全 文 ：氨基酸 L-和 D-异构体对离体小麦胚植株生长的影响*
李友勇 孙海丽 罗姗
(河南科技学院生物技术系,新乡 453003)
摘 要: 5 种氨基酸 L-和 D-异构体对离体小麦胚植株生长的影响结果表明, 在 1~ 7 mmol # L - 1浓度范围
内,脯氨酸异构体均不抑制植株生长; 缬氨酸和蛋氨酸的 L-型严重抑制生长, D-型不抑制或轻微抑制;丙氨酸则相
反, L-型无抑制作用, D-型是严重抑制类型;丝氨酸的 L-型轻微抑制生长, D-型严重抑制生长。生长结果也表明,
DL-异构体的抑制作用介于 D-型和 L-型之间。
关键词: L-氨基酸 D-氨基酸 DL-氨基酸 小麦胚胎 反馈抑制
Influence of L- and D-Isomers of Amino Acids on Growth
of Wheat Embryos Seedling in vitro
Li Youyong Sun Haili Luo Shan
( Dep ar tment of Biot ech nology , H enan I nsti tu te of S cie nce and T echnolog y , X inx ian g 453003)
Abstract: By the studying of the influence o f D- t ype and L- type isomer s o f five kinds of amino acids on w heat
seedling in vitr o , the results showed that in t he range o f concentrat ion of 1~ 7 mmo l# L- 1 , t he isomers o f proline
had no suppression on the seedling s. L- type isomer of valine and methionine inhibited seedling g rowth severely, but
their D- type isomers did not inhibit o r inhibited but lightly . Fo r ser ine and alanine, their D- t ype isomer s inhibited
gr ow th severely, but L- type did not or light ly. The r esult s also show ed that the inhibition effect of DL- type methio-
nine, ser ine and a lanine were medium betw een D- type and L- types.
Key words: L- am ino acid D-amino acid DL-am ino acid Wheat Embryo Feedback inhibit ion
氨基酸作为附加成分在促进生长、植物氨基酸抗性筛选等组织培养中得到普遍应用,如脯氨酸可提高小
麦愈伤组织诱导率[ 1] ,苏氨酸、赖氨酸等是本身的抗性选择剂 [ 2~ 4]等。氨基酸作为选择剂的机制一般认为是
反馈抑制,当外植体在高浓度外源氨基酸中生长, 可导致体内氨基酸浓度提高 [ 5] ,体内氨基酸浓度提高可抑
制有关合成途径调节酶活性, 这种抑制若时间较长,可导致代谢失调,表现在个体上会出现生长延缓、停滞等
/毒害0现象[ 3, 6]。调节酶反应迟钝的基因型,相同氨基酸浓度下的反馈抑制作用不发生或较轻发生, 因此个
体生长被抑制的现象明显为轻。由于酶的专一性, 上述反馈抑制作用的抑制剂一般应是 L-氨基酸[ 7] ,有时
