全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2006年第3期
RNAi现象大致可分为三种,其作用机制大致
相同,不同的研究小组对它的命名不同。植物学家
称之为共抑制,菌类学家称之为静息作用,昆虫学
家和动物学家称之为 RNAi。RNAi在维持基因稳
定、保护基因组免受外源核酸侵入、基因表达调控
等方面发挥重要生物学作用。RNAi作为基因沉默
的一个工具,已被广泛用于基因功能的研究、基因
治疗和新药研究与开发等方面[2]。
1 RNAi的发展史
RNAi首先是在 1990年由 Jorgensen等人在研
究矮牵牛花中发现的一种转基因同时抑制自身和
相应内源基因表达的基因沉默现象。他们本欲通过
加入外源色素合成基因拷贝而产生出更深的紫色
牵牛花,但是实验并为达到预期的结果,有的转基
因植物开出全白或部分白的花,这表明色素的合成
不是被加强而是被抑制。事实上,不仅导入的基因
没有表达,植物自身的色素合成基因的表达也失活
了,这种现象被称为基因的工抑制现象。1994年,
Macino和 Congoi发现将合成类胡萝卜所需的基因
导入粗糟红色链孢霉,导致 30%的转化细胞中霉菌
本身的基因失活,并将其称之为基因的静息作用。
1995年,康乃尔大学的 SuGuo博士在试图阻断秀丽
新小杆线虫(C.elegans)中的 pal-1基因时,发现了
一个意想不到的结果,他们本想利用反意 RNA技
术特异性地阻断上述基因的表达,同时在对照实验
中给线虫注射正义 RNA(senseRNA)以期观查到基
因表达的增强,但达到的结果是二者都同样地切断
了 pal-1基因的表达途径,这是与传统上反义 RNA
技术的解释正好相反的。直到 1998年 2月,华盛顿
卡耐基研究院的 AndrewFire和马萨诸塞大学医学
院的 CraigMello才首次揭开这个谜。通过大量艰苦
的工作,他们证实,SuGuo博士遇到的正义 RNA抑
制基因表达的现象,以及过去的反义 RNA技术对
基因表达的阻断,都是由于体外转录所得 RNA中
污染了微量双链 RNA而引起。
当他们将体外转录得到的单链 RNA纯化后注
一种新的基因敲除术- RNAi
李颖平 1 张映 1 邵国青 2
(1山西农业大学,太谷 030801;2江苏农业科学院,南京 210014)
摘 要: RNAi作为关闭特定的基因新技术,为基因功能研究提供了一个快速、简便的方法,RNAi主要通过dsR-
NA被核酸切割成21~25nt的干扰小RNA即siRNA,由siRNA介导的识别并切割同源性靶mRNA分子而实现。RNAi
是新发现的一种通过dsRNA特异性高效抑制基因表达途径。在随后的短短几年中,RNAi现象被发现存在于大多数真核
生物中,这种存在揭示了RNAi可能是出现于生命进化的早期阶段[1]。
关键词: RNAi分子机制 应用及前景
A New Technology to Delete Gene-RNAi
Li Yingping1 Zhang Ying1 Shao Guoqing2
(1Shanxi Agriculture University, Taigu 030801;2Institution of Science of agriculture in JiangSu province, NanJing 210014)
Abstract: RNAi is regarded as a new technology of closing special genes, which offers a simple and quick way
for research of genetic function. Rnai is achieved mainly by dsRNA cutted into 21~25nt small RNA just as siRNA, by
which mediate and recognize holmologous goal mRNA molecule. RNAi is a new method resently found by dsRNA,
which specially hold down gene expression[1].
