全 文 ：·综述与专论· 2013年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase ：oxidor-
eductase，DAAO，EC 1.4.3.3）是一种以黄素腺嘌呤
二核苷酸（FAD）为辅基的典型黄素蛋白酶类，可
氧化 D-氨基酸生成相应的酮酸和氨，同时还原型
FAD 被氧化生成过氧化氢［1］。由于它对催化反应
底物有高的立体异构选择性和广谱性，可以广泛用
于 D-氨基酸的定性、定量分析、生物传感器，以
及 L-氨 基 酸 和 α-酮 酸 的 生 产。20 世 纪 90 年 代，
DAAO 在生物酶催化方面得到应用，主要是用于两
步法转化头孢霉素 C（cephalosporin C，CPC）生产
7-aminocephalosporanic acid（7-ACA）［2］，其中广泛
用于工业生产的 D-氨基酸氧化酶主要是来自三角酵
母（Trigonopsis variabilis） 的 TvDAAO［3］ 和 纤 细 红
酵母（Rhodotorula gracilis）的 RgDAAO ［4］。
然而，由于受其来源、活性、反应温度、pH 及
收稿日期 ：2013-06-04
基金项目 ： 河北省自然科学基金项目（C2011205045），河北省科技支撑项目（10205521D），河北省留学回国人员资助项目（20100705），
河北省高等学校科学技术研究青年基金项目（2011102），河北师范大学重点基金项目（L2012Z12）
作者简介 ：赵冉冉，女，硕士研究生，研究方向 ：分子酶学 ；E-mail ：867330310@qq.com
通讯作者 ：徐书景，女，副教授，硕士导师，研究方向 ：食品生物技术 ；E-mail ：shujingxu@163.com
D-氨基酸氧化酶结构的研究进展
赵冉冉  冯利伟  张金秀  徐书景  鞠建松
（河北师范大学生命科学学院，石家庄 050024）
摘 要 ： D-氨基酸氧化酶氧化 D-氨基酸生成相应的 α-酮酸和氨，还原型黄素被氧化生成过氧化氢。D-氨基酸氧化酶在精神
分裂症的病理、生理学研究和 D-氨基酸检测等方面都发挥着关键的作用。主要就结构已解析的几个 D-氨基酸氧化酶的序列同源性、
结构组成、活性中心、抑制剂以及与辅酶 FAD 结合能力等方面进行介绍。
关键词 ： D-氨基酸氧化酶 结构组成 活性位点 抑制剂 FAD
Research Progress on the Crystal Structure of D-amino Acid Oxidase
Zhao Ranran Feng Liwei Zhang Jinxiu Xu Shujing Ju Jiansong
（College of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024）
Abstract:  D-amino acid oxidase catalyzes oxidative deamination of D-amino acids yielding α-keto acid and ammonia, the reduced flavin
is reoxidized to generate hydrogen peroxide by molecular oxygen. D-amino acid oxidase plays a key role in the pathophysiology of schizophrenia
research and D-amino acids detecting. Based on the three-dimensional structure of analyzed D-amino acid oxidases, the property of the enzyme
could be improved by rational protein design. In order to get a better understanding of D-amino acid oxidase, the sequence homology, overall
structure, the active site center, inhibitor, FAD binding site and flexible parts of DAAO were introduced.