是类似物。但是我们在试验中发现, 对试管植株起抑制作用的, 有的氨基酸是 L-型, 有的是 D-型。如丙氨
酸, L-型在 7 mmol # L-1以下浓度几乎不抑制生长,但相同浓度的 D-异构体严重抑制生长。这些现象引起了
我们的注意,如果 D-型异构体也抑制生长,这说明 D-氨基酸在植物体内也有其生理效应。关于 D-型氨基酸
对植物的作用, 国内外文献报道极少,国外仅在拟南芥上有少量试验研究[ 8] 。为了进一步了解不同氨基酸在
植物体内的作用,试验选用了 5种氨基酸,它们是脯氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、丙氨酸和丝氨酸。脯氨酸、蛋氨酸
和缬氨酸是必需氨基酸, 已知其合成代谢具有反馈抑制机制, 丙氨酸和丝氨酸是非必需氨基酸,过去研究认
为不具反馈抑制 [ 7]。试验通过对小麦胚试管幼苗生长的影响,来了解这些氨基酸在植物体内的生理特性。
收稿日期: 2005-11-18
* 基金项目:河南省自然科学基金资助项目( 0511031100)
作者简介:李友勇( 1955- ) ,男,硕士,教授,主要从事遗传学、生物技术等课程教学和外源基因向小麦转移、小麦试管氨基酸抗性选择研究,
在《遗传》、《华北农学报》、《生物技术》等刊物发表论文 20余篇。Email: liyouyong@ 163. com
生物技术通报
# 研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 1期
1 材料和方法
1. 1 材料
实验材料为普通小麦( T ri ti cum aest iv um L)河南主栽品种/豫麦 180,氨基酸试剂主要购自中国医药集
团上海化学试剂公司,其中 D-丙氨酸是北京化工厂产品; DL-脯氨酸是匈牙利进口产品, L-丝氨酸和 D-丝氨
酸是美国新泽西进口产品。
1. 2 方法
1. 2. 1 培养基 对照培养基成分为: N 6基本培养基, 附加 0. 1mg # L - 1 IBA, 3%蔗糖, 0. 8%琼脂, pH 值为
5. 8~ 6. 0。
氨基酸处理浓度为: 在对照培养基基础上附加 1、3、5、7、9 mmol # L - 1的氨基酸, 其中抑制作用强的 D-
丙氨酸浓度设为 1、3、5 mmol # L- 1 , L-缬氨酸和 DL-蛋氨酸为 1、3、5、7 mmol # L- 1。
1. 2. 2 材料处理 小麦种子经无菌处理( 75%乙醇 1 min. , 0. 1% HgCl27 m in. , 无菌水冲洗 4次)后浸泡
24小时,按常规无菌接种方法将胚接种在培养基上,每个处理接 8个试管,每管 3粒胚,重复 3次。
1. 2. 3 培养条件 培养温度为 20~ 25 e ,湿度 75%左右, 光照度 1 000Lx~ 1 400Lx,光照时间 12h # d-1。
1. 2. 4 生长转换试验 为了深入了解氨基酸抑制生长的特性, 把接种后 3天(此时,不作处理的对照根长和
苗高有 2~ 3cm 以上,处理植株生长抑制现象已明显,严重的不发芽)的受抑制比较强烈的 3 mmol # L- 1D-
丝氨酸、5 mmol # L- 1D-丙氨酸和 5 mmo l # L - 1L-缬氨酸处理中的植株转移到未加氨基酸的对照培养基中,
以检测生长恢复情况。
2 结果与分析
试验中观察到, 接种后 3天各处理的生长差异反应即显示出来, 一周后的差异更显著, 并持续到一个月
以上不会改变。培养 2周后的对照植株叶片已达试管顶部并弯曲下来。因此, 文中使用接种后 14~ 16d的
生长结果。每个处理分别取 10株试管植株, 量其根长(分蘖节至最长根尖处)和茎叶长(分蘖节至最长叶尖
处) , 并用根叶总长度做生长趋势图(图 1~ 图 5)。从图 1到图 5以及生长观察,可看出以下几点结果。
2. 1 脯氨酸
