全 文 ： 综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
嗜杀酵母的生物学功能及其应用
王贵双 1 张柏林1 梁学军2
( 1 北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083; 2 北京龙辉酿酒有限公司,北京 100039)
摘 要: 嗜杀酵母能够分泌毒素蛋白, 杀死敏感酵母。嗜杀酵母对自身分泌的嗜杀毒素具有免疫力。嗜杀
酵母的嗜杀特性与两种双链线状 RNA ( dsRNA)有关,即编码产生毒素蛋白的 M - dsRNA和编码自身和 M - dsRNA
外壳蛋白的 L- dsRNA。嗜杀毒素破坏细胞跨膜化学质子梯度, 造成 ATP和钾离子泄漏,导致细胞死亡。应用嗜杀
酵母可避免野生型酵母污染, 净化发酵体系, 改善发酵产物品质;嗜杀毒素也可作为抵制病原酵母和类酵母微生物
的抗真菌剂。
关键词: 嗜杀酵母 嗜杀毒素 嗜杀质粒 嗜杀机理
B iological Properties and Utilization from K iller Yeasts
W ang Gu ishuang
1 Zhang Bolin1 Liang Xue jun2
( 1School of B io log ical Science & Technology, Beijing Forestry Univer sity, Beijing 100083;
2B eij ing D ragon Seal W ine Lim ited C ompany, B eij ing 100039)
Abstrac:t K iller yeasts secrete prote in tox insw hich are letha l to sensitive stra ins but are imm une to the ir own tox ins.
Genera lly, the k iller pheno type has been linked to the presence of a doub le stranded RNA ( dsRNA ). M - dsRNA encodes
the k iller tox in synthesis, and L-dsRNA encodes them ajor v irus- like particle capsid prote in. K iller tox in acts on sensitive
ce lls by disrupting the norm al state o f electrochem ical ion grad ients, and induced a leakage o f ATP and potassium ions,
wh ich leads to ce lls death. The use o f industria l killer stra ins as sta rters can prevent industr ia l ferm entation from contam ina-
ting w ild yeasts. The most fasc inating applica tions is probab ly the po ssib le use o f se lected killer yeasts as sources o f nove l
antim yco tic agents, active aga inst pa thogen ic yeasts and yeast- like o rganism s.
Key words: K iller yeast K iller tox in K iller plasm id K ille rm echan ism
作者简介:王贵双 ( 1976-) ,女,黑龙江省人,硕士,研究方向:食品微生物与发酵工程, E-m ai:l w gspost@ 163. com
自然界中的低等生物或 (与 )高等生物之间普
遍存在拮抗现象,酵母菌也不例外。 1963年, Bevan
和 M akow er[ 1]在保存啤酒酵母菌 ( Saccharomyces cer-
evisiae)时,首次发现酵母菌株间存在相互杀死的现
象,带动了嗜杀酵母研究工作的展开。目前,已相继
发现啤酒、葡萄酒、清酒酿造中也存在嗜杀酵母现
象, 并从 球拟 酵母 ( T orulop sis ) [ 2]、毕 赤 酵母
(P ichia )
[ 3]、克鲁维酵母 (K luyveromyces ) [ 4]、汉逊酵
母 (H ansenula) [ 5]、假丝酵母 (Cand ida) [ 6]、有孢汉逊
酵母 (H anseniasp ora ) [ 7]、接合酵母 (Zygo saccharomy-
ces)
[ 8]、隐球酵母 ( Cryp tococcus ) [ 9] 和拟威尔酵母
(W illiopsis)
[ 10]等属的许多酵母中分离到嗜杀菌株。
嗜杀酵母 [ 11 ]是指某些酵母在其生长繁殖过程
