全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第6期
收稿日期:2006-08-11
基金项目:国家科技攻关计划项目(编号:2004BA519A-41)资助
作者简介:独军政(1976-),男,甘肃礼县籍,研实员,博士在读,分子病毒学
通讯作者:常惠芸(1965-),女,河南许昌籍,研究员,博士,分子病毒学;电话:0931-8342052
RNAi及其抑制口蹄疫病毒复制的研究进展
独军政 常惠芸 才学鹏 谢庆阁
(中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州 730046)
摘 要: RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double strand RNA,dsRNA)介导的序列特异
的RNA降解过程。已经证明,在植物和昆虫细胞中RNAi是其主要的抗病毒免疫机制,至今为止几乎没有发现在病毒感染
哺乳动物细胞过程中诱发有效的抗病毒RNAi反应。因此,人们希望能够利用人工方法在哺乳动物细胞中建立有效的抗病
毒RNAi防御策略。迄今为止,对多种哺乳动物病毒的研究结果令人振奋。主要围绕RNAi的分子基础、基本策略及其在抑
制口蹄疫病毒复制中的研究现状作了综述。
关键词: RNAi口蹄疫病毒 抗病毒
RNAInterferenceandItsApplicationinFMDV
DuJunzheng ChangHuiyun CaiXuepeng XieQingge
(KeyLaboratoryofAnimalVirologyofMinistryofAgriculture,StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,
LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046)
Abstract: RNAinterfencereferstotheinhibitionofgeneexpresiobydsRNA.RNAihas
beenprovedasanantiviralmechanism inplantsandinsectsinsteadofanimals.Peoplemadegreatefortstoestablishan
eficaciouslyantiviralstrategyinmammaliansandhavegainedmanyexcitingresults.Inthisarticle,wereviewthecurent
researchesonmolecularbasis,basicstrategyoftheinhibitionofvirusreplicationbyRNAianditsapplicationinFMDV.
Keywords: RNAinterference FMDV Replicationinhibition
RNAi(RNAinterference,RNAi)又称RNA沉默
(RNAsilencing),是指由双链 RNA (doublestrand
RNA,dsRNA)介导的序列特异的RNA降解过程,整
个过程发生在真核细胞的胞浆。1995年,康乃尔大学
Guo博士在线虫体内研究反义RNA技术时,发现正
义RNA与反义RNA一样有抑制作用。1998年,Fire
解释了 Guo博士遇到的现象,认为其使用的反义
RNA和正义 RNA中污染了 dsRNA,经纯化后证实
dsRNA的抑制作用远强于反义RNA,该小组称此现
象为RNAi[1]。由于发现了RNAi现象中的关键性分子
dsRNA,科学家们使用生物化学和遗传学方法,在线
虫中陆续发现了许多与 dsRNA特异性诱导 RNAi的
相关基因[2]。发现了一个可以把dsRNA进行加工形成
长 度 为 21～23个 核 苷 酸 的 小 干 扰 RNA(smal
interferingRNA,siRNA)的核酸内切酶 Dicer;以及发
现了 RNA介导的沉默复合物(RNAinducedsilencing
complex,RISC),该蛋白复合物能将Dicer酶加工形成
的siRNA结合携带,识别与siRNA同源的mRNA并
将其切割降解。RNAi分子机制的发现推动了与之有
关的细胞生长发育调控相关研究,同时,RNAi被认为
是抗病毒治疗的新策略。
1 RNAi抑制病毒复制的分子基础
研究表明,RNAi的可能作用机制为:21～23bp的
siRNA是启动整个干扰过程的决定因子 [3]。类似于