Key words: RNAi molecule Mechanism Application and prospect
收稿日期:2006-03-13
作者简介:李颖平(1980-),女,硕士,E-mail:liyingping_0820@163.com
2006年第3期 李颖平等:一种新的基因敲除术-RNAi
射线虫时发现,基因抑制效应变得十分的微弱,而
经过纯化的双链 RNA却正好相反,能够高效特异
性阻断相应基因的表达,这一发现被称为 RNAi
(RNAinterference)[3]。
2 相关术语
2.1 dsRNA
双链 RNA的形成可以通过几条途径实现:(1)
在生物体内,当病毒入侵,转座子(TE)转录和基因组
中的反相重复序列转录时,细胞中的 RNA可以通过
两个 RNA互补链结合成分子间双链 RNA,也可以通
过单个 RNA链自身回折,形成分子内双链 RNA,
(2)在生物体外,主要是利用人工合成一对互补
的单链 RNA,然后可以先导入生物体内,在体内互补
为双链 RNA,或先在体外互补为双链 RNA然后再导
入体内。
2.2 RdRp(依赖于 RNA的 RNA聚合酶)
dsRNA导入生物体内后,首先要经过一组特异
的蛋白复合物识别 dsRNA,经 RdRp以双链为模板复
制 cRNA,使双链 RNA浓度达到干涉所需的浓度。
2.3 Dicer酶
Dicer酶是 RnaseⅢ家族中可以特异识别 dsRNA
的一种酶,这种酶具有接旋活性,在进化中具有保守
性,在催化过程中需要 ATP的参与,通过接旋酶区
域来指导 dsRNA解旋。有试验证明 Dicer酶不作用
于单链 RNA,它一般作用于长度在 200~500bp的双
链 RNA,对于更短的 RNA,Dicer酶没有活性,这与
RNAi对双链 RNA的要求基本一致。由此看来,可
能正是 Dicer酶对底物的要求决定了 RNA对导入
RNA的限制。Dicer酶可消化 dsRNA。单有实验证
明,在动物中 Dicer酶可以将双链 RNA分解为两类
截然不同功能的微小 RNA,微小 RNA(miRNA)和小
干涉 RNA(siRNA)。其中 miRNA调节 mRNA的翻
译,而 siRNA则指导经 RNAi途径对 mRNA的破坏
作用。
2.4 siRNA(小干涉 RNA)
siRNA特异识别 mRNA在近年的研究中发现,
siRNA是 RNAi作用的重要中间效应分子,siRNA长
度大约是 21~25nt,是一种特殊的双链 RNA。特点:
3端为羟基,5端为磷酸盐,其中 3端有突出 2~3
个不配对的碱基。
2.5 RISC
它是由 siRNA的反以链指导合成的一种核蛋
白复合体,在 RISC的指导下,靶 mRNA替换 siRNA
的正义链,从而和 siRNA中的反以链互补结合,随
后结合在 RISC上的 RnaseⅢ会从反义链一段切割
靶 mRNA为 21~23nt的小片段。
3 RNAi的作用机制[5]
第一步 双链 RNA的产生。
dsRNA是诱导细胞 RNAi的关键组分,外源
DNA序列可激发细胞中 RNA依赖的 RNA聚合酶
的催化下,合成病毒的 RNA序列的互补链,并与之
结合形成 dsRNA。DNA病毒,重组基因,转基因等
DNA序列,在细胞转录出 RNA后,经 RdRp形成
dsRNA,而由于转座子其本身具有反相重复序列,细
胞可以通读转录这种反相重复序列直接产生 dsR-
NA;细胞中正义和反以 RNA的同时转录也可以产
生 dsRNA;线虫中可以通过注射或浸泡在 dsRNA溶
液中等方式引入外源 dsRNA;这种 dsRNA可以是分
开的两个 RNA分子互补形成双链,也可以是一个
RNA分子回折,自身互补,形成分子内双链。然而,
细胞是如何判断那些 RNA和 DNA是“异己”进而产
生相应的 dsRNA,其机制尚不清楚。
第二步 siRNA的形成。
形成的 dsRNA要在细胞中大量扩增,当其在细
胞中达到一定量时,会被一种特异的核酸内切酶
(Dicer酶)切割,含有解旋酶活性和 PAZ结构域。在
此酶的作用下,细胞中的单链 mRNA,会与 dsRNA
的正义链发生互换,原先的 dsRNA中的正义链被
mRNA代替,从酶 dsRNA复合物中释放出来,而
mRNA则处于原先的正义链的位置,此后,在 ATP
的参与下,细胞中存在的另一复合体—RNA诱导的
沉默复合体利用结合在其上的核酸内切酶活性切
