全 文 ：稻曲病菌 AFLP反应体系的建立及其初步应用
潘雅姣1 陈红漫1 周永力2
( 1沈阳农业大学生物技术学院,沈阳 110161; 2中国农业科学院作物科学研究所
农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程,北京 100081)
摘 要: 本研究通过一系列梯度试验建立了最佳的稻曲病菌 AFLP ( Amplified fragment leng th polymo r-
phism)反应体系, 并从 256 对 EcoRⅠ和 M seⅠ引物组合中选择 30 对条带清晰、多态性好的引物组合分析了 2003
年北京昌平基地的 40 个稻曲病菌株的遗传多样性。
关键词: 稻曲病菌 AFLP 遗传多样性
System Establishment and Application of AFLP
Technique in Ust ilaginoidea. Virens
Pan Yajiao1 Chen Hongman 1 Zhou Yongli 2
( 1 Shenyang A gr icultur al Univ er sit y , S henyang 110161; 2 Nat ional key Faci l it y f or Cr op Genet i c
Re sour ces & Imp rov ement , I nsti tute of Cr op S cience . Chinese A cad emy of A gr ic ul tur al S ci ences , B ei j ing 100081)
Abstract: The best AFLP reaction system for Ustilaginoidea . v ir ens was decided by a set of exper iment , and
the genet ic diversit y of 40 strains isolated from Beijing w ere analysized with 30 pr imer pairs selected from 256 primer
combinat ions of EcoRⅠand M seⅠ.
Key words: Ustilag inoidea. vir ens AFLP Genetic diver sity
稻曲病( Ust ilag inoidea . v ir ens)是由真菌引起的水稻穗部病害, 除造成水稻减产和稻米品质下降外,
由于其病原菌厚垣孢子含有毒素, 危害人畜健康。近年来随着籼粳杂交稻的大面积推广和相应增产措施的
采用,已经上升为我国水稻生产中的主要病害。
但由于稻曲病菌人工接种技术的不完善,无法使用常规方法选育抗病品种。本试验从病原菌的群体遗
传结构入手,摸索出一整套适应于稻曲病菌的 AFLP 检测技术,并分析了小范围内稻曲病菌的群体遗传多
样性,为了解稻曲病的发生规律提供了信息, 同时为进一步的研究稻曲病菌的群体遗传结构特点奠定了基
础。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株的分离与培养
2003年秋季从北京昌平基地采集 40个稻曲病标样, 其中 1~ 14来自小区Ⅰ, 17~ 29来自小区Ⅱ, 30~
40来自小区Ⅲ。小区Ⅱ和小区Ⅲ的材料生育期大致相同,小区Ⅰ的材料生育期存在差异。采用厚垣孢子悬
浮液法分离。将活化的单孢菌种转接到胁本哲液体培养基(母液) , 26~ 28 e , 180 r/ m 100ml培养 2~ 3d,过
滤菌丝体,冷冻抽干后保存于-20 e 备用。
1. 2 供试菌株鉴定与 DNA提取
采用 Nakada( 1994)方法提取 DNA 后, 为保证供试菌株的可靠性, 采用 U. v ir ens 特异性引物( Zhou,
2003)对所提取 DNA 进行鉴定。
收稿日期: 2005-07-11
基金项目:国家自然科学基金( 30471021)
作者简介:潘雅姣( 1978- ) ,女,辽宁省抚顺市人,沈阳农业大学生物技术学院硕士研究生
生物技术通报
#研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 4期
1. 3 标准 AFLP 反应体系的建立
1. 3. 1 酶切连接反应体系 15Ll的酶切连接体系包括 DNA 模板( 100ng /Ll) 2Ll, 限制性内切酶 EcoRⅠ
( 10U /Ll)和 M seⅠ ( 10U/ Ll) , 通用 Buf fer Y+ / T ANGO ( 10 @ ) 3Ll, EcoRⅠ接头 ( 5LM ) 和 M seⅠ接头
( 50LM )各 0. 5Ll, T 4 连接酶( 3U /Ll) , lingase Buffer ( 10 @ ) 1. 5Ll, A TP( 10mg/Ll ) 0. 5Ll, ddH 2O 补齐至