RNAseⅢ的 Dicer酶通过剪切长的 dsRNA前体可以
得到siRNAs,这些siRNAs与多种相关蛋白结合形成
RNA介导的沉默复合物,该复合物在反义链引导下
与互补的mRNA靶序列结合并将其降解。病毒在哺
乳动物细胞内的复制可以激活RNAi应答反应。病毒
复制过程中的 dsRNA复制中间体是激活 RNAi反应
·综述与专论·
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的有效作用因子。另外,病毒复制过程中,高水平的
RNA累积也被认为是启动RNAi的原因之一。这种机
制被人们称为阈值模型(thresholdmodel)。过量的病
毒RNA或mRNA在病毒自身编码的 RNA依赖性的
RNA聚合酶 (RdRP)作用下形成dsRNA,由此引发
RNAi过程[4,5]。
2 RNAi抑制病毒复制的基本策略
RNAi分子机制在哺乳动物细胞的保守性,使其
成为了病毒学家们最给予厚望的全新的抗病毒免疫
策略,主要原因是,RNAi效应具有快速和高度特异性
的特征,有望弥补传统的抗病毒疫苗或抑制剂的缺
陷。在植物和昆虫细胞中已经证明,RNAi是其主要的
抗病毒免疫机制,当病毒感染细胞时,由病毒复制过
程中产生dsRNA可以诱发RNAi,并且反过来十分有
效地抑制病毒的复制。至今为止几乎没有发现在病毒
感染哺乳动物细胞过程中诱发有效的抗病毒 RNAi
反应。因此,病毒学家们希望能够利用人工方法在哺
乳动物细胞中建立有效的抗病毒RNAi防御策略。
2.1 siRNA的设计
首先,在病毒核酸保守序列中选择靶向序列,再
针对靶序列设计 siRNAs。有效的 siRNA一般含有
21～25个碱基,3末端有两个碱基修饰 (UU),G+C含
量在30%～50%范围内,而且尽可能不含有与靶向序
列错配的碱基,还要避免与细胞中其它编码序列具有
同源性。另外,有研究发现siRNA针对多个位点时有
明显的协同作用,因此,在利用 siRNA进行抗病毒感
染时,如果一个位点效果不显著,可以联合几个位点
使用,这样可以得到较好的抑制效果,但构建的siR-
NA要避开病毒基因的启动子序列[6]。目前已有多种用
于设计高效的 siRNA的计算机软件,如 DEQOR、
siDirect、TROD、OptiRNAi。
影响RNAi效率的因素除了siRNA链本身之外,
靶基因mRNA的高级结构等其他因素也必须纳入考
虑范围。关于这一点存在几个主要假设:其一,mRNA
链结合的蛋白质产生位置阻断效应;其二,mRNA的
内部结构可能影响 siRNA引导的 RISC对它的识别
与接触;其三,siRNA在细胞内受到5′磷酸化反应的
影响。因此,设计siRNA时应同时考虑mRNA靶向位
点的空间位置。
2.2 siRNA的来源
siRNA的来源主要有 3种:化学合成、体外转录
和载体表达。化学合成设计好的 siRNA有两个主要
优点:其一,具有统一性,不易混杂长 dsRNA,使实验
结果更具说服力;其二,可以对 siRNA进行大范围的
化学修饰,使其提高稳定性、转染效率等,此法存在不
稳定、成本高、不适合于大规模地临床应用等缺点。体
外转录是先转录出正义和反义RNA,将两者退火,形
成长 dsRNA,通过人重组 Dicer酶酶切获得 siRNA,
或者将转录获得的 dsRNA以核糖核酸内切酶消化,
然后采用纯化技术将大小适当的 siRNA分离,由于
该方法不易操作,因此较少被采用。体外构建表达
siRNA的质粒或病毒载体,将载体转移到细胞内,在
细胞内合成 siRNA,此法作用时间长,且可以携带
GFP或荧光素酶等报告基因共表达,便于跟踪、选择
和富集转染的细胞。在载体表达方法中,核心内容是
如何选择启动子。通常,人们采用细胞自身的RNA聚
合酶II启动子表达siRNA,例如:U6启动子、H1启
动子、7SK启动子等。这类启动子通常有精确的转录
起始和终止位点,有利于 siRNA的表达后的准确折
叠。化学合成、体外转录的siRNA只能瞬时干扰病毒
核酸的复制,不能达到长久抑制病毒的效果[7],所以,
化学合成、体外转录的方法可用于初筛抑制病毒复制
的 siRNA,而 siRNA表达载体则可用于 siRNA抑制
病毒复制的长期研究。
2.3 siRNA的转染
siRNA转染效率的高低是 RNAi抗病毒感染研
究成功与否的关键。转染效率主要由转染细胞状态、
转染方法和 siRNA剂量所决定。目前报道的 siRNA
进入细胞的方式有脂质体转染、电穿孔、显微注射及
其构建逆转录病毒载体或腺病毒载体来实现。有研究
表明,用脂质体转染细胞,24h后转染效率90%以上,