Key words:  D-amino acid oxidase Overall structure Active site Inhibitor FAD
稳定性等多方面因素的影响，酶蛋白的使用常常受
到一定程度的限制。为了克服这些不利因素，越来
越多的研究者开始关注酶蛋白的三维结构与功能之
间的关系，根据酶蛋白的三维结构信息，选择性地
改变某些氨基酸位点，使其空间结构发生改变，从
而达到提高酶蛋白对高温、酸、碱等的耐受性，降
低金属离子和抑制剂对酶蛋白的影响，增强酶蛋白
的催化反应活性。迄今为止，已有 3 种 D-氨基酸
氧化酶的三维结构得到解析，它们分别是来自猪肾
的 pkDAAO（PDB ID ：1VE9，1DDO，1KIF）［5-7］、
纤 细 红 酵 母 的 RgDAAO（PDB ID ：1C0I，1C0K，
1C0L）［4-8］ 和 人 源 的 hDAAO（PDB ID ：3CUK、
3G3E 和 2E48）［9-11］。本研究综合分析已解析的 3 个 D-
氨基酸氧化酶的三维结构，充分了解酶蛋白的催化
机制，为改造和利用酶蛋白提供理论依据。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期28
1 序列分析
猪、 红 酵 母 及 人 源 基 因（pkDAAO、RgDAAO
和 hDAAO）的核苷酸序列长 1 020 bp、1 104 bp 和
1 044 bp，分别编码 340、368 和 348 个氨基酸，理
论分子量分别为 38.6、40.0 和 39.6 kD（表 1），等
电 点 分 别 为 6.5、8.2 和 6.4，［G+C］ 含 量 分 别 为
53.9%、62.5% 及 55.0%。Kawazoe 等［12］ 和 Holm
等［13］研究发现人类与猪之间 DAAO 亚基的 Dali 分
数为 54.2（340Cα 的均方根偏差为 0.6Å），核苷酸序
列同源性为 87.7%，氨基酸序列同源性为 85% ；人
类与酵母的 DAAO 亚基之间的 Dali 分数为 39.1（319
Cα 的均方根偏差为 1.9Å），核苷酸序列同源性为
43.2%，氨基酸序列同源性为 28.9%［12，13］；pkDAAO
和 RgDAAO 的核苷酸同源性为 46.9%，氨基酸同源
表 1 猪、人类及酵母的 D-氨基酸氧化酶的基本性质的比较
pkDAAO RgDAAO hDAAO
Length（bp） 1020 1104 1044
M.W.（kD） 38.6 40.0 39.6
Amino acid residues 340 368 348
Chains A，B A A，B，C，D
Resolution［Å］ 2.50 1.90 2.20
Oligomerization dimer/mutilmer dimer dimer
Active site residues Y224，Y228，R283 Y223，R285，Y238 Y224，Y228，R283
Substrate D-Pro D-Met D-Ala
GenBank No. 8864836 12445787 19438227
性为 27.8%。
2 结构组成
猪、红酵母及人源 DAAO 都是由两个相同亚基
组成，每个单体含有一个非共价键结合的 FAD 分
子［14］。猪源 DAAO 的结构显示了几乎所有 DAAO
的普遍特征（图 1-a），以猪源 DAAO 为例，每个亚
基明显分为两个区域，即辅酶 FAD 结合区域（氨基
酸残基 1-63，141-183 和 294-339）和界面区域（氨
基酸残基 64-140 和 184-293），由 8 股 β-折叠构成（图
1-b）。DAAO 的两个亚基以一个双重轴连接形成一
个紧密的二聚体（图 1-c），单体可触及表面约 15%
（1512Å2）包埋在接触区域形成的界面域［5］。由于 C
末端 340-347 位的氨基酸残基的无序性及在电子密
度图上的不可见，这个片段属于 C 端 2 kD 大小的短
肽，这个片段被限制性蛋白酶水解切除后并不影响
酶蛋白的催化性能［15］。
人 源 hDAAO 的 亚 基 由 11 个 α-螺 旋 和 14 个
β-折 叠 构 成 FAD 结 合 域 和 界 面 域， 有 30 个 氨 基
