全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第3期
当外界环境不利,例如干旱、盐害、冷热时,许多生物体内便会积累一定浓度的渗透保护剂,起着调节胞
内渗透压,保护胞内酶活性的作用[1]。脯氨酸是公认的在细胞中起着无毒渗透保护作用的细胞相溶性物质
[2],广泛存在于植物、动物、细菌等多种生物体中[3]。植物中脯氨酸的合成有两条途径:谷氨酸途径和鸟氨酸
途径。两条途径的主要区别在于初始底物的不同。前者的初始底物是谷氨酸,后者的底物是鸟氨酸(F,<)。在
渗透胁迫和氮素缺乏的情况下,谷氨酸途径是合成脯氨酸的主要来源;而在氮素供应充足的情况下,鸟氨酸
途径占主导地位[4,5]。
(1)谷氨酸途径在植物体中,一直没能分离到谷氨酰激酶(γ-GK)和谷氨酸半醛脱氢酶(GSADH),也很难
检测到谷氨酰磷酸(γGP)的存在。后来,通过对细菌营养缺陷型的互补实验,终于克隆到一种 cDNA,它编码
的酶称为吡咯琳-5-羧酸合成酶(P5CS)[6],此酶不仅具有谷氨酰激酶(γ-GK)的活性,也具有谷氨酸半醛脱氢酶
小叶杨Δ1- 吡咯琳- 5- 羧酸合成酶( P5CS)基因
克隆及在杂种落叶松中的转化
韩素英 1,2 张守攻1 汪泉 1 周春娥 1 刘国华 1 齐力旺 1
(1中国林科院林业研究所细胞生物学实验室,北京 100091;2中国林科院森环森保所,北京 100091)
摘 要: 以小叶杨为材料构建了干旱胁迫和正常生长条件下的cDNA文库,以特异性引物从中扩增出一条1850bp
大小的DNA片段,经序列分析证实该片段编码Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(P5CS)。将该片段构建入植物表达载体pBI121中,
在落叶松杂交育种中利用花粉管通道法将带有该P5CS基因的植物表达质粒转化入杂种落叶松,收获球果取出种子,提取转
化种子发芽长出幼芽的DNA,特异性PCR扩增和Southern,Western Blotting检测证实落叶松中已导入P5CS基因。
关键词: 小叶杨 P5CS基因 转录因子 杂种落叶松
Transformation of Hybrid Larch (Larix Leptolepis x L. Olgensis)
with P5CS Gene Cloned from Populus Simonii cDNA Library
Han Suying1,2Zhang Shougong1 Wang Quan1 Zhou Chune1 Liu Guohua1 Qi Liwang1
(1Laboratory of Cell Biology, The Research Institute of Forestry, The Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091;2The
Research Institute of Forestry Ecological Environment and Protection, The Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091)
Abstract: cDNA library were constructed from the drought-trea ed and normal Populus simonii materials. By using
PCR with specific primers, a segment of 1 500bp was gained and identified as the gene encoding delta 1-pyrroline-5-
carboxylate synthetase P5CS. This segment was constructed into the plant expression vector pBI121. Then the constructed
plasmid was transformed into hybrid larch (Larix leptolepis x L. olgensis) by using the Pollen Tube Pathway . The PCR
amplification , Southern and Western Blotting hybridization methods and sequence analysis were used to identified the
P5CS gene in the transgenic hybrid larch (Larix leptolepis x L. olgensis).
