问题。多糖的许多理化性质与
RNA很相似,因此很难将它们分开。在去除多
糖的同时 RNA也会被除去，造成 RNA产量
的减少；在沉淀RNA时, 产生多糖的凝胶状
沉淀, 这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水, 或
图 3 RACE实验结果
A. 3RACE电泳结果 1. Marker DL2000; 2. 3RACE片段, 800 bp; B. 5RACE电泳结果 1. Marker DL2000; 2.
5RACE片段, 1 500 bp; C. 全长基因克隆的电泳结果 1. Marker100 bp DNA Ladder; 2. 全长基因 2 300 bp
Fig.3 The results of RACE
A. The result of 3RACE 1. Marker DL2000; 2. The 3cDNA fragment of gene, 800 bp; B. The result of 5RACE
1. Marker DL2000; 2. The 5cDNA fragment of gene, 1 500 bp; C.The result of the cloning of the full length gene
1. Marker, 100 bp DNA Ladder; 2. The full length cDNA of gene, 2 300 bp
202 22(2)
溶解后产生黏稠状的溶液。由于多糖可以抑
制许多酶的活性, 因此污染了多糖的RNA样
品无法用于进一步的分子生物学研究(李宏和
王新力, 1999)。
LiCl 可以选择性地沉淀 RNA, 获得的
RNA较纯,并能去除大部分多糖,但实验周期较
长, 沉淀RNA一般都需要至少2小时以上的冰
浴。Manning(1991)曾报道多酚和多糖以及
RNA在 2-丁氧乙醇中有不同溶解度的特性。
而各种材料中所含有的多酚和多糖种类千差
万别，具体的使用条件需要摸索。本方法利
用高浓度钠盐可以沉淀多糖的特性并结合使
用 2-丁氧乙醇来去除多酚和多糖。首先，在
高浓度钠盐条件下，加入低浓度(1/4体积)的
2-丁氧乙醇来沉淀多糖。在含有RNA的上清
液中加入高浓度的 2-丁氧乙醇(50%)来沉淀
RNA，同时多酚溶解于 2-丁氧乙醇中被除
去。然后再用含 50% 2-丁氧乙醇洗涤 RNA
沉淀以去除残留的多酚。
随着更多的蕨类植物被发现在环境修复
领域中具有重要用途，蕨类植物的分子生物
学研究也会不断深入。本文所报道的这种简
便有效的RNA提取方法，可以为今后蕨类植
物的分子生物学研究提供借鉴。
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