脯氨酸的两种异构体和 DL-脯氨酸在不同处理下均不表现生长抑制作用, L-脯氨酸和 DL-脯氨酸甚至
有一定的促进作用( 图 1 )。
2. 2 蛋氨酸
蛋氨酸是天冬族氨基酸,植物中天冬族氨基酸的代谢机制已比较明确 [ 9] ,试验进一步证实了蛋氨酸的反
馈抑制作用, L-型有较强的生长抑制作用, D-型异构体浓度在 5 mmo l# L - 1以内生长差异不显著, 7 mmol #
L
- 1以上浓度也有抑制发生( P< 0. 5) , 但总体较轻。DL-型产品处理的生长量介于 L-型和 D-型之间(图 2)。
2. 3 缬氨酸
缬氨酸也是必需氨基酸, 在生化代谢中也具反馈抑制效应,结果不但证实该代谢机制的存在, 而且还显
示出它有比蛋氨酸更强的抑制作用,其 L-型异构体在 1 mmol # L-1时抑制作用已经出现,到 3mmol # L-1时,
植株生长几乎完全被抑制( 图 3 )。D-异构体在 5 mmol # L- 1时的抑制作用仍很小, 7 mmol # L - 1浓度时有
中等抑制强度。
2. 4 丙氨酸
丙氨酸过去的研究认为没有反馈抑制机制[ 7] , 试验证实该结论。L-丙氨酸至 7 mmol # L - 1浓度内不具
抑制效应,植株未发生生长抑制现象,但 D-丙氨酸与 L-缬氨酸一样, 有强烈的生长抑制效应, 1~ 5 mmol #
L
- 1浓度生长量直线下降。DL-丙氨酸的生长抑制程度处在 L-型和 D-型之间偏重 D-型(图 4)。
74 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
2. 5 丝氨酸
丝氨酸在过去的生化研究中被认为没有反馈抑制机制[ 7 ] ,但在试验中发现丝氨酸的 L-型和 D-型都有抑
制生长作用,而且 D-型异构体的抑制作用更强。同时看出, DL-型丝氨酸的生长介于 L-型和 D-型之间
(图 5)。
图 5 小麦植株对丝氨酸的生长反应
2. 6 受抑制的植株生长恢复结果
当把 3 mmol # L- 1D-丝氨酸、5 mmol # L- 1D-丙氨酸和 5
mmo l # L- 1 L-缬氨酸处理中的植株转移到未加氨基酸的对照
培养基中后,植株可恢复生长。表现为转移第 2天开始明显生
长,第 3天后生长速度接近对照水平, 相比较, 在原处理中的植
株生长量甚小(表 1)。
3 结论与讨论
根据上述结果, 其中 4点分析值得讨论:
3. 1 源脯氨酸对离体小麦幼苗生长影响较小
脯氨酸 3种异构体对离体小麦植株生长都不具抑制作用,
并且有一定程度上的促进生长作用, 该结果说明植物细胞可忍
752006年第 1期 李友勇等: 氨基酸 L-和 D-异构体对离体小麦胚植株生长的影响
耐较高浓度的外源脯氨酸。过去有大量研究指出胁迫下植物细胞中脯氨酸可积累,因此把细胞内脯氨酸浓
度作为植物抗逆性的一个重要生理指标,试验结果从另一角度证实植物的这一特性,高剂量的外源脯氨酸可
使体内脯氨酸积累, 但对植物生长无害。
表 1 处理中生长 3天的植株转移到 CK后的生长恢复情况
氨基酸 处理/浓度
( mmol # L - 1)
植株部位 转移后的天数和日生长量/ cm
0 1 2 3 4 5 6 7 8
CK 无处理/ 0 叶 2 2. 5 2 1. 2 0. 3* 1. 3 3 3 0. 3
根 1 0. 7 0. 8 1. 6 1. 5 1. 8 1. 8 1. 1 0. 8
D-Ser 转移的/ ( 3→0) 叶 1 1. 1 1. 7 1 1. 3 1. 2 1. 6 1. 3 1
根 0. 3 0. 5 0. 7 1. 7 2. 2 1. 5 1. 5 1 0. 5
未转的/ ( 3) 叶 1 0 1. 1 1. 3 0. 1 0. 3 0. 3 0. 5 0. 4
根 0. 3 0 0 0 0. 2 0 0 0 0