15Ll。37 e 温育过夜。为达到最佳的酶连效果,设定了一系列的内切酶用量和连接酶用量的梯度。
内切酶用量: EcoRI 和 MseI 各 1U, 2U , 3U 。T4连接酶用量: 0. 3U , 0. 6U , 0. 9U 进行内切酶用量和
连接酶用量两个因素的正交试验, 1%琼脂糖凝胶检测酶切连接结果。
1. 3. 2 预扩增反应体系 15Ll的预扩增反应体系包括: 酶切连接产物稀释液 1Ll, EcoRⅠ引物( 10LM )和
MseⅠ引物( 10LM )各 0. 6Ll, 10 @ Buf fer 1. 5Ll, dNT Ps( 1mM ) 1. 2Ll, M g2+ ( 15mM ) 1. 2Ll, T aq ( 5U /Ll)
0. 2Ll, 添加 ddH2O至 15Ll。混匀后进行如下 PCR 扩增: 94 e 5m in; 94 e 30sec 56 e 30sec, 72 e 1min 25
个循环; 72 e 延伸 7min; 4 e 保存。为达到最佳扩增效果, 设立了一系列的酶连产物稀释倍数: 10倍, 20倍,
50倍。
1. 3. 3 选择性扩增反应体系 预扩增产物经稀释后作为模板继续进行选择性扩增, 选择性扩增的反应体
系除引物外同预扩增体系,设立 20倍, 50倍, 100倍三个稀释梯度以确定选择性扩增的最佳模板量。反应按
如下程序进行: 94 e 5min; 94 e 30sec 65~ 56 e ( 每循环降 1 e ) 30sec, 72 e 1min; 94 e 30sec 56 e 30sec,
72 e 1m in 25个循环; 72 e 延伸 7m in; 4 e 保存。
图 1 不同酶用量的酶切连接结果
A: EcoRⅠ和 MseI 各 2U, 连接酶 0. 3U
B: EcoRⅠ和 MseI各 2U , 连接酶 0. 6U
C: EcoRⅠ和 MseI 各 2U, 连接酶 0. 9U
1. 4 引物筛选与群体的 AFLP 检测
分别用 256对选择性引物对 4个供试菌株进行扩增,筛选条带清
晰,多态性好的引物组合对群体的 40个菌株进行 AFLP 检测。
1. 5 数据分析
电泳图谱中的每一条清晰的条带均可作为一个分子标记,扩增片
段的出现与否分别赋值 0和 1,制成 0~ 1表用于数据处理。利用 NT-
SYS-2. 1软件, 计算各菌株之间的相似性系数,并且根据相似性结果进
行聚类分析,生成相似性矩阵和树状图。
2 结果分析
2. 1 最佳 AFLP 反应体系
在 AFLP 技术中, 整个过程需要的时间长, 涉及的步骤多,要想获
得理想的结果, 对各个步骤进行优化是十分必要的。
图 2 不同模板浓度的预扩增结果
A: 酶连产物稀释 10倍 B: 酶连产物稀释 20
倍 C: 酶连产物稀释 50倍
2. 2. 1 酶切连接反应体系 决定酶切连接成功与否的关键因素是内
切酶的用量,内切酶缓冲液的种类和终浓度,以及连接酶的用量。本
试验应用配套的 EcoRI 和 M seI 的通用 Buf fer, 并且说明书显示在 2
@ 终浓度时, 两种酶的活性均较高。
如图 1所示内切酶用量为 2U ,连接酶用量为 0. 6U 时酶连效果最
好。为节省试剂并达到最佳的反应效果,本试验采用 EcoRⅠ和 M seI
各 2U, 连接酶 0. 6U 的反应体系。
2. 2. 2 预扩增反应体系 扩增反应中 DNA 模板量是关键影响因子。
琼脂糖电泳结果(图 2)显示, 酶切连接产物稀释倍数为 20 倍时, 5个
供试样品均能扩增出较亮的 smear。因而选用 20倍作为预扩增反应
中 DNA 模板的稀释倍数。
2. 2. 3 选择性扩增反应体系 图 3聚丙烯酰氨凝胶电泳图谱显示,当预扩增产物稀释倍数为 50 倍时, 4个
652005年第 4期 潘雅姣等: 稻曲病菌 AFLP 反应体系的建立及其初步应用
菌株均能扩增出清晰的条带。
图 3 选择性扩增体系模板浓度梯度
试验结果
1~ 4:预扩增产物稀释 50 倍 5~ 8:稀释
20倍 9~ 12:稀释 100倍
2. 3 引物筛选
从 256对引物中选出 30个引物组合,如 E12-M 19(图 4)和 E12-M 11
(图 5)对供试的 4个菌株均能扩增出清晰的谱带,而且多态性较好。选定
的 30对 EcoRI 和 M seI选择性引物组合(表 1)。
表 1 选定的 30 对引物组合列表
编号 引物组合 可见带数 编号 引物组合 可见带数
1 E11-M11 25 16 E 14-M12 15
2 E11-M12 15 17 E 14-M20 12
3 E11-M17 17 18 E 14-M23 9
4 E11-M19 24 19 E 16-M20 18
5 E12-M11 21 20 E 17-M18 18
6 E12-M12 23 21 E 17-M21 8
7 E12-M15 19 22 E 17-M22 13
图 4 E12-M18 等引物对扩增结果
