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综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2006年增刊
草莓转基因研究进展
康厚祥 1, 2
姜丰 1, 2
杨国顺1, 2
( 1 湖南农业大学园艺园林学院,长沙
410128; 2 湖南农业大学细胞工程室,长沙
410128)


摘
要:
转基因是一项成熟的技术, 在草莓中得到广泛应用。本文综述了农杆菌介导的草莓转基因研究进
展。
关键词:
草莓
转基因
进展
Progress in Transgene of Strawberry
K angH oux iang
1, 2
Jiang Feng1, 2
Yang Guoshun1, 2*
( 1Ho ticulture and land scap e college of hunan agr iculture univers ity, Chang sha 410128;
2 cell eng ineering room hunan agr ilulture university, Chang sha 410128)


Abstrac:t
transgene is a m ature techn ique. it had been ing used in the plan t o f strawberry. This paper is a summ arize
o f advance o f transgene of strawberry.
Key words:
S trawberry
T ransgene
P rogress


作者简介:康厚祥 ( 1982-) ,男,硕士研究生,主要从事生物技术研究


通讯作者:杨园顺


草莓 (F ragaria ananassa Duch. )是一种营养价
值和经济价值都较高的多年生草本果树, 草莓果实
因其色、香、味俱全而受到广大消费者的欢迎。
N ahra
[ 1]于 1989年最早建立起草莓品种
Red-
coat
高效叶盘再生系统,不定芽再生率高达 94%。
为草莓的转基因技术奠定了坚实的基础, 并于 1990
年最早获得转基因草莓 [ 2]。开创了草莓转基因的
先河。从此以后许多学者获得了草莓的转基因植
株,如 Finstad[ 3]等获得了抗草莓黄叶病毒 ( straw ber-
ry m id ye llow edge v irus)的转基因植株, C raham [ 4]等
通过导入豇豆胰蛋白酶抑制剂 ( LpT i)基因获得了
抗虫植株。
将从草莓高效再生体系的建立与草莓转化体系
的建立,以及分子生物学方法在转基因草莓检测中
的应用等三大方面简单介绍国内外草莓转基因研究
进展。
1
草莓高效再生体系的建立
高效再生体系的建立是对草莓进行转基因的一
个关键性的前提,不同的草莓基因型,不同的草莓外
植体,不同的 pH值, 生长调节剂的种类、配比与浓
度,以及 AgNO 3对草莓叶片不定芽的再生具有显著
的影响。
1. 1
基因型对草莓再生能力的影响
张志宏 [ 5]、王海波 [ 6 ]等通过再生试验, 得出不
同草莓品种之间再生能力差异显著的结果。本人认
为基因型不同导致草莓细胞内的某些生理生化反应
产生差异,如内源激素水平的不同影响细胞信号传
导过程中的放大效应, 最终以细胞的脱分化和再分
化能力不同的形式表现出来。
1. 2
外植体类型对再生能力的影响
曾球 [ 7] ,吴雪梅 [ 8 ]等通过再生能力比较发现草
莓再生能力是叶片 (叶片叶龄为 30d) >叶柄。
1. 2
外植体大小与年龄对草莓再生能力的影响
于冬梅 [ 9]报导, 认为 20~ 30d的草莓叶龄为诱
导分化不定芽的最适叶龄, 而王海波 [ 6]报导, 叶片
以 28~ 40d的为适宜,不定芽分化率最高。
1. 3
pH值对草莓再生的影响
尹淑萍等的研究发现,再生培养基的 pH在 5. 4
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2006年增刊
到 6. 0之间对叶盘的再生效率无显著性的差异。
1. 4
生长调节剂的种类、配比与浓度对草莓叶片分
化不定芽的影响
闫华晓 [ 11] 报导, 丰香的叶片在 MS + TDZ2.
0mg /L+ 2, 4-D0. 1mg /L 培养基上再生频率可达
64%, TDZ可能是
丰香
和
鬼怒甘
再生出芽的主
要影响因素。王建湘 [ 12 ]发现
丰香
和
红丰
两个
品种在 TDZ1. 5mg /L + NAA0. 05mg /L的培养基上
再生分别达到 72. 3% 和 66. 7%。吴雪梅 [ 13]发现