Key words: Populus simonii P5CS gene Transcript factors Hybrid larch (Larix leptolepis x L. olgensis)
收稿日期:2005-12-19
基金项目:国家“973”项目“树木育种的分子基础研究”(G1999016003)和国家林业局“948”项目(98-4-04-02)以及国家转基因与产业化专
项(J2002-B-005)与(JY03-B-28-02)资助
作者简介:韩素英,女,
通讯作者:齐力旺(1962-),男,研究员,博士生导师,主要从事林木遗体传育种和树木生物技术研究,电话:010-62888445, E-mail:
lwqi@caf.ac.cn
2006年第3期
图1 pBI121-P5CS载体
(GSADH)的活性,即它是一个双功能酶。序列分析表明,它编码的 73.2kDa的多肽的 N端与 E.coli的谷氨酰
激酶(γ-GK)同源,而 C端却与谷氨酸半醛脱氢酶(GSADH)同源。表明在通过谷氨酸途径合成脯氨酸的前两步
反应里,植物是由一个酶催化的,而在细菌和酵母中却是分别由两个酶催化[7]。这是植物与细菌的主要区别。
(2)鸟氨酸途径在此途径中合成脯氨酸的底物是鸟氨酸(Orn),鸟氨酸转氨酶(OAT)是反应的初始酶。鸟
氨酸经过转氨基作用生成 GSA,然后自发生成 P5C,直至被 P5CR还原为脯氨酸的反应与谷氨酸途径以及
细菌中的过程是一致的。
在植物中,有谷氨酸经由 P5C合成脯氨酸是有两个酶催化的,即 P5CS和 P5CR。许多植物在渗透胁迫
时,体内都会累积脯氨酸,这首先与酶基因的转录有关。拟南芥脱水后两小时,就有 P5CS基因的转录。而将
脱水、复水过程拟南芥的脯氨酸水平与 P5CS基因和 P5CR基因的 mRNA水平进行比较,发现脯氨酸含量的
上升和下降与 P5CS基因的 mRNA水平的消长成比例,而与 P5CR的 mRNA水平没有明显的相关性[8]。而且
在转基因大豆中转入 P5CS,P5CR基因,虽然两者的 mRNA水平均有提高,但是转入 P5CR基因的烟草的脯
氨酸增长却不明显,而转 P5CS基因的烟草的脯氨酸水平显著提高[8]。这些结果表明,脯氨酸的增长受 P5CS
的影响要大于受 P5CR的影响。P5CS是渗透胁迫时植株体内合成脯氨酸的关键酶。因此单独转化 P5CS基
因的植株就可以提高脯氨酸的含量,起到抗旱、耐盐的作用。为在转基因植物中建立一条完善的脯氨酸合成
途径,必须克隆得到其限速的 P5CS基因[9]。
小叶杨是我国特有乡土树种,具有抗旱、耐瘠薄、适应性广、生长优良、寿命长等特性,在荒沙及黄土高
原区均能生长,最适宜的则是湿润肥沃的黄土和冲积土,是中国最早开展人工栽培和杂交育种的树种之一。
对其的抗旱和耐瘠薄遗传特性的系统研究对于提高树木抗逆性、减少水土流失、保护生态环境以及支持西
部大开发均具有重要的意义。经过对其研究,不仅克隆得到了小叶杨编码 P5CS的基因,还将其导入杂种落
叶松,得到 P5CS超重表达的转基因杂种落叶松。
1 材料和方法
1.1 植物模型的建立
选用小叶杨(无性系 T80)枝条,分为干旱处理组和正常对照组两部分进行盆栽培养。其中干旱组又分
别进行了 3d、7d、10d、14d、21d等的缺水干旱胁迫处理,选取干旱处理存活率较高时的小叶杨幼苗作为干旱
处理组的实验材料;正常组则一直保证供水,幼苗清洗后用于 cDNA文库的构建。
1.2 cDNA文库构建
采用 PromegaRNAextractkit分别提取干旱处理
和正常对照小叶杨总 RNA,经 PromegaQuickPrepTM
MicromRNAPurificationkit分离得到 mRNA,使用
Promega公司的 ZAP-cDNAsynthesiskitandZAPEx-
presscDNAGigapackⅢ GoldCloningKit构建干旱处
理小叶杨cDNA文库和正常对照小叶杨cDNA文库,分
别检测滴度。
1.3 引物设计及目的基因的克隆
参照 GENEBANKNM201912,我们设计可能扩增
出 P5CS基 因 的 特 异 性 引 物 , 其 序 列 为 :5-
AACTCTAGAATGGCTTACTATGAGACTAT-3 和 5-
AATCCCGGGTTAAGCTTGGATGGGAATG-3。提取文库
的 DNA,用该引物进行 PCR扩增,扩增参数为,预变
性:94℃ 2min、94℃ 变性 1min、59℃ 复性 1min、72℃
延伸 5min,共扩增 30轮,将得到的扩增片段进行序列
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干旱处理时间(d) 3 7 10 14 21
存活率(%) 95 85 65 38 15
分析,检测扩增结果。
1.4重组植物表达质粒的准备
将 P5CS扩增片段用 XbaI和 SmaI酶切,然后插入到 pBI121载体的XbaⅠ和 SmaⅠ位点间,处于
CaMV35S启动子的下游(图 1)。