D- Ala 转移的/ ( 5→0) 叶 2 1. 8 2 1. 2 1. 4 1. 6 1. 4 1. 8 -
根 1. 5 0 0 0. 1 0. 6 1. 2 1 1. 5 -
未转的/ ( 5) 叶 2 0. 7 1 1 0. 2 0 0. 2 0 0
根 1. 5 0. 5 0. 2 0. 1 0 0 0 0 0
L-Val 转移的/ ( 5→0) 叶 3 0. 3 0. 6 1. 3 1. 7 1. 8 1. 2 1. 2 1. 4
根 2 0 0. 5 0. 7 1 1. 2 1 1 0. 7
未转的/ ( 5) 叶 1. 2 0. 2 0 0 0 0. 1 0 0 0
根 2 0. 5 0. 3 0. 2 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1
* :一些植株第一叶生长到定长,当第二叶未超出第一叶时,在总株高上增加较小
3. 2 蛋氨酸和缬氨酸表现出正常的反馈抑制
蛋氨酸和缬氨酸是 L-型异构体抑制生长,这与过去的试验结果一致[ 10] , 与生化研究的反馈抑制原理也
一致[ 7] 。蛋氨酸的抑制强度低于缬氨酸, 这可能是因为蛋氨酸抑制的天冬氨酸激酶( AK Ⅲ)有同工酶( AK
Ⅰ和 AKⅡ) [ 9] ,而缬氨酸抑制的酶是乙酰乳酸合酶,该酶没有同工酶。
3. 3 D-丙氨酸和 D-丝氨酸有强烈的生理抑制作用
D-丙氨酸和 D-丝氨酸的作用很值得关注。如前所述,过去研究认为该两种氨基酸的 L-型是非反馈抑制
氨基酸,试验证实在一定浓度范围内确是如此。但该浓度范围内其 D-型异构体则强烈抑制植物生长,这种
现象过去报道的不多。翟勇平等发现 D-丙氨酸对人的白血癌细胞有杀死作用[ 11] , Oskar 等报道 D-丙氨酸
对拟南芥有/毒0 [ 8]。至于 D-丙氨酸和 D-丝氨酸抑制植物生长的机制, Oskar推测可能是蛋白质合成中与L-
丙氨酸的竞争抑制。生长恢复试验表明 D-丙氨酸可能有反馈抑制调节的功能, 因为包括 D-丝氨酸, 二者对
植株根、叶生长抑制的发生时间( 1~ 3d即表现)、反应的浓度范围( 1~ 7 mmo l # L- 1 )、抑制程度(属强抑制
型) , 均和其它 L-型氨基酸的抑制现象一致 [ 10] ,并且其生长抑制是可恢复的, 这是酶代谢抑制的一种典型表
现。因此认为, D-丝氨酸和 D-丙氨酸可能存在与多数 L-型氨基酸一样的反馈抑制机制, 但这种抑制的酶学
机制和作用受体等有待深入探讨。
3. 4 DL-氨基酸作用介于 D-型和 L-型之间
试验结果的另一个十分有趣的现象是有抑制作用的三种氨基酸(蛋氨酸、丙氨酸和丝氨酸) , 其 DL-型的
作用大体介于 D-型和 L-型之间,换句话说, 胚试管植株在 DL-型处理中的生长量是约是相应的 1/ 2的 L 型
+ D-型生长量。由于 DL-型是 D-型和 L-型的等量混合物,这说明 DL-型氨基酸对离体植株起作用的成分是
相应的 L-型(蛋氨酸)或 D-型(丝氨酸和丙氨酸)氨基酸。
参 考 文 献
1 陈克贵,朱庆麟.武汉植物研究, 1993, 11( 1) : 67~ 71.
2 M ol ina SM G, Gaziola SA, Lea PJ, Azevedo RA. S cient ia Agricola, 2001, 58: 205~ 211.
3 Brig ht SW , M illin BJ, Rognes SE. Bioch em genet , 1982, 20: 229~ 243.
4 耿瑞双,缪树华,何立明.应用与环境生物学报, 1995, 1( 1) : 1~ 6.
76 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
5 武雪萍, 刘国顺, 朱凯,等.中国农业科学, 2004, 37( 3) : 357~ 361.
