全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2005) 01-0034-05
利用基因枪共转化法获得转 bar与 P5CS基因黑麦草
杨成民1, 2 , 王宏芝1 , 孙振元3 , 魏建华1*
( 1. 北京生物技术研究中心, 北京 100089; 2. 内蒙古农业大学农学院,呼和浩特 010018;
3.中国林业科学研究院生物技术实验室,北京 100083)
摘要: 以多年生黑麦草( L olium per enne L . )种子成熟胚为外植体进行高效诱导愈伤组织的组培条件,在此基础上用基因
枪法轰击其成熟胚的愈伤组织, 共转化分别携带 bar 基因和 P 5CS 基因表达框架的 2 种质粒, 经 1. 2‰草丁磷
( G lufosinat e)抗性筛选获得了转基因再生植株。经聚合酶链式反应( PCR)检测筛选到整合 bar 基因的株系 18 个,遗传转
化率为 0. 72% , 其中 5 个检测到 P5CS , 共转化效率为 27. 8%。
关键词: 黑麦草;成熟胚; bar 基因; P 5CS 基因
中图分类号: Q943. 1;　　　文献标识码: A
Co-transformation of bar and P5CS Gene Using
Bombardment on Lolium perenne L.
YANG Cheng-min
1, 2, WANG Hong-zhi
1 , SU N Zhen-yuan
3 , WEI Jian-hua
1*
( 1.Beijing Inst itute of Agriculture and Fores t ry, Beijing 100089 Ch ina;
2. College of Agronomy, In ner Mongol ia Agricu lture Un ivers ity, Hohhot , Inner Mongol ia Autonomous Region 010018 C hina;
3. Laboratory of Biotechnology, CAF, Beijing 100091 C hina)
Abstract: The condit ions o f inducing the high qualif ied cal li of perennial ryeg rass mature embryo w er e studied.
The genes of bar and P 5CS were tr ansformed into the calli using microproject ile bombardment . Under the
select ion of 1. 2‰ Glufosinate resistance, some transformed plants w ere obtained. PCR analysis indicated that
18 transgenic plants contained bar gene and the f requency of t ransformat ion w as 0. 72% . Five of these 18
transgenic reg enerate plants contained P 5CS gene and the co-transformat ion f requency w as 27. 8%.
Key words : Perennial ryegrass; Mature embryo ; bar gene; P 5CS gene
　　多年生黑麦草( L ol ium perenne L. )遗传转化多采
用种胚、根尖分生组织或幼穗等诱导的愈伤组织培养
或悬浮培养细胞为受体,以基因枪轰击法为主[ 1, 2, 3]。
在国外,多年来一直致力于通过组织培养及遗传转化
技术对多年生黑麦草进行改良, 获得一些转基因植株。
Heleen( 1994)用基因枪法获得了多年生黑麦草稳定的
转基因植株( GUS 基因能长期表达) [ 4] ; Spangenber g
( 1995)用基因枪法获得了抗潮霉素的四倍体多年生黑
麦草植株[ 5] ; W ang ( 1997)用基因枪法获得了抗卡那霉
素的多年生黑麦草和一年生黑麦草植株 [ 6]。在改良黑
麦草生物性状方面, Bhalla 等( 1999)用基因枪法将
lol p5反义片段转入一年生黑麦草( L olium mul tif lo-
rum Lam . ) , 在不影响花粉育性的同时抑制了黑麦草
花粉的过敏源的产生[ 1]。在提高黑麦草的抗病害方面,
Altpeter 和 Xu ( 2000)将 RMV 外壳蛋白基因转入多
年生黑麦草, 能大幅度地提高了黑麦草抗病的能力[ 7]。
目前, 用基因工程技术改良草坪草抗非生物胁迫的报
道很少。干旱、温度胁迫和盐胁迫均会导致植物细胞发
生渗透胁迫。甜菜碱和脯氨酸都是非常重要的渗透调