1.5目的基因的制备及其杂交转化
杂交转化设在辽宁省大孤家日本落叶松种子园,母本为日本落叶松(Larixleptolepis)优良无性系:日永
8#、日草 19#等,父本为长白落叶松(L.olgensis)优良无性系:长 4#、长 10#、长 13#等,提取与纯化好的质粒基
因以 ddH2O为溶液介质,于 2002年春季 4月 8～11日去雄、套袋,14～16日连续授粉 3次,在第一天授粉后,
根据落叶松花球特点及质粒基因的不同转化方法与技术的要求,将制备好的质粒基因按照花粉管通道法
[11,12],并参照杨树、棉花等相关植物杂交转化方法与技术[13~16],同时结合已经建立的落叶松体细胞胚胎发生
及其遗传转化实验技术平台[14]经验,进行 P5CS基因对落叶松的转化;进行正常的杂交球果中间管理以及不
断的抗性生长锻炼与筛选,9月初收获杂交转化球果,进行转化苗木培育及各种分子检测。
1.6转基因落叶松的 PCR检测
将获得的转化杂种落叶松种子研碎,提取基因组 DNA,采用设计的载体特异引物进行 PCR鉴定,测序
检测扩增片段[10]。
1.7转基因落叶松的 SouthernBloting检测
将获得的转基因落叶松幼苗,提取幼苗基因组 DNA,进行 SouthernBloting杂交,检测 P5CS基因是否
整合到植物基因组中[10]。
1.8转基因落叶松的 WesternBloting检测
将获得的转基因落叶松幼苗,提取蛋白,进行 WesternBloting杂交,检测 P5CS基因是否已经在落叶松
中表达。
2 实验结果
2.1模型建立
在对干旱组分别进行了 3d、7d、10d、14d、21d等的缺水干旱胁迫处理后,统计了小叶杨的存活率,发现
小叶杨在干旱胁迫一周之内仍可以保持 85%以上的存活率,但随着胁迫时间的继续延长,存活率逐渐下降,
胁迫三周后存活率仅有 15%左右(表 1)。因此,认为胁迫一周为小叶杨的干旱胁迫的临界时间,取处理一周
的小叶杨来进行后续的实验。
表1 模型建立
2.2cDNA文库构建
2.2.1 总 RNA的提取 分别提取干旱处理组和对照组小叶杨
的 RNA,快速电泳胶可明显观察到两条电泳带:28S,18S,有少
量 DNA污染(图 2)。利用凝胶成像系统进行系统分析,28S:18S=
1.983:1(亮度比)。
2.2.2文库滴定检测 按照 Promega公司的 ZAP-cDNAsynthesis
kitandZAPExpresscDNA GigapackⅢ GoldCloningKit流
程,建立小叶杨干旱处理组和正常对照组 cDNA文库。
取 1#l文库液做梯度稀释(10-1·10-2·10-3),各取 1ml铺平板
检测滴度。依照以下公式计算:pfu/ml=噬菌斑数量×稀释倍数/铺
图2 总RNA提取结果
A为对照组 B为处理组
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图3 文库滴定检测噬菌斑图
图4 P5CS基因克隆图
平板体积 (ml)。其中处理组样品初级文库滴度为 7×
105pfu/ml,对照组样品滴度为 5×105pfu/ml;初级文库扩
增得到一级文库,将之按 10-3·10-4·10-5做梯度稀释,检
测两组滴度滴度分别为 8×108pfu/ml和 3×108pfu/ml(图
3)。
2.3 特异引物扩增 P5CS基因
经特异性引物 PCR扩增,得到一条大小 1800bp的
DNA片段(图 4),回收片段测序检测,发现它与拟南芥
P5CS基因序列的同源性达 98%。
2.4 转基因落叶松的 PCR检测
在对 63株落叶松转化苗木进行抗性植株筛选的基
础上,集中 9株表型抗性能力较强的转基因幼苗检测,
提取转基因的落叶松幼苗的 DNA,根据载体序列设计
如下特异引物:5-GAGGACCTAACAGAACTCG-3和 5-
ATCTTTGGG ACCACTGTCG-3,扩増片段为 365bp,
PCR扩增结果如图 5;转基因苗木有 7株出现阳性帯,
基因转化率为11.1%。
2.5 转基因落叶松的 SouthernBloting检测
对 6株 PCR检测为阳性的转基因落叶松基因组进
行 Southern Bloting检测结果表明全为阳性,对照为阴
性,证明 P5CS基因已经整合到落叶松的基因组中。
2.6 转基因落叶松的 WesternBloting检测
取 4株 PCR阳 性 转 基 因 的 落 叶 松 植 株 进 行
WesternBloting检测,检测结果表明,P5CS基因在落叶
松成功表达。
3 讨论
高盐、低温、干旱是影响植物生长和生产力最主要
的环境胁迫因子。尽管不同植物对环境胁迫的抗性不尽
相同,有些植物甚至在恶劣的环境条件下仍能完成其生
活周期,但大多数栽培作物对盐碱、干旱等都是高度敏
感的,在长期胁迫条件下,即使成活,也会大量减产。因
此研究植物应答渗透压胁迫的分子机制,进而利用植物
基因工程改造农作物和快速培育新的耐盐、抗旱品种有
重要的意义。大量研究表明,在干旱盐碱等逆境条件下
许多植物体会积累大量的脯氨酸,脯氨酸在细胞内会起