6 张春义,杨汉民.兰州大学学报(自然科学版) , 1994, 30( 3) : 92~ 96.
7 王镜岩,朱圣庚,徐长发. 生物化学(第三版)下册[ M ] .北京:高等教育出版社, 2002, 8: 340~ 375.
8 Oskar Eeikson, Magnus H ert zb erg, Torgny Nasholm. Nature biotechnology, 2004, H T TP: / / w ww . nature. com/ natu re biotechnology.
9 Azevedo R A, Arruda P, Tu rner W L, et al. Phytochemist ry, 1997, 46: 395~ 419.
10 李友勇,刘金枝,陈利. 生物技术, 2004, 14( 5) : 84~ 85.
11 翟勇平,王健民,张雨生,等.第二军医大学学报, 2002, 23( 2) : 163~ 165.
# 国外动态#
泰国恶性疟原虫中存在多重抗药基因
Nature 2004年 430卷 7000期 627页报道:在泰国边境, 由严重危害人体健康的恶性疟原虫(镰状疟原
虫) ( Plasmodium f alcip ar um )的抗药种类引起的恶性疟疾十分流行。目前泰国常的治疗恶性疟疾的药物
是甲氟喹和青蒿琥酯。一般而论, 这两种药联用时的抗疟效果是比较好的。但其中的甲氟喹已经在泰国使
用了 20年之久。现已发现,单独使用的甲氟喹已经丧失了疗效。迄今还不了解恶性疟原虫的抗药机理。
根据柳叶刀( Lancet)杂志的报道( 2004, 364, 438~ 447) , Ric N Price 等现已证明,恶性疟原虫的抗药性
与遗传有关。Price 等对泰国的 618例恶性疟疾病人对抗疟药的反应,已进行了长达 12年的观察。结果发
现,这些病人所感染的恶性疟原虫存在一种特定的基因,即恶性疟原虫多重抗药基因-1( p f mdr1)的拷贝。
这些病人对于甲氟喹或甲氟喹+ 青蒿琥酯都有高度的抗药性。
Price等预期,今后通过对恶性疾病人体内的 p f mdr1基因拷贝数量的监测,将不仅有助于恶性疟原虫
抗药性的流行病学调查, 而且也有助于判断恶性疟疾病人治疗的预后。 汪开治
蓬勃发展中的西澳大利亚生物技术
Nature 2004年 129卷 6991期增刊 A18页报道: 西澳大利亚是澳大利亚联邦的一个州。其面积为 2. 5
百万平方公里(一百万平方英里) , 海岸线长 13 500公里, 地跨亚热带和温带, 是全世界最大的生物群落分布
地之一,也是全世界最大的礁群系统之一。
在最近 10年中,西澳大利亚州在人类和动物生物医学、农业生物技术、环境生物技术、生物浸矿和湿法
冶金工艺和生物信息学等诸方面, 均取得了长足的发展。
现今,西澳大利亚州已拥有众多处于生物技术研究、开发和商业化前沿的公司、机构和科学家。西澳大
利亚州的生物技术工业拥有约 140个企业,包括核心生物技术公司和参与生物技术服务的公司。
西澳大利亚州拥有强大的生物技术研究基础。在当地的 5个主要的大学, 国家农业生物技术中心, 以及
众多的生物医学研究所包括 Lion眼科研究所、儿童保健研究所、西澳大利亚医学研究所和西澳大利亚生物
医学研究所中, 目前都在进行着世界级生物医学和农业生物技术研究。此外,在西澳大利亚州的越来越多的
生物技术公司中,目前也在进行着生物技术研究和开发。
西澳大利亚州的政府和民间的各种生物技术研究机构,正在对一些有关国计民生的重大生物技术项目,
包括病虫草害的生物防治、羊毛品质的改良、矿物的开采和冶炼、电信和海洋工程,开展合作性研究。 汪开治
772006年第 1期 李友勇等: 氨基酸 L-和 D-异构体对离体小麦胚植株生长的影响