酸 残 基 位 于 二 聚 体 界 面， 其 中 10 个（33%） 位
点 与 pkDAAO 不 一 致， 剩 余 20 个 氨 基 酸 位 点 与
pkDAAO 保守。RgDAAO 二级结构的拓扑结构，包
β1
2
β1
3
β1
1
β1
5
β1
6
β1
7
β1
4
β1
8
βF
5
βF
6
βF
4
βF
1
βF
2
βF
3
αF3
αF1
αF
2
αI
1
αI3
αI2
C
INTERFACE
DOMAIN
FAD-BINDING
DOMAIN
N
C
N
a
b
c
C
N
119 122
116 131 97 216 228 239
196
255 263
285
274206236231213
78
89139
141
63
22
10
189
180
315
309
301 298176
172
167
158
154
163 36 6
31 2
294
183
112
αF
5
αF
4
图 1 （a）DAAO 亚基与苯甲酸结合的立体图（b）DAAO
二级结构的拓扑结构（c）DAAO 二聚体沿双重轴观测图［5］
2013年第12期 29赵冉冉等 ：D-氨基酸氧化酶结构的研究进展
括 11 个 α-螺旋和 13 个 β-折叠，其整体结构类似于
pkDAAO［5，6，8］，不过，与 pkDAAO 不同的是，Rg-
DAAO 的头部区域有 3 个额外的短螺旋，这些短螺
旋 分 别 为 I1，I3 和 I3［5-8］。RgDAAO 和 pkDAAO
之间主要的拓扑结构差异也很明显 ：pkDAAO 是
由 11 个残基构成的活性中心环与 βI5 和 βI6 相连
接，而 RgDAAO 则以含 6 个残基的活性中心环与
βI5、βI6 相连接 ；而且 RgDAAO 的 C 末端存在着一
个由 21 个氨基酸残基构成的环状结构（连接 βF5
和 βF6），这个环状结构不存在于其他任何已知的
DAAO 结构中［8］。
研究发现，DAAO 的二聚体界面区域的表面
电位互不相同，hDAAO 的二聚体界面带负电荷，
pkDAAO 则带正电荷。而 RgDAAO 表面电位与前二
者都不相同，RgDAAO 中一个单体的 F5-F6 环带正电；
另一个单体的 α-螺旋 I3 和 I3 带负电荷（图 2）［13］。
这使得 RgDAAO 的二聚体结合模式（头 - 尾结合［8］）
与 哺 乳 动 物 来 源 的 DAAO 完 全 不 同（ 头 - 头 结
合［13］），RgDAAO 的单体与单体作用区域达到 3049
Å2， 约 为 pkDAAO 的 两 倍（1512 Å2）［13-16］。Molla
等［17］研究发现，hDAAO 的寡聚合状态也和 pkDA-
AO 不同，在 1-24 mg/mL 的浓度范围下 hDAAO 总
是以二聚体形式存在，而 pkDAAO 则表现为蛋白浓
度依赖型的寡聚合状态。Pellegioni 等［16］研究发现
RgDAAO 的单体通过二聚作用形成稳定的黄素结合
区域提高了蛋白的稳定性和对辅酶的亲和力，野生
型 RgDAAO（二聚体）对辅酶的亲和力是突变型蛋
白（单体）的 10 倍［18-23］。
human porcine yeast
人类 DAAO 的二聚体界面（虚线圆内示出）带负电荷，而猪的 DAAO 是带正电荷的。酵母的 DAAO 亚基的二
聚体界面是从蓝色（正值）到红色（负值）（颜色标识见电子版）
图 2 二聚体界面的表面静电电势［13］
3 活性区域
RgDAAO 的活性部位是由环黄素异咯嗪环的
两个长 β 链 I4、I8 和靠近底物结合部位的两条短
β 链 I5、I6 构成的空腔，以黄素作为活性空腔的底
部 ；这些 β 链反向平行，并以氢键彼此连接形成刚
性结构。在黄素的 re-面，连接 βF2 折叠和 αI1 螺旋
的 loop 环与黄素的功能基团以氢键相连构成主链 ；
在 si-面，长螺旋 αF5 的 N 端构成了活性位点的边
界（图 3）［8］。尽管 hDAAO 和 pkDAAO 序列同源性
高达 85%，二者在黄素环 re-面的活性位点也完全保
守，二者 si-面也均覆盖着一个疏水延伸（氨基酸残
基 47-51，VAAGL）［6］，不过，二者 si-面的构像却
完全不同 ：hDAAO 中疏水延伸位于分子内部形成具