节物质。Meyer 等( 2000)在建立了草地早熟禾( Poa
p r atensi s L. )诱导愈伤组织和高效再生系统后, 将
BA DH 基因用基因枪法转化草地早熟禾愈伤组织,以
收稿日期: 2003-11-20; 修回日期: 2004-04-26
基金项目:国家转基因专项( J-2002-B-006)
作者简介:杨成民( 1978-) ,男, 内蒙古通辽市人,内蒙古农业大学硕士生,研究方向为植物基因工程; * 通讯作者 Author for correspond ence E-
mail: jianhu aw ei1@ vip . s ina. com
第 13卷　第 1期
　Vo l. 13　　No. 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2005 年　3月
　M arch 　2005
潮霉素筛选后,得到的转基因植物提高了抗旱性和抗
盐性[ 8]。
脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物,其积累可
增加植物对干旱、盐碱的耐能力。吡咯啉-5-羧化合成
酶 (
1-Py rroline-5-carboxylase synthetase, P5CS ) 在
植物中催化脯氨酸生物合成的前两步反应,活性受到
脯氨酸含量的反馈抑制 [ 9]。本实验所用的目的基因是
野生型 P 5CS 的突变体,由于基因位点的突变, 可有效
去除反馈抑制 [ 9]。Hong 等( 2000)将此基因导入烟草,
使脯氨酸累积增加两倍, 转基因的幼苗可在 200 mM
NaCl中正常生长 [ 9]。本实验用黑麦草成熟胚为外植体
建立了遗传转化体系, 以从豇豆 ( V igna aconit if olia
L. )中分离到的 P 5CS 为目的基因,通过基因枪与选
择标记 bar 基因共转化黑麦草。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植物材料
多年生黑麦草( L olium perenne L. ) T op Gun 品
种的成熟种子。
1. 1. 2　重组质粒
含 bar 基因的表达载体 pBPC26(北京农业生物中
心张晓东实验室提供)。含P 5CS 基因(北京市农业生物
中心黄丛林实验室提供)的表达载体 pBPCP5CS 由北京
农业生物中心园林室构建(图 1)。构建步骤如下:对已克
隆到 P 5CS 基因的T 载体, 采用 Sp hI 和 Sp eI 双酶切,
将 P 5CS 基因与 pSP72 载体片断连接, 得到了整合
P 5CS 基因的中间质粒 pSPP5CS。EcoRI 和XhoI双酶
切中间质粒pSPP5CS和 SK,连接得到整合P 5CS 基因
的中间质粒 pSKP5CS。再采用 KpnI 单酶切中间质粒
pSKP5CS和pSP72,连接得到整合P 5CS 基因的中间质
粒 pSPP5CS2, 选择正确的连接方向, 采用 BglII 和
Kp nI 部分酶切后得到的 P 5CS 基因小片段, 连接到
pBPC26上, 构建成用于转化的表达载体 pBPCP5CS。
图 1　表达载体结构图
F ig . 1　Structure o f expr ession vecto r
Note: promoter:启动子; Tnos:终止子; Ubiquit in:玉米 ubi t1基因启动子
1. 1. 3　试剂　酶类 ( Takara) , 草丁膦 { Glufosinate
( FLUKA ) } , 地高辛 DNA 标记及检测试剂盒 {DIG
High Prime DNA Labeling and Detect ion Starter Kit

( Roche) }。
1. 2　方法
1. 2. 1　愈伤组织诱导
清水浸泡筛除成熟度低的黑麦草种子,用次氯酸
钠溶液( 50%有效氯)灭菌 30 m in, 无菌水洗涤 4次,
4℃放置 2 h 至 96 h 不同时间处理。接种同法再消毒
20 min。在解剖镜下挑取种胚置于不同愈伤诱导培养
基上。使用的基本培养基MS与W14[ 10] ,附加不同浓度
的 2, 4-D、NAA、KT 与甘露醇。25℃暗培养 1个月, 观
察愈伤诱导情况。
1. 2. 2　愈伤组织分化及植株再生
将获得的愈伤组织转入改良 MS 分化培养基( 1/
2M S 培养基(大量减半) + NAA 0. 5 mg / L+ KT 0. 5
mg / L + 蔗糖 3% + 琼脂 6. 5 g/ L pH 5. 8) , 25℃连续
光照培养至分化, 15 d 继代 1次。
1. 2. 3　转化方法
诱导 30 d 的愈伤组织作为外源基因的受体,采用
基因枪轰击法进行转化。方法如下: 金粉悬浮混合液
50
l ( 60 mg / ml ) , 加入 5
l DNA ( 1
g /
l, bar ∶
P5CS129A = 1∶5) ,后加入 50
l 2. 5 M CaCl2 和 20