割靶 mRNA分子中与 dsRNA反以链互补的区域,
形成了 21~23的核苷酸长的 dsRNA小片断,称之为
短干涉 RNA。它又可以指导形成 RISC复合体。
第三步 RNAi的形成。
SiRNA还可以作为一种特殊的引物,在 RdRp
酶作用下以靶 mRNA为模板合成 dsRNA分子,新
的 siRNA又可进入上述循环,这种过程称为随机降
解性聚合酶链式反应(randomdegradativePCR)。新
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
生的 dsRNA反复合成和降解,不断产生新的 siR-
NA,从而使靶 mRNA渐进性减少,导致目的基因的
沉默,呈现 RNAi现象。
4 RNAi的特点
4.1 RNAi的基本特点
(1)RNAi介导的是转录后水平的基因沉默
(PTGS)机制。
(2)高稳定性。以 3端悬垂 TT碱基的 dsRNA
尤为稳定,无需像反义核酸那样进行广泛的化学修
饰以提高半衰期。
(3)高特异性。SiRNA除正义链 3端的两个碱
基在序列识别中不起主要作用外,其他单个碱基改
变就可能使 RNAi失效,而针对同源基因共有序列
的 RNAi则导致同源基因共同失活。
(4)高效率。少量的 dsRNA分子就能完全抑制
相应基因的表达,能在低于反义核酸几个数量级的
浓度下研究目标基因;比基因敲除术更快,更简单。
而且,那些在胚胎中敲除后导致死亡的基因,也可
以利用 RNAi的方法在培养细胞中进行研究。
(5)双干涉系统。哺乳动物中存在两条相互独
立的“干涉”途径:非特异性干涉反应,由>30bp序列
的dsRNA介导,可导致整个细胞非特异性蛋白合成
抑制及 RNA降解;特异性干涉反应,由 21~23nt的
siRNA 介导,可逃避非特异性干涉系统的“监控”,
只降解与其序列相应的单个基因的 mRNA;
(6)高穿透性。RNAi抑制基因表达的效应可以
穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持,
在线虫中干涉效应甚至可以传递到后代中去。
4.2 RNAi技术优点
RNAi技术与其它几种进行功能丧失或降低突
变的技术相比,RNAi技术具有明显的优点。
首先,它比反义 RNA技术和同源共抑制更有
效,能在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使目
标基因表达降到极低水平甚至完全“剔除”,从而产
生缺失突变体表型。因此,更容易产生功能丧失和
降低突变。
其次,与 TDNA技术造成的功能永久性丧失相
比,RNAi技术通过与细胞特异性启动子,及可诱导
系统结合使用,其抑制基因表达的时间可以随意控
制在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行,
这是很受科学家欢迎的。
第三,与传统的同源重组基因剔除技术以及
RNA、DNA嵌合分子介导的高效基因转变都只能一
次改变一个基因相比,利用 RNAi可以实现多种基
因的改变,这是利用传统的基因突变的方法无法实
现的。
具体地讲,RNAi技术可以利用同一基因家族
的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一
特性,设计针对这一区段序列的双链 RNA分子,注
射一种双链 RNA即可以产生多个基因同时剔除的
表型,也可以同时注射多种 RNA而讲多个序列不
相关的基因同时剔除。它可以仅仅在一周时间内关
闭 10个基因表达。比基因剔除技术更快更高效,。
此外,联合利用传统的缺失突变技术和 RNAi技术
可以很容易地确定复杂的信号转导途径中不同基
因的上游关系;RNAi还可以产生基因降低表达的
各种表型[4]。
5 siRNA的合成
早期,对于基因的研究,siRNA由化学合成。近
来,Ambion公司引进一项成套设备来进行体外的
siRNA的合成。并且一个试剂盒可以自行设计合成
多个 siRNAs,灵活性和可控性都明显提高,特别是
有多个 siRNA需要合成的时候,不失为一种经济的
选择,其中涉及的 DNA合成的价格就便宜多了,即
使是全球最著名的 DNA合成供应商 Operon,也就
是 7~9块钱一个碱基,通过专用的 RNA转染试剂,
瞬时转染可以将这些 siRNA转入细胞内进行实验。
6 RNAi的生物学意义