有较低 B-值（44.6Å2，低于平均值为 52.2 Å2）的刚
性结构［13］。
比 较 RgDAAO、pkDAAO 和 hDAAO 的 一 级 结
构和活性位点 3D 结构图可以看出，有 2 个酪氨酸
（Y）和 1 个精氨酸（R）高度保守位点（RgDAAO ：
Y223，Y238，R285 ；pkDAAO 和 hDAAO ：Y224，
Y228，R283）（表 1）［12，24-26］，这些位点与底物连接，
氨基酸的羧基通过静电与精氨酸 R285 的 γ-和ε-氨基
基团相互作用，并与 Y223 及 Y238 的羟基基团形成
氢键［24］。Harris 等［27］ 研究发现 Y223 是酶蛋白的
酸碱催化位点，该位点对于酶蛋白与底物的结合以
及催化反应时的蛋白空间效应方面起着重要的作用。
将 Y223 突变为 S223 后突变体结合底物和产物的能
力分别比野生型慢 60 和 800 倍 ；R285 可能起着稳
定半醌阴离子和还原态黄素的作用［28］，Y238 的侧
链则可能充当着盖子的作用，控制着底物 - 产物之
间的转换［29］。Pollegioni 等［26］研究发现，pkDAAO
中的残基 Tyr224 可能参与固定底物或产物，并与底
物的 α 氨基基团和活性位点一个水分子相互作用，
该位点所在的环状结构（氨基酸残基 217-227）充当
着“盖子”的作用并控制底物进入活性位点［5-7］。在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期30
RgDAAO 中不存在“盖子”结构，不过，连接 βI7
和 αI3 的环状结构中氨基酸残基 Tyr238 的侧链处于
在类似的位置，该位点可能充当着“盖子”的作用，
控制着底物 -产物之间的相互转换（图 3）［8］。从鲤
鱼肝胰腺来源的 chDAAO（Common carp hepatopanc-
reas D-amino acid oxidase）的活性位点（Tyr224，Tyr-
228 和 Arg283）则和哺乳类完全一致［30］。
4 辅酶
D-氨基酸氧化酶是黄素腺嘌呤（FAD）依赖型
氧化酶，每个亚基非共价结合一分子黄素，在 280、
380 和 450 nm 附近具有典型吸收光谱。hDAAO 的
最 大 吸 收 光 谱 为 278、372 和 454 nm，pkDAAO 为
274、380 和 455 nm，RgDAAO 的 最 大 吸 收 光 谱 为
274、368 和 455 nm。三者在近紫外（280 nm）和可
见光（454 nm）下吸光值的比值分别为：10.6（hDAAO，
A278/A454），9.5（pkDAAO，A274/A455），8.2（RgDAAO，
A274/A455）
［30，31］。当蛋白和底物结合后，还原态的
DAAO 在 380nm 和 455nm 附近的吸收光谱消失，这
说明辅酶 FAD 参与 DAAO 的催化反应（图 4）。
辅 因 子 FAD 主 要 通 过 Rossmann 卷 曲（βαβαβ
AB Tyr223Tyr238
Arg285
Ser335
FAD
Gln339
Asn54
AB β17
β16
β15
β14
β17
β16
β15
β18
β14
β16
β18
β17
β16
β17
β18
β18
loop β15-β16
loop β15-β16loop β15-β16
loop β15-β16
a b
c
Tyr238
Ser335
Arg285
RgDAAO
Tyr224
pkDAAO
Tyr238
AB
AB
AB
Asn54
pkDAAO
Tyr238
Tyr224 Tyr223
Tyr228
RgDAAO
AB
AB
AB
Arg285
Arg283
FAD
FAD
Ser335
Gly313
Gln339
Thr317
Asn54
Leu51Leu51
Gln339
Thr317
FAD
FAD
Sbr335
Gly313
Arg285
Arg283
Tyr223
Tyr228
FAD
Gln339
Asn54
Wat72
CFyAla
Tyr223
RgDAAO 活性中心与配体 cf3-D- 丙氨酸（紫红色）的相互作用 ；（b）RgDAAO 与邻氨基苯甲酸盐复合物的结合区域显示活性中心