l 0. 1 M 亚精胺。每枪所用金粉量为 500
g,阻挡板
至样品距离为 12 cm, 真空度 28,氦压 1100 Psi[ 11]。轰
击后将愈伤组织转移到愈伤诱导培养基上黑暗恢复培
养 7 d,再转移到愈伤诱导筛选培养基( M S+ 2, 4-D 2
mg / L+ 草丁膦 1. 2 mg/ L+ 蔗糖 3%+ 琼脂 6. 5 g / L
pH 5. 8)暗培养 4周筛选抗性愈伤, 将抗性愈伤转入
分化筛选培养基( 1/ 2MS 培养基(大量减半) + NAA
0. 5 mg / L+ KT 0. 5 mg / L+ Glufosinate 1. 2 mg / L+
蔗糖 3%+ 琼脂 6. 5 g / L pH 5. 8)。
1. 2. 4　PCR及 PCR-Souther n检测
以黑麦草总基因组 DNA 为模板, 进行转化植株的
PCR检测。SDS 法小量提取基因组DNA [ 12]。PCR特异
扩增引物根据 bar 基因和P 5CSF129A 基因序列设计。
bar 基因引物: P rimer1: 5-AT T GGA TCC ATG
AGC CCA GAA CGA CGC-3 ; Primer2: 5-CTT
GGT ACC T AA AT C TCG GT G ACG GGC-3。扩增
产物为 530 bp。反应条件: 95℃ 7 min, 94℃ 1 min;
55℃ 1 min; 72℃ 1 m in; 35个循环, 72℃,延伸 7 min。
P 5CSF129A 基因引物: P rimer1: 5-GGT TAG
CGG TT G GAA GAT T GG-3 ; Pr imer 2: 5-TGC
GCC TAG T CT CAA ATC GTG-3。扩增产物为
1900bp。反应条件: 95℃ 7 min, 94℃ 1 min; 56℃ 1
min; 72℃ 1 min40 s; 35个循环, 72℃, 7 m in。
将 PCR检测获得的扩增产物经 0. 8%琼脂糖凝
35第 1期 杨成民等:利用基因枪共转化法获得转 bar 与P 5CS 基因黑麦草
胶 电 泳 后 吸 印 至 尼 龙 膜 上, 与 DIG 标 记 的
P5CSF129A 基因探针进行 Southern 杂交(参照地高
辛 DNA 标记及检测试剂盒试剂说明书进行探针标
记、膜杂交和显色处理) , 未转化植株基因组 DNA 和
质粒分别为阴性和阳性对照。
2　结果与分析
2. 1　愈伤诱导率与浸种时间及不同培养基的关系
以成熟胚为外植体进行遗传转化的关键是高效诱
导高质量的愈伤组织。将黑麦草种子在水中浸泡一段
时间, 易于剥离种胚,但时间过长可导致种子发芽、愈
伤诱导率下降,而时间过短,种胚不易剥离。为了抑制
浸水条件下种子胚的过分发育, 水温 4℃为宜。在W 14
培养基上,浸种时间与愈伤诱导率相关性不明显,不同
的 2, 4-D 浓度有不同的最佳浸泡时间(表 1)。在 MS
培养基中浸种时间越短愈伤诱导率越高,提高 2, 4-D
浓度可提高愈伤诱导率。种胚在W 14培养基上形成的
愈伤组织多呈白色,结构较松散,形成的愈伤组织质量
与浸泡时间及 2, 4-D 浓度相关性不明显, 愈伤组织生
长缓慢, 且质量不高。在 MS 培养基上可通过长时间( 1
个月)种胚培养获得高质量的愈伤组织,开始为白色,
渐变为淡黄色,结构质密, 且有褶皱突起(表 1)。培养
基中加入 KT ,愈伤生长速度加快, 但容易导致种子直
接发芽, 不利于愈伤组织的诱导。表 1愈伤诱导率最高
的培养基是MS+ 2, 4-D 8 mg / L+ 甘露醇 0. 2 mo l/ L ,
但高浓度的 2, 4-D 浓度对后期愈伤组织的分化和植
株再生不利, 实验采用 2, 4-D浓度为 5 mg / L 而非 8
mg / L ,并在筛选培养基中进一步将 2, 4-D浓度降低到
2 mg / L ,以促进愈伤组织的增殖和分化。
表 1　浸种时间和不同培养基对诱导愈伤组织诱导率的影响
Table 1　Effect o f soaking time and dif fer ent media effect on callus induction ra te
培养基1
Medium1
浸种时间 4℃( h)
Soaking t imeat 4℃(h )
接种成熟胚数
No. of inocu lated m ature embryos
诱导愈伤数
No. of induced call i
愈伤诱导率( % )
Callus induct ion rate( % )
愈伤组织质量2
Quality of callus 2
W 14/ 2/ 4/ 0. 1 96 112 34 30. 3 +
48 140 57 40. 7 +
20 95 60 63. 2 +
8 104 42 40. 3 +
W 14/ 5/ 4/ 0. 1 96 187 50 26. 7 +
18 106 70 66. 0 +
8 108 50 46. 3 +
W 14/ 8/ 4/ 0. 1 96 96 44 45. 8 +