3d后仍达80%以上,表明脂质体是较好的转染方法。
不同转染方法的转染效率具有细胞特异性,所以在实
验之前必须针对某种细胞系进行转染方法的优化。在
对艾滋病病毒的研究中发现,siRNA对病毒复制的抑
制程度依赖其自身浓度。因此,在转染过程中,应特别
注意控制siRNA的浓度,确保其能够发挥最强的抑
制病毒复制的作用[8]。RNAi要在生物个体水平得到有
效的应用面临一个重大挑战,那就是:如何使 siRNA
有效地转染靶组织器官?其实不论在细胞水平还是在
独军政等:RNAi及其抑制口蹄疫病毒复制的研究进展 35
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个体水平,siRNA的转染均是一大难题。
2.4 攻毒时机及检测指标
如果观察siRNA对病毒感染的治疗作用,应选
择转染前接种病毒。接种病毒的具体时间主要根据病
毒复制的速度决定,一般在转染 siRNA前 24h内完
成。如果观察siRNA对病毒感染的预防作用,则选择
转染后用病毒攻击[9]。攻毒时间要根据siRNA的转染
效率决定,一般在转染后6h进行。
在观察siRNA对病毒复制的抑制作用时,应尽
量选择较敏感的指标进行观测,比如检测病毒核酸随
时间的变化情况,病毒蛋白表达水平等。不同的观察
指标应采用不同的检测手段,其中,采用实时定量
PCR、Northern杂交对病毒核酸进行定量,利用 West-
ernblot和间接免疫荧光方法检测病毒蛋白表达水平
是研究者最常用的。另外,一些研究者还通过North-
ern杂交证实细胞内确实存在或转录出了siRNAs,尽
管这一技术的操作较难,但它却是证明siRNAs存在
于细胞中的唯一方法[10]。
3 RNAi抑制口蹄疫病毒复制
口蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫
病毒引起的偶蹄动物烈性传染病,每年都对世界畜牧
业造成巨大的经济损失。口蹄疫灭活疫苗一般是在接
种7d后才能产生保护性抗体,而口蹄疫病毒的复制
和传播是相当快的,感染病毒2～3d动物便可出现临
床症状,因此,目前的疫苗不足以应对快速的疾病暴
发。RNAi反应具有快速而且特异等优点,可能弥补传
统抗病毒策略的不足。
2004年,Chen等[11]以O/HKN/2002FMDV的 VP1
为RNA干扰靶序列进行了探索,分别构建了表达特
异 siRNA和 VP1蛋白的重组质粒,将二者共转染
BHK21细胞,发现VP1基因的表达量由于siRNA的
干扰降解下降了80%～90%,用O/HKN/2002FMDV感
染表达特异siRNA的细胞,发现出现细胞病变的时
间明显推迟,而用伪狂犬病毒和O/CHA/99FMDV攻
毒时,未见细胞病变推迟的现象发生,这说明 siRNA
对O/HKN/2002FMDV的抑制作用是特异的,O/HKN/
2002和O/CHA/99的靶序列仅有两个核苷酸的变异,
这与 Gitlin等人在研究脊髓灰质炎病毒时发现仅有
一个核苷酸变异便会失去 RNA干扰作用的结论一
致,与对照组相比,病毒滴度在 12h和 24h下降了近
1000倍,48h未见明显下降,同时,无序列特异性的
siRNA对 O/HKN/2002FMDV的复制也无明显影响,
随后该研究小组进行了乳鼠试验,将表达特异siRNA
的质粒接种2～3d龄乳鼠,对照组乳鼠在攻毒后1～2
d全部死亡,而接种了表达siRNA的质粒组的乳鼠在
20LD50攻毒剂量下,75%的乳鼠存活,在100LD50的
攻毒剂量下有 20%的乳鼠存活,研究还发现,接种表
达siRNA的质粒之前用表达VP1的质粒接种的乳鼠
存活率明显高于未接种表达 VP1的质粒接种的乳
鼠,他们推测这是由于VP1抗体的免疫记忆而造成
的。
FMDV的 VP1是变异率最高的区段,而 siRNA
对基因的抑制又存在高度特异性,所以理论上讲,
FMDV的保守区段应该是比较理想的靶序列,Liu等
[12]以FMDV的5′NCR、VP4、VPg、POL、3′NCR等区段
为靶序列设计并利用体外转录的方法获得了siRNA,
结果显示,这些siRNA
不 但 能 抑 制 O型 O/HKN/2002和 O/CHA/99
FMDV的复制,而且对Asia1型YNBS/58也有一定的
抑制作用,该研究表明了针对容易发生变异的RNA
病毒保守区设计合成 siRNA抑制病毒的复制是可行
的。Santos等[13]以A型FMDV非结构蛋白2B为靶序
列构建了一个表达shRNA的质粒,将其转染猪肾细
胞IBRS-2,然后接种FMDV病毒,与未转染质粒的细
胞相比,这些细胞中病毒的RNA和蛋白质合成量大