存在两个邻氨基苯甲酸盐分子（紫红色）；（c）RgDAAO 和 pkDAAO 的活性部位（与邻氨基苯甲酸盐结合区域）结构比较图。虚线
表示氢键，分别用绿色和淡蓝色来表示 RgDAAO 和 pkDAAO 的结构。与 RgDAAO 结合的邻氨基苯甲酸盐分子以紫红色表示，与
pkDAAO 结合的邻氨基苯甲酸盐分子以蓝色表示［8］（颜色标识见电子版）
图 3 RgDAAO 与 pkDAAO 活性中心比较图［8］
0.30
0.20
A
bs
or
ba
nc
e
0.10
0.05
300 400 500 600550450350
Wavelengthnm
0
0.15
0.25
图 4 DAAO 吸收光谱图［31］
2013年第12期 31赵冉冉等 ：D-氨基酸氧化酶结构的研究进展
结构）与酶蛋白的辅酶结合区域结合，并被包埋于
蛋白中形成一个狭长构象，其异咯嗪环是允许大分
子溶剂进入的唯一部分。辅酶与蛋白以非共价键结
合形成的复杂网络有效提高了蛋白对化学和热变性
的稳定性［32，33］。氨基酸序列分析比对发现，不同
物种来源的 DAAO 与辅酶 FAD 的结合区域高度保
守［1，16］，不过，不同酶蛋白和辅酶的亲和力大小却
不尽相同。Molla 等［17］发现与真核来源的 DAAO 相
比，微生物来源的 DAAO 与 FAD 的结合更为紧密，
FAD 与脱辅基酶蛋白 hDAAO 的解离常数 Kd 值为 8
μmol/L， 分 别 是 pkDAAO 和 RgDAAO 的 40 和 400
倍［34］。研究发现，原核生物来源的 DAAO 对 FAD
的解离常数比 RgDAAO 和 TvDAAO 还要低，Geueke
等［35］发现在极苛刻的条件下纯化原玻璃蝇节杆菌
（Arthrobacter protophormiae）来源 ApDAAO，添加外
源 FAD 后对酶蛋白的活性没有任何影响。而在该条
件下纯化 RgDAAO 时，所获得的蛋白中脱辅基酶蛋
白达 62%，添加 FAD 后酶蛋白活性提高约 33%［36］。
分 析 比 较 hDAAO 和 pkDAAO 的 FAD 及 周 边
氨基酸残基所构成的网络结构（辅因子周围 6Å 以
内）发现，除了位于黄素异咯嗪环 si-面的疏水短肽
VAAGL 有所不同外，二者并没有任何显著差异［33］。
Sacchi 等［33］认为 VAAGL 属于结构性矛盾肽（SAP），
其构象可能是随结构的不同而改变。hDAAO 对 FAD
较低的亲和力可能是 SAP 结构中 Ala49 的 N 原子
与黄素 N（5）之间的氢键丧失导致的，这从二者
间的距离可以看出，pkDAAO 中二者间的距离为
3.7Å，而 hDAAO 中二者间的距离增加至 4.9Å。失
去一个氢键所消耗的结合能（约 2 kcal）恰好说明
了 hDAAO 对 FAD 的低亲和力比 pkDAAO 低 40 倍［37］。
此外，上述氢键的缺失也和黄素还原效率较慢相关：
hDAAO 为 180 s-1，而 pkDAAO 为 4000 s-1。［12-17，38］
虽然 RgDAAO 和 pkDAAO 与辅酶 FAD 的结合
方式大致相同，但也存在一些本质上的不同，这些
不同之处主要表现在以下 3 个方面 ：I，RgDAAO 中
黄素 N（1）与 Ser335 的 =O 形成氢键，而 pkDAAO
中不存在该氢键 ；II，pkDAAO 和 RgDAAO 中黄素
O（2）周围的环境存在本质的不同 ：pkDAAO 中部
分受� F5 螺旋影响而带正电荷的部分偶极子与还原
型黄素的负电荷共同作用维持其稳定性，RgDAAO
则与之不同 ：RgDAAO 中黄素 O（2）与� F5 螺旋
中 Gln339 和 Tyr338 的 NH 基团形成 2 个氢键，而
pkDAAO 中 O（2）仅作用于 Thr317 ；III，RgDAAO
中 FAD 的磷酸根 3 个氧原子周围共有 4 个水分子处
于形成氢键的最适范围内，而 pkDAAO 中仅有 3 个
水分子和磷酸根的 2 个氧原子作用［16，33］。
5 抑制剂
早在 19 世纪 40 年代 Klein 等［39］ 就发现苯甲
酸是 DAAO 的竞争性抑制剂，随后陆续发现一些
抑制剂，如芳香族或异芳香族羧酸和 5-羟基 -1，4-
吡喃酮等。迄今为止，苯甲酸仍一直是研究 DAAO