48 164 100 60. 9 +
20 88 34 38. 6 +
8 86 30 34. 9 +
MS / 2/ 0/ 0. 2 20 78 40 51. 2 + + +
12 120 55 45. 8 + + +
8 131 101 77. 1 + + +
3 121 96 80. 4 + + +
MS / 5/ 0/ 0. 2 5 110 85 86. 4 + + +
3 125 100 80. 2 + + +
MS / 8/ 0/ 0. 2 5 52 44 84. 6 + + +
3 96 86 89. 6 + + +
MS / 2/ 0. 1/ 0. 2 5 52 20 38. 5 + +
3 74 37 50. 0 + +
MS / 2/ 0. 5/ 0. 2 5 50 21 42. 0 + +
3 69 40 58. 0 + +
MS / 5/ 0. 5/ 0. 2 5 62 31 50. 0 + +
3 70 36 51. 4 + +
　　注1: W 14/ N/ 4/ 0. 1= W 14+ 2, 4-D N mg / L( N = 2, 5, 8) + NAA 4 mg/ L + KT 0. 1 mg / L; MS/ N/ M = MS+ 2, 4-D N mg/ L ( N= 2, 5, 8) + KT
Mmg /L ( M= 0. 1, 0. 5) + mannitol 0. 2 mol/ L ; W 14的蔗糖浓度为 10% ; MS的蔗糖浓度为 3%
2: + + + :淡黄色,颗粒状突起,质密结构; + + :乳白色,较致密结构; + :白色,松散结构
Note 1: 10% concent rat ion of sucros e in W14medium; 3% concent rat ion of sucrose in MS medium
2: + + + : yel low ish, granular, compactest s t ructure; + + : m ilky compacter s t ructure; + : w hite loos e st ructure
2. 2　基因枪转化后的抗性筛选及抗性愈伤组织分化苗
受体材料(图 2-a)基因枪转化后, 恢复 1周, 转移
至筛选培养基上选择培养 4周, 在此期间, 非转化愈伤
生长缓慢,逐渐褐化而停止生长;转化愈伤组织表面生
出淡黄色的抗性愈伤组织。将筛选所得的抗性愈伤组
36 草　地　学　报 第 13卷
织转移至分化筛选培养基上进行分化和植株再生。培
养 10 d时,抗性愈伤组织表面分化出绿色点状组织,
而对照非抗性愈伤组织没有分化现象发生,开始死亡
(图 2-b)。分化培养至 3周时,抗性愈伤组织陆续再生
成苗(图 2-c) ,而非转基因植株在抗性筛选培养基中不
能正常生长(图 2-d)。
图 2　多年生黑麦草的遗传转化
F ig . 2　The tr ansfo rm ation o f perennial ry egr ass
( L olium p er enne L . )
注: a-诱导愈伤组织, b-抗性愈伤组织(培养基含草丁膦)
c-抗性愈伤组织分化(培养基含草丁膦)
d-转基因植株(培养基含草丁膦)
e-野生型对照(培养基含草丁膦)
Note: a-Call i, b-Resis tant cal li in select ive medium contain ing
Glufosinate, c-Different iat ion of res istant calli in s elect ive med ium
containing Glufosinate
d-Regen erated plant in m edium con taining Glufosin ate
e-W ild plant as a cont rol in m edium con taining Glufosin ate
2. 3　PCR和 PCR-Southern 检测
黑麦草转化植株以基因组 DNA 为模板进行 PCR
检测,转基因植株可扩增得到约 530 bp 的 bar 基因特
异片段(图 3) ,与质粒扩增结果一致, 阴性对照没有特
异性扩增产物, 初步表明 bar 基因已整合到转基因黑
麦草基因组中,本研究获得了 18个 PCR阳性株系。对
P 5CSF129A 基因的 PCR 检测,有 5个转化植株中可
扩增到 1900 bp特异性片段,与质粒阳性对照相同(图
4)。这 5个植株也全部为 bar 基因检测的阳性植株。对
P 5CS 的 PCR-Southern结果显示(图 5) , 扩增得到的
PCR 产物均可与地高辛标记的 P5CS 探针产生特异
杂交信号,进一步证明 P5CS 确实整合到了转基因植
株的基因组中。本研究中18个 bar 基因阳性株系中检
测到 5 个 P 5CS 与 bar 基因双阳性的共转化株系, 共
转化频率为 27. 8% (表 2)。