维持基因组稳定;保护基因组免受外源核酸的
侵入;基因表达调控。
7 RNAi的应用[6]
7.1 探索基因功能的有力工具
RNAi已经被应用到线虫的系统性功能基因组
研究上,RNAi作为一个常见的基因敲除工具,它的
应用范围可以从单细胞的原生动物一直扩展到人。
虽然 RNAi已被广泛应用到不同种生物,但仍然有
许多问题有待阐明。在功能基因组中的研究,需要
对特定基因进行功能丧失或降低突变,以确定其功
能,RNAi技术正合此意。
7.2 抗病毒开发新药
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2006年第3期
(上接第 13页)
8 NorioM,HironoriN,RyuichiM,etal.BiochemBiophResCo,
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14 朱以华,王强斌,等.中国医学科学院学报,2002,24(2):118～
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17 ItoA,HayashidaM,HondaH,etal.TissueEng,2004,10(5～6):
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18 ItoA,TakizawaY,HondaHHata,etal.TissueEng,2004,10(5～
6):833～840.
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
可以利用 RNAi技术产生抗病毒的植物和动
物,使其转录产生相应于病毒繁殖关键基因的双链
RNA,从而抵抗病毒的入侵和繁殖,而且可以利用
不同病毒的转录序列中高度同源区段相应的双链
RNA实现抵抗多种病毒;RNAi技术可以抑制转座
子活动,防止自私基因的序列的过量增殖,控制生
物体的发育和调控基因表达。研究还表明,RNAi效
应可以由线虫成虫传递给子代,暗示获得性遗传有
可能存在,通过吞食大肠杆菌,线虫还能从大肠杆
菌获得 RNAi信号,说明 RNAi信号还能实现种间
传递。线虫和果蝇的全基因序列都已测序完毕,发
现大量未知功能的新基因。
7.3 基因治疗
RNAi技术为某些疾病的基因治疗提供新的思
路,通过 RNAi技术抑制癌基因的表达,,可能成为
一种新的癌症基因治疗策略,最后,人们可以利用
能抑制 RNAi的病毒蛋白来预防转基因所诱发的
RNAi,使转基因得到充分的表达[7]。
8 展望
Bosher认为 RNAi将是未来十年生物学研究中
最激动人心最有可能产生丰富成果的领域之一。尤
其是对细胞中基因功能的分析和基因特异性的治
疗方面的突出优势,在未来的发展中将具有更加广
阔的发展前景。由于能够快速而简单地制备某个功
能缺失表型,使得更多的研究人员投身于 RNAi的
研究之中。尽管目前对这项功能强大的技术已经有
深入的了解,但是几乎每天都有新的结果不断涌
现,可以毫不夸张地说,RNAi正在功能基因组学领
域掀起一场真正的革命。
RNAi已被广泛应用到不同种生物,但仍然有
许多问题有待我们进一步阐明,例如:不同种生物
是否沿用同一种 RNAi机制,RNAi机制本身又受到
那些调控,转录后的 RNAi是否与核内转录有某种
联系,RNAi是否与转录水平相耦联,RNA逆向信息
传递反作用于 DNA,生命的信息是否起源于 RNA,
如何更有效地将 siRNA导入哺乳动物的细胞,进行
基因功能的研究以及疾病基因治疗等。
参 考 文 献
1 孟祥兵,王秀芳.生命的化学,2001,21(2):111~113.
2 段发平,梁承邺.生物学通报,2002,37(3):15~16.
3 MarxJ.Science,2000,288(5470):1370~1372.
4 汤富酬,薛友纺.遗传,2001,23(2):167~172.
5 孙建国,陈正堂.生物化学与生物物理进展,2002,29(5):678~681.
6 陈忠斌,于乐成,王升启.中国生物化学与分子生物学研究学报,
2002,18(5):525~528
7 雷迎峰.国外医学分子生物学分册[M],2002,24(4):196~199.
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