的催化机制和生理作用的有效工具。事实上，首个
hDAAO 与苯甲酸复合物三维结构的解析就为我们提
供了洞察 DAAO 活性中心的重要结构细节 ：苯甲酸
平行于在辅因子的 re-面与黄素环连接，并与 Tyr224
的侧链相互作用，其羧基与活性中心的 Arg283 和
Tyr228 以氢键连接［40］。hDAAO 和 pkDAAO 的活性
中心所覆盖着的“盖子”可能起着限制酶蛋白抑制
剂大小的作用，相比之下，RgDAAO 中“盖子”的
缺失或许正是它比哺乳类 DAAO 对大分子底物（如
头孢菌素 C 等）具有更高催化能力的原因之所在［41］。
hDAAO 和 pkDAAO 与竞争性抑制物的结合形
式基本一致，抑制物可以分为两个功能区域 ：一是
极性或带电基团（如羧酸、羟基或异恶唑环等），能
够与活性位点（Arg283，Tyr228 和 Gly313）形成氢
键 ；二是通常由 6 个或 5 原子芳环构成的疏水区域，
该区域与活性位点的疏水残基结合，由于抑制剂缺
失底物所特有的 a-氨基基团，所以这些疏水作用非
常重要（o-氨基苯除外）。此外，抑制剂的芳香环与
Tyr224 的芳环和 FAD 的异咯嗪环结合形成 π-π 强相
互作用［33］。
RgDAAO 晶体浸泡竞争性抑制剂后，在其活性
位点处发现了两个邻氨基苯甲酸盐分子（图 3-b），
第一个位于黄素 N（5）的附近，该位置和 D-丙氨
酸所占的位置相似，第二个位于活性空腔的入口
处［8］。比较酶蛋白与第一个邻氨基苯甲酸盐、D-丙
氨酸、三氟 -D-丙氨酸和 L-乳酸的结合模型可以发
现，这些配体都处于相似位置（图 3-c），它们与氨
基酸位点 Arg285、Tyr223 以及 Ser335 的氢键相互作
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期32
用及构象也基本相同。由此可见，底物的 αC-H 位
于黄素 re-侧N（5）的分子最低空轨道（LUMO）边
缘［42］。不过，明显的不同之处在于，在 RgDAAO-
邻氨基苯甲酸盐复合体中，由于 Tyr238 远离配体的
羧基（-COO-），导致 Tyr238 中任何离散的 H 都无法
连接配体 ；另一个不同之处是，活性位点的水分子
W72 与其它配体的官能基团 OH/NH2 形成氢键，但
在以邻氨基苯甲酸盐为配体的复合物中却没有发现
这个水分子［8］。
6 柔性部件
RgDAAO 的 N 端 6 个 氨 基 酸 残 基（MARIRL）
中只有 R 和 L 两个氨基酸位点可以通过电子密度模
拟获得，剩余的 4 个残基显然拥有灵活的构象，这
个片段似乎是晶体形成和生长的重要组成部分［8］；
然 而，pkDAAO 和 hDAAO 的 N 端 与 RgDAAO 则 有
些不同，二者的 N 端是辅酶 FAD 的结合区域［5］。
DAAO 的 C 末端存在柔性区域，如 hDAAO 亚基 C
末 端 Arg341-Leu347 区 域［12］，pkDAAO 的 C 末 端
Leu340-Leu347 区 域［5，6］，RgDAAO 中 Arg312-Gln-
319（ 连 接 βF5 和 βF6 之 间 的 长 环 上 ） 及 Ala362-
Leu368 区域［8］，这些区域的电子密度较弱 ；Mattevi
等［5］研究发现，将这些 C 端柔性短肽区域切除并
不影响酶蛋白的催化性能。另外，所有 DAAO 中与
过氧化物酶体结合的 C 端三肽［Ser-（Lys/His/Arg）-
Leu］的电子密度无法看到，这个柔性结构可能在其
与过氧化物酶体膜受体之间的相互作用中起关键
作用［16，43］。
7 展望
越来越多的证据表明，D-丝氨酸参与了精神分
裂症，D-丝氨酸是 NMDA 型谷氨酸受体主要的内源
性协同拮抗剂，DAAO 活性增强加速了其特异性底
物 D-丝氨酸代谢，导致 NMDA 受体功能低下，使
精神分裂症状加重。当给予高剂量的 D-丝氨酸或加
入 DAAO 抑制剂可有效降低 DAAO 介导的代谢，增
加脑内 D-丝氨酸的浓度，从而使精神分裂症患者的
症状得到缓解或改善，并改善学习和记忆等精神病
紊乱疾病的症状［44］。因此，DAAO 作为治疗精神
疾病紊乱症的潜在性分子靶标正受到广泛关注。此
外，Lu 等［45］研究认为，DAAO 也可能是一种潜在