图 3　转 bar 基因 PCR 检测
F ig . 3　PCR analysis o f bar tr ansgene
注: 1-11部分转基因植株, 12阴性对照, 13阳性对照。
Note: 1-11 part ial t ransgenic plants , 12 negat ive cont rol ,
13 posit ive cont rol
图 4　转 P5CS基因 PCR 检测
F ig . 4　PCR analysis o f P5CS tr ansgene
注: 1-8部分转基因植株, 9、10阳性对照, 11阴性对照
Note: 1-8 part ial t ransgenic plants , 9、10 posit ive cont rol ,
11 neg at ive cont rol
图 5　转 P5CS基因 PCR-Southern检测
Fig. 5　PCR-Southern analy sis o f tr ansgenic plant
注: 1-5部分转基因植株, 6阳性对照, 7阴性对照
Note: 1-5 part ial t ransgenic plants , 6 posit ive cont rol ,
7 negat ive cont rol
表 2　再生植株的诱导及检测
T able 2　The induction and assay o f plant r egener ation
轰击愈伤数
No. of bombarded
calli
抗性愈伤数
No. of r esis tant
cal li
可再生愈伤数
N o. of calli
r egenerated
B ar PCR检测
阳性株系数
No. of bar PCR
posit ive lines
P 5CS PCR检测
阳性株系数
No. of P 5C S PCR
pos it ive lines
B ar 遗传转化率
Frequ ency of bar
t ransformation
共转化频率
Co-tr ans form at ion
f requ ency
2500 180 78 18 5 0. 72% 27. 8%
3　讨　论
3. 1　种子的生理状态是影响成熟胚离体培养的重要
因素。严华君等( 1996)以未经吸胀的大麦干胚为外植
体得到良好的培养效果。干胚的生命活动基本上处于
静止状态,在表面消毒时能减轻消毒剂对胚的损伤, 这
可能有利于提高组织培养的效率[ 13]。黑麦草种胚小且
37第 1期 杨成民等:利用基因枪共转化法获得转 bar 与P 5CS 基因黑麦草
与内稃粘合, 造成种胚剥离困难, 种子也不易彻底消
毒。浸泡后,可方便种胚剥离。但长时间浸种, 种胚会利
用自身内源激素按原有模式发育, 外源激素很难诱导
其脱分化。在保证易剥离、彻底消毒的前提下, 尽可能
缩短浸种时间有利于提高黑麦草愈伤诱导率。低温
( 4℃)浸泡 3 h 效果较好。
3. 2　用成熟胚作外植体诱导愈伤组织易发生胚直接
发芽。由于草种的成熟度不一致,造成种子活力差异较
大。活力较强的种胚更易萌发而不易脱分化; 或者在愈
伤组织中存在绿色休眠状态的胚芽点, 一旦放入分化
培养基中就会出芽,造成假分化。因此有绿点的愈伤组
织不能作为受体材料用于基因枪转化。
3. 3　共转化方法无需将目的基因和选择标记构建在
同一个表达载体上, 选择标记与目的基因插入受体植
物基因组的不同位点, 通过有性杂交后代产生的分离
可将选择标记基因删除[ 9]。共转化目前已在紫花苜蓿
(M edicago sat iva L. )、烟草 ( N icotianna tabacum)、小
麦 ( T rit icum aesti vum L. )和大麦( H ordeum vulgare
Linn. )等农作物中应用, 获得大量的转多价基因植物。
共转化方法的转化率不稳定,随不同的转化事件、转化
技术、表达载体的构建方式和数量及受体等变化较
大[ 14 ]。唐克轩等以成熟胚为外植体,采用共转化方法将
含潮霉素抗性基因、GU S报告基因和雪花莲凝集三个
基因导入粳稻中, 共转化频率达到 73% [ 15]。戴顺洪等
在进行水稻 3个含不同基因的质粒载体的共转化研究
表明, 只有 12%的转基因植株中 3个目的基因同时发
生了转化 [ 16]。Dalton( 1998)用微弹轰击法建立了二倍
体多年生黑麦草、一年生黑麦草( L ol ium multif lor um)
和毒麦( L . temulentum L. )的转基因体系,转基因植株
共表达了 GUS 基因和 hp t 基因, 共转化频率达到
33%～63% [ 17]。本实验共转化频率较低,可能是以成熟
胚为外植体进行愈伤诱导, 获得的愈伤组织质量不高,
分化再生的效率低,同时 P5CS 基因片段较大, 完整整
合到植株上比较困难所致。
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38 草　地　学　报 第 13卷