8 E12-M18 14 23 E 17-M24 9
9 E12-M19 7 24 E 18-M12 8
10 E12-M20 19 25 E 18-M18 14
11 E12-M23 22 26 E 18-M24 16
12 E12-M26 10 27 E 19-M17 9
13 E13-M15 18 28 E 19-M19 15
14 E13-M18 17 29 E 20-M22 14
15 E13-M24 17 30 E 22-M25 13
2. 4 稻曲病菌群体的 AFLP 图谱特点
如图 6所示,供试菌株经大多数引物扩增出的图谱均具有共同
图 5 E11-M11 等引物对扩增结果
的谱带特征。另有 12 对引物扩出的稻曲病菌的多态性十分丰富, 如
E12-M 12, E12-M 20(图 7)。
2. 5 聚类结果分析
聚类结果表明(图 8) , 抽穗期整齐的小区Ⅱ和小区Ⅲ的菌株基本都
各自聚在同一组。如小区Ⅱ的菌株除了 26, 27之外, 其它菌株都聚在同
一大组中;小区Ⅲ的多数菌株和小区Ⅰ的 1-5号菌株聚在一个大组中。
而种植在小区Ⅰ的水稻抽穗期不同,相应的来自这些材料菌株相应的聚
成相对独立的几组, 如菌株 1~ 5 聚在一个小组, 相似性系数达 0. 83 以
上,菌株 6、8、16、9和 10聚在一组,菌株 7、13和 15聚在一组。上述结果初步显示本试验测定的来自同一田
块的菌株可以分为亚簇。
66 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 4期
图 8 根据相似性系数所得的 40 个供试菌株的聚类结果
(2003 年北京)
3 讨论
稻曲病菌的聚类结果显示亚簇与寄主的生育期
有密切的关系。对此, 我们初步推断这是由于稻曲
病为典型的积年流行病害, 土壤中的菌源是不同年
度间散落到田间的厚垣孢子组成的复杂群体。来源
于不同年度的越冬厚垣孢子发育成分生孢子的进度
不同,田间可能存在几个分生孢子高峰期。水稻生
育期不同,其感染稻曲病菌的敏感时期也不同, 即在
不同的分生孢子产生期被侵染, 而这些分生孢子由
不同年度厚垣孢子产生, 遗传上存在差异。上述推
论我们正在进一步验证。
参 考 文 献
1 周永力,章琦.中国水稻科学, 1999, 13( 3) : 186~ 188.
2 Nakada M, et al. Mycoscience, 1994, 35: 271~ 278.
3 Zhou YL, et al . J Phytopathol, 2003, 151( 9) : 513~ 518.
# 国内信息#
PCR-RFLP检测猪源致病性沙门氏菌 gyrA基因点突变
四川农业大学谭炳乾、王红宁和叶如俊等先生利用 PCR-RFLP 法检测猪源致病性沙门氏菌 gyrA 基因
点的突变。他们测定了 16株猪源致病性沙门氏菌对 5种常用氟喹诺酮类药物的最低抑菌浓度( M IC)。结
果表明对此 5种药物的耐药率在 31. 2%~ 56. 2%。分别以质粒和染色体为模板,应用 PCR 扩增 16株沙门
氏菌的 gyrA 基因,以后所有菌株均获得以染色体为模板的扩增产物,还从 1株鼠伤寒沙门氏菌获得了以质
粒为模板的扩增产物。
他们对 PCR扩增物进行了 RFLP 分析,没有检测出氟喹诺酮高敏菌株的突变位点, 但在中敏菌株和耐
药菌株中检测出了 gyrA 基因的点突变。因 DNA 旋转酶( gy rase)的主要功能是催化双链 DNA形成超螺旋
体,对 DNA 复制、转录、整合和表达有极重要作用, 即在多项研究中表明 gyrA 与 FQNs 抗性有关, 也是
DNA 旋转酶、拓扑异构酶 IV 之喹诺酮类药物作用的位点,同时临床分离菌株的 FQNs耐药性与 gy rA 的第
83位密码子的突变有密切关系。
在氟喹诺酮耐药菌株中, 发生 gyrA 基因单点突变时,仅显示低水平耐药,难以检测和鉴别。应用 PCR-
RFLP 检测沙门氏菌 gy rA基因的 83位密码子点突变简而易行,并方便地进行 PCR 酶切产物的检测,并可
预期扩增的片段长度为 668bp,预期在扩增片段中用 HinfI 酶切片段大小为 363、206、99bp或 363、305bp。
在 FQNs耐药性的检测中, DNA 旋转酶活性和药物 M IC值测定菌株的表型检测,其准确性受多因素影
响,只有用 PCR-RFLP 直接进行基因突变位点检测,可检测出表型中变敏感菌株的 gyrA 基因的突变情况。
它具有更高的敏感性和特异性,且比 gy rA基因序列测定更快速、经济、简便,且可大量进行检测。
本研究还以一株鼠伤寒沙门氏菌质粒为模板扩增出特异性片段,期 HinfI酶切位点没有发生点突变,但
是否存在其他位点的变异,还需深入序列分析。由于质粒的可传递性,质粒编码 gy rA 基因菌株的出现,对
耐药菌株的扩散、蔓延,可能具有重要的公共卫生学意义。 秦春圃
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