的致痛因子，是治疗与中枢敏感化相关的慢性疼痛
的一种重要分子靶标。通过注射 DAAO 特异性抑制
剂 CBIO（5-chlorobenzo［d］isoxazol-3-ol，5-氯 苯 并
［d］异恶唑 -3-醇），他们发现 CBIO 可以抑制脊髓
DAAO 酶的活性从而阻断福尔马林诱导的慢性疼痛 ；
而向鞘内注射苯甲酸钠（DAAO 抑制剂）则能减轻
脊神经结扎诱导大大鼠机械性痛觉过敏和异常疼
痛［46］。研究发现，苯甲酸钠还具有抑制 DAAO 活性
从而缓解恐慌病人的症状的功能［47］，能增加严重抑
郁症的药物初治患者丘脑、扁桃体和脑干容量［48］。
由此可见，理想的 DAAO 抑制剂可以有效抑制或缓
解相关症状。目前，根据 DAAO 的三维结构信息已
经筛选获得了一些酶蛋白抑制剂，如 ：6-氯苯并［d］
异 恶 唑 -3-醇（6-chlorobenzo［d］isoxazol-3-ol 1）
（IC50=188 nmol/L），3-hydroxyquinolin-2（1H）-one 2a
（IC50=4 nmol/L），3-hydroxychromen-2-one 2b（IC50=440
nmol/L），4，6-二氟 -1-羟基 -1H-苯并［d］咪唑 -2（3H）-
酮（IC50=50 nmol/L），CBIO（IC50=150 nmol/L）， 吡
咯羧酸 4a（IC50=141 nmol/L），吡咯羧酸 4b（IC50=245
nmol/L），吡咯 -2-羧酸 5a（IC50 <10 μmol/L），1H-吡
唑 -3-羧酸 5b（IC50 <100 μmol/L），以及麴酸衍生物
类（IC50 =0.1-100 μmol/L）
［49］。这些抑制剂大部分
属于带有羧酸或其生物电子等排体的芳环体系，通
过构效关系（Structure-activity relationship，SAR）的
研究发现，由于 DAAO 活性位点的空间有限，空间
位阻效应导致了这些抑制剂均不具有良好的药物耐
受性［49］。因此，充分了解 DAAO 的三维结构信息，
有助于利用酶蛋白的三维结构信息筛选获得耐药性
好的酶蛋白抑制剂，为精神疾病及癌症等疾病的治
疗提供新型药物。
充分了解相关酶蛋白的三维结构信息，还可理
性改造酶蛋白提供强有力的理论依据。Caligiuri 等
基于结构信息将 RgDAAO 中 Met213 突变为 Gly213，
降低了该位点的空间位阻，显著提高了酶蛋白对部
分芳香族底物的活性［50］。Mueller 等［51］将三角酵母
TvDAAO 中 Cys108 分 别 突 变 为 Ser108 和 Asp108，
衍射分析表明，突变位点均造成了 DAAO 的构象变
化，导致与辅酶结合稳定性下降，使突变体酶蛋白
活性较野生型下降了 2-3 倍。Wong 等［52］通过结构
模拟发现，TvDAAO 中 Phe54 位于 CPC 结合部位附
2013年第12期 33赵冉冉等 ：D-氨基酸氧化酶结构的研究进展
近，将 Phe54 突变为 Tyr54 后与 CPC 形成新的氢键，
加速了氨基脱氨，提高了底物转换率（Kcat 提高 6
倍），降低 GL-7-ACA 的抑制（Ki 提高 2.5 倍），并
提高了突变体的耐热性。Komarova 等［53］通过结构
比对发现 TvDAAO 中 Phe258 位于酶蛋白活性中心
入口处，将该位点定点突变为 Ala 或 Ser 后，与野
生型相比，突变体酶蛋白的底物特异性更专一，并
且对底物 D-Tyr、D-Phe 和 DLeu 的催化效率有不同
程度的提高。原玻璃蝇节杆菌来源的 ApDAAO 是目
前为止唯一被克隆的来自原核生物的 D-氨基酸氧化
酶，Geueke 等［35］仅对该酶蛋白进行了初步的酶学
特性分析，其活性中心、辅酶结合形式等尚不清楚，
本实验室目前正参照结构已解析的 DAAO 三维结构
信息，结合同源比对和结构模拟技术，寻找可能的
活性中心及辅酶结合位点，并通过定点突变技术构
建突变体，分析突变体酶蛋白的酶学特性最终确定
其活性中心和辅酶结合位点，为理性改造原核生物
来源的 DAAO 奠定理论基础。
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（责任编辑 狄艳红）