丰香
和
章姬
的最佳培养基分别为: 丰香叶片在
MS+ TDZ2. 0mg /L + IBA 0. 8mg /L下诱导不定芽比
率达 75. 67%,章姬在 MS+ 6-BA2. 0 mg /L + IBA0.
4mg /L下不定芽诱导率为 8. 33%。蔡琴芳 [ 14]研究
发现, 章姬在 TDZ8. 0mg /L时再生率最高为 60. 5%
丰香则在 TDZ2. 0mg /L时再生率最高为 58% , 并确
定 TDZ1. 0mg /L + NAA0. 05mg /L的培养基为草莓
基本的再生培养基。张利义 [ 15]等研究发现, 全明星
在 MS+ TDZ1. 5mg /L + NAA 0. 05mg /L再生效果
好,再生率高达 86. 6%, 魏源文 [ 16]等研究发现, MS
+ TDZ2. 0mg /L+ IAA0. 25mg /L使丰香再生率达到
88%。王密恰 [ 17]研究发现
全明星
、
新明星
两
个品种在 TDZ1mg /L + NAA0. 05mg /L培养基上再
生率分别达到 93%和 96. 7%。综上所叙述, TDZ1.
0~ 3. 0 mg /L + NAA0. 05~ 0. 25mg /L或者 TDZ1. 0
~ 2. 0mg /L + BA 0. 1~ 0. 8mg /L为草莓较好的不定
芽诱导培养基。
1. 5
AgNO3对草莓叶盘不定芽再生的影响
AgNO3作为乙烯合成的抑制剂,可有效的防止
植物细胞在离体培养过程中乙烯的积累对外植体生
长和不定芽分化的影响,显著提高植株的再生频率,
陈琴芳 [ 14]报导 AgNO 3的浓度过高 ( > 12mg /L )则分
化率显著降低, 这可能是因为 Ag+为重金属离子,
浓度过高对植物有毒害作用。
2
草莓转化体系的建立
2. 1
外植体对转化效率的影响
2. 1. 1
外植体的基因型
陈琴芳 [ 14]报导,草莓品
种丰香和章姬在同样的培养和转化条件下, 章姬分
化出抗性芽的比率为 3. 2%,丰香为 2. 5%。本人认
为草莓不同品种的基因型不同导致农杆菌介导的目
的基因片段插入的位置和数量的不同, 以及基因型
的不同导致的草莓外植体再生芽的能力不同这两方
面对转化产生影响。
2. 1. 2
外植体大小以及年龄对转化效率的影响