两种作用,它不仅作为渗透调节剂降低细胞质的水势,
维持胞质的水分状况,还是一种保护剂,使胞内大分子
物质免受盐离子的毒害。小叶杨在干旱条件下也有脯氨
酸的积累。本实验从小叶杨的干旱处理的 cDNA文库中
检测到了 P5CS基因的存在,并进行了全基因的克隆,
图5 转P5CS基因落叶松的PCR检测
M为分子量标准 CK为阴性对照 1～9为样品,
其中:8,9为阴性 1～7为阳性
1 2 3 4 5 6 7 8
图6转P5CS基因落叶松的SouthernBloting检测
1为阳性对照 2为阴性对照 3~8为样品
图7转P5CS基因落叶松的WesternBloting检测
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随后构建植物表达载体,有利于进一步揭示小叶杨抗旱分子机理,通过花粉管通道与落叶松杂交育种方法,
成功导入杂种落叶松中,通过分子检测证实 P5CS基因整合进落叶松基因组中,基因表达和功能检测证明
落叶松的抗旱能力得到了明显的提高(见另文)。从而能有效的提高树木的抗旱性,并有利于进一步揭示小
叶杨抗旱分子机理和培育树木抗旱新品种,提高树木对逆境的抵抗力,用于西部大开发,改善生态环境。
参 考 文 献
1 RhodesD,HansonAD.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol,1993,44:357～384.
2 HansonAD,HitzWD.AnnuRevPlantPhysiol,1982,33:163～203.
3 McCueKF,HansonAD.Tibtech,1990,8:358～362.
4 Alia,PrasadKVSK,SaradhiPP.Phytochem,1995,39:45～47.
5 CsonkaLN.MicrobiolRev,1989,53:121～147.
6 DelauneyAJ,VermaDPS.PlantJ,1993,4(2):251～223.
7 DelauneyAJ,HuCA,KaviKishorPB,VermaDPS.JBiolChem,1993,268:18673～18678.
8 ForlaniG,ScaineliD,NielsenE.PlantPhysiol,1997,113:1413～1418
9 KaviKishorPB,HongZ,MiaoGH,HuCAA,VermaDPS.Plantphysiol,1995,108:1387～1394.
10 SambrookandRussel,Molecularcloning,AlaboratoryManual.3nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001.
11 Leede-Plegt,VanDerLM,etal.PlantCelReport,1992,11(1):20～24.
12 令利军,倪建福,张正英.分子植物育种,2004,2(3):407～412.
13 牟红梅,刘树俊,周文娟.遗传学报,1999,26(6):634～642.
14 齐力旺,韩一凡,李玲,韩素英.实验生物学报,2000,33(4):357～365.
15 倪万潮,郭三堆,贾士荣.中国农业科技导报,2000,2(2):27～32.
16 奚亚军,林拥军,张启发.作物学报,2004,30(6):608～612.
(上接第 80页)
参 考 文 献
1 李宗军,江汉湖.微生物学通报,2004,4:9～13.
2 东秀珠,蔡妙英,等.常见细菌系统鉴定手册,北京:科学出版社,2001.
3 BuchananRE,etal著.伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)中文版.北京:科学出版社,2000.
4 SneathPHA,etal.Bergey’sManualofSystematicBacteriologyVol.2WiliasandWilkinsPublicationLTD.Baltimore,1986.
5 FransenNG,O’ConnelMBArendtEK.JFoodMicrob,1997,36:235～239.
6 NaesH,HolckAL,BlomH.JFoodSci&Techn,1995,29:651～659.
7 KotzekidonP.JFoodSci,1992,57:249～251.
8 HammesWP,BoschI,WolfG.JApplBacteriolSympSuppl,1995,79:76S～83S.
9 KloosWE.JApplbacterialSympSuppl,1990,69:25S～37S.
10 NychasGJE,ArkoudelosJS.JApplBacteriolSympSuppl,1990,69:167S～188S.
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