中,能向菌体外分泌一种毒素蛋白的菌株,这种毒素
蛋白能够杀死同一属的敏感菌株, 较少情况下,也能
杀死不同属的敏感菌株。嗜杀酵母分泌的毒素蛋白
称为嗜杀毒素,嗜杀酵母对自身分泌的嗜杀毒素具
有免疫力。在酵母菌中, 根据酵母菌株间相互杀死
的现象,把产生毒素并能杀死同族及亲源关系相近
的酵母菌株称为嗜杀酵母; 被嗜杀酵母杀死的菌株
称为敏感酵母;既不能杀死其他酵母,也不能被嗜杀
酵母杀死的菌株称为中性酵母。不同类型的嗜杀酵
母的嗜杀活性不同,不同类型的嗜杀酵母对不同类
2006年增刊 王贵双等:嗜杀酵母的生物学功能及其应用
型的嗜杀毒素免疫力也不相同。因此, 根据酵母相
互杀死作用、嗜杀毒素的特性和免疫性, W ickner[ 12]
及 Y oung[ 13]等把嗜杀酵母分为 11种类型, 即 K1型
至 K 11型。
1 嗜杀酵母的遗传特征
1. 1 嗜杀质粒
一般情况下,嗜杀酵母的嗜杀特性是由具有自
我复制能力的细胞质遗传因子 - 双链线状 RNA
( dsRNA )决定的,而 dsRNA通常是以蛋白质外壳包
裹着的类病毒颗粒状态存在于细胞质中, 它与病毒
粒子不同,不具有体外侵染特性,所以称之为嗜杀质
粒。据报道,酿酒酵母中可能含有多种双链 RNA,
但研究表明只有两种双链 RNA 与嗜杀现象有
关 [ 12] :①一种是 M-dsRNA, 由 1. 0~ 1. 8 103 bp组
成,分子量为 1. 0~ 1. 7 106 Da; ②一种是 L-dsR-
NA,由 4. 6~ 4. 8 103 bp组成的, 分子量约为 2. 5~
3. 0 106Da。其中, M-dsRNA质粒只能从嗜杀酵母
中检出,嗜杀特性是由存在于嗜杀酵母细胞质中的
M-dsRNA质粒的遗传信息决定的。已经知道, M-
dsRNA质粒负责编码产生毒素蛋白及决定细胞对
自身毒素的免疫功能。相反, L-dsRNA在几乎存在
于所有的酵母细胞中,其功能是负责编码自身和 M-
dsRNA相关的外壳蛋白。以 K1型嗜杀酵母为例,
其嗜杀质粒是由双链线状 RNA ( dsRNA )构成, 以蛋
白质外壳包裹存在于酵母细胞的细胞质中。质粒具
有 RNA聚合酶活性及病毒素粒子的特征, 但不具有
体外感染能力。质粒有两种形式 (见图 1) [ 14] , M-
dsRNA由 1. 3~ 1. 8 103个 bp组成,分子量为 1. 5
106D a,而 L-dsRNA由 4. 5 103个 bp组成,分子
量为 3 106Da。
另外,少数报道也指出,有些菌株的毒素蛋白是
由染色体 DNA编码的 (如: S. cerevisiae KHS、KHR
以及 W illiopsism rak ii ),或者是由双链线状 DNA ( ds-
DNA)编码的 (如: K luyveromyces lactis, P ichia inosito-
vora或 P ichia acaciae )产生的 [ 15]。
1. 2 嗜杀毒素的生成与分泌
嗜杀毒素是嗜杀菌株分泌的蛋白质分子,嗜杀
菌株对自身分泌的毒素具有免疫性, 但对其他嗜杀
毒素敏感。尽管不同的嗜杀毒素具有不同的氨基酸
组成和分子运动模型,但它们在合成、加工和分泌过
图 1 嗜杀酵母 M-dsRNA, L-dsRNA琼脂糖凝胶电泳图 [14]
程中仍表现出一些共同的特征 (图 2) [ 16 ]。
以 K1型嗜杀毒素 (分子量约为 19kDa)为例,
它是由三个二硫键相连的 ( 9. 5kDa )和 ( 9.
0kD a)亚基组成的蛋白质分子。首先, 毒素在细胞
内以无活性的前体物质形式合成。 K1菌株 M1-
dsRNA表达的初级产物是一个由 316个氨基酸组
成的多肽前体物质 ( prepro tox in ), 分子量为 35kDa。
这个多肽前体物质包含 、、和 g四个区域, 在其
氮末端带有 44个氨基酸引物序列的区域称为 ;
区域后是由 103个氨基酸残基组成的 区域 (位置
是从第 45氨基酸到第 147个氨基酸 )以及由 83个
氨基酸残基组成的 区域 (位置是从第 234氨基酸
到第 316个氨基酸 )。在 和 亚基之间的是 区
域 (位置是从第 148氨基酸到第 233个氨基酸 )。
这个多肽 ( preprotox in)物质合成后, 在进入内质网
时会在侧链结合糖基, 并在引物序列的引导下进入
内质网,然后在肽酶的作用下, 在缬氨酸和丙氨酸
( Va-lA la)第 26位点处切除信号肽, 形成嗜杀毒素
的直接前体物 ( protox in), 这种毒素前体物质是一个
42kDa的糖蛋白质。剩下的 27到 44氨基酸片断可
能在高尔基体内被蛋白酶在 ProA rg44处切除。在
内质网中, 区域在 N端糖基化,或可能折叠成利于
转移到高尔基体的形式。在泡囊内,由内肽酶来水
解 区域的末端和 区域的氨基端 A rgArg149和 Ly-
sA rg
233肽键, 产生了 和 亚基。这样经过内质网,
高尔基体,泡囊的合成、修饰后, 、、、亚基分别
被肽酶切断,其中 、区域留在细胞内, 和 链以
二硫键结合排出胞外, 分泌为成熟的、有活力的毒