本人认为叶片大小与年龄直接影响到草莓叶盘的再
生。从而间接性地影响转化的效率。
2. 2
预培养时间对转化效率的影响
尹淑萍 [ 10]报导,草莓叶片预培养 4d后,叶盘边
缘细胞开始旺盛分裂,此时对农杆菌的侵染较敏感,
有利于 T-DNA 的整合。当预培养时间过长时
( 6d) ,细胞已处于转化的不敏感期, 不利于农杆菌
的侵染及 T-DNA的整合, 使转化频率降低。袁维
风 [ 18]报导,预培养时间为 2~ 4d时, 其转化效果较
好。未经预培养的叶片转化效率低下。
2. 3
农杆菌浸染对转化效率的影响
2. 3. 1
农杆菌的浓度
闫华晓 [ 19]报导, 菌液的浓
度过高或过低,均不利于其转化,浓度过高就会导致
受体被农杆菌感染致死, 浓度过低就没有足够的农
杆菌附着于外植体切口处导致转化细胞数量很低。
袁维风 [ 18]报导 OD值为 0. 3~ 0. 5的工程菌侵染液
对草莓的遗传转化最适宜。
2. 3. 2
农杆菌侵染的时间
闫华晓 [ 19]研究表明,
在 OD600nm为 0. 5的条件下, 叶盘在菌液中浸染时间
对转化率有一定的影响。浸泡时间少于 5m in时, 虽
然芽再生率高, 但达不到转化的目的, 浸泡 10 ~
15m in,抗性芽再生的效率较高。浸泡时间达到
30m in以上时,叶片受伤害程度严重, 并且农杆菌在
共培养时大量繁殖,脱菌困难。侵染 10m in是较适
宜的。但 K. A. Schestibratov, S. V. Do lgov[ 20]所用
浸染时间为 30m in。陈琴芳 [ 14]报导,当农杆菌接种
时间达 20m in时,转化芽再生率达最高值,丰香转化
芽再生频率达 3
2%, 章姬转化芽再生频率达
2
59% ,接种时间延长至 30m in时,抗性愈伤和芽的
形成数量略有下降, 得出 15~ 20m in为最佳接种时
间。由此推测,最佳侵染时间可能与不同的转化材
料和农杆菌株以及工程菌液的浓度有关。
2. 3. 3
AS对转化转化效率的影响
尹淑萍 [ 10]报
导,经 AS浓度为 100mg /L处理的叶柄,转化频率由
对照的 8. 33%提高到了 18. 33%。袁维风 [ 18]报导,
其通过试验表明 AS等酚类化合物对农杆菌转化是
十分有利的,当 AS浓度为 100mg /L时,对转化效果
68
2006年增刊 康厚祥等: 草莓转基因研究进展
较好, 并发现将 SA加入菌液中的转化效果好于加
入共培养基中。
2. 4
共培养对转化效率的影响
陈琴芳 [ 14]报导,
农杆菌感染后立即进行选择,抗性愈伤诱导率和芽
再生频率均低,而共培养 1d后, 抗性愈伤诱导率和
芽再生频率均大幅度提高;共培养 3d达最高值,丰
香抗性愈伤率为 39% ,芽再生频率为 3. 4% ,章姬抗
性愈伤率为 30%,芽再生频率为 2. 6%。尹淑萍 [ 10]
报导, 对于农杆菌 LBA 4404介导的转化,共培养在 2
~ 4d为合适的共培养时间。袁维风 [ 18]报导, 共培
养 2d时转化效率最佳,而当共培养时间为 6d时, 农
杆菌大量繁殖,脱菌困难。
2. 5
延迟培养与选择性培养
袁维风 [ 18]报导,延迟二周筛选的转化效率较对
照有显著的提高,延迟一个月时, 由于时间过长,使
大量的非转化细胞对转化细胞形成强大的竞争压
力,容易形成嵌合体。因此, 对于草莓叶盘的转化,
共培养之后不宜立即进行抗性筛选, 而在脱菌培养
基中恢复生长一定阶段, 对于获得转化体很重要。
后期选择时,抗生素能够有效地淘汰假阳性的不定
芽。
3
分子生物学方法在草莓转基因检测中的
应用
3. 1
外源基因整合的鉴定
此过程包括草莓组织总 DNA 的提取、组织
RNA的提取、PCR技术、Southen杂交、PCR-Southren
杂交检测以及 RFLP和 RAPD分析技术对外源基因
整和的分析。
3. 2
外源基因表达的检测
基因表达分为转录以及翻译阶段, 转录是以
DNA为模板生成 mRNA的过程, 翻译是以 mRNA为
模板生成蛋白质的过程, 检测外源基因的表达就是
检测特意 mRNA以及特意蛋白质的生成 [ 21 ]。所以
分为两部分: 一是转录水平上对特异 mRNA的检
测,主要的方法是 Northen杂交。二是翻译水平的
检测,方法有三种, 一是生化反应检测法: 主要通过
酶反应来检测;二是免疫学检测:通过目的蛋白与抗
体的特意性结合进行检测,具体方法有免疫沉淀,酶
联免疫以及 Western杂交等方法; 三是生物学活性
的检测 [ 9] : 接种菌株或者将转基因植株移栽入病圃
中对其进行病害胁迫, 观看并统计其抗性结果。并
与对照苗相对比,得出转基因植株的抗性效果。
参 考 文 献
1
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21
王关林,方宏筠. 北京:科学技术出版社, 1998. 6: 368~ 460.
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