大减少,病毒滴度也相应下降,他们在实验中排除了
干扰素抑制病毒复制的可能性,因此该抑制作用是有
RNAi造成的,值得注意的是,该 shRNA除了对 A型
FMDV的复制有抑制作用外,还可以抑制O、C、SAT2
型的复制,且不同血清型间靶序列有1～2个核苷酸的
差异。同样,Kahana等[14]通过对不同血清型FMDV的
序列比较分析,选取三个保守区作为靶序列,其中一
个在3B区、两个在3D区,利用人工合成siRNA并将
其转染BHK21细胞,18h后接种FMDV,结果发现三
个 siRNA联合转染细胞时对病毒的抑制率可达
100%。Mohapatra等[15]选择 Asia1型 FMDV的 VP3-
VP1、2A-2C、3D-3UTR区段作为 siRNA的靶序列,人
工合成siRNA并同时转染细胞后对病毒有明显的抑
制作用,针对保守区设计合成的siRNA可对感染24h
的A、O、C、Asia1四型FMDV有99%的抑制,48h时仍
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有抑制作用,该实验也发现,当 siRNA与靶序列有一
个核苷酸的差异时并不影响抑制效果。
最近,Chen等 [16]采用人重组腺病毒为载体表达
siRNA,并评估了其在猪 IBRS-2细胞、豚鼠以及家猪
中对FMDV的抑制效应细胞,结果表明,腺病毒能够
完全抑制FMDV在细胞水平的复制;在豚鼠实验中,
腺病毒的抑制效应亦十分显著,但无论如何改变实验
条件动物均无法获得100%保护;在 FMDV易感动物
家猪中,颈部肌肉注射腺病毒能够明显减轻FMD疾
病症状,降低血清中FMDV的抗体水平;这是世界上
第一个有关 RNAi在 FMDV易感动物水平有效性的
评估工作。
4 结 语
迄今为止,RNAi技术已经运用到了人类其他多
种重要病毒[17],它们包括:脊髓灰质炎病毒(poliovirus,
PV)、甲型肝炎病毒(hepatitisAvirus,HAV)、登革热
病毒(denguevirus,DENV)、轮状病毒(rotavirus)、疱疹
病 毒 (herpesvirus)、 人 类 多 瘤 病 毒 (human
polyomavirus)等。RNAi作为一种抗病毒策略,在其真
正应用于临床之前,仍需解决以下几个问题:一是如
何提高RNAi的效率,目前,siRNA主要来源于人工
化学合成和在 RNA聚合酶Ⅲ启动子调控的 siRNA
表达载体,这两种方法均需要大量的材料,花费较大;
研究证实,反转录病毒载体和腺病毒载体能够携带
siRNA进入特定细胞并持续长久地产生 RNAi[18],但
其抑制病毒的效率还有待提高深入研究。二是病毒的
逃逸,如何解决病毒频繁突变和RNAi高度特异性之
间的矛盾是siRNA设计方面的难点。人们通过将细
胞表面病毒受体或协同受体作为 siRNA的识别靶
位,不但可以减少突变病毒粒子的逃逸,还能有效地
抑制封闭于浓缩的蛋白 RNA复合体中的病毒 RNA,
从而最大限度地发挥siRNA抑制病毒的作用。另外,
siRNA在抑制病毒核酸复制的同时也能激发病毒对
RNAi的耐受性。虽然这种具有耐受siRNA的病毒粒
子在最初的病毒群体中就已存在,但是,在转染
siRNA的压力选择下使这种具有耐受性的病毒粒子
得到了选择优势。所以,在研究siRNA抑制病毒感染
的实验中,应尽量使用多种 siRNA以避免病毒对
RNAi产生免疫性。所有的RNAi研究中都存在一个问
题,那就是并非所有的 siRNA都能起到同样的抑制
作用,这种现象的具体机制目前还不清楚,有人推测
可能与病毒RNA序列和二级结构有关。三是病毒感
染对 RNAi作用的抑制,研究表明,由流感病毒和痘
苗病毒编码的抑制干扰素诱导的先天性免疫应答的
抑制剂也能在病毒感染的昆虫细胞抑制RNAi[19],所
以确定抑制剂并消除抑制作用是关键问题。四是
siRNA引起的副作用,虽然siRNA仅有21～23bp长,
但是它可能通过调节 IFN的表达量而引起非特异免
疫应答 [20],很明显,在应用siRNA抗病毒之前确定
siRNA的副作用是必需的。RNAi治疗试剂的应用是
否会对细胞的正常生理过程产生负面影响,也需要进
一步的论证。五是如何在生物个体内实现有效的组织
特异性的siRNA转染,有必要的情况下,如何在细胞
与细胞、组织与组织间实现 RNAi效应的系统性扩
散。由此可见,应当针对以上问题进行深入研究,找到
解决方案,才能使RNAi更能切合临床抗病毒治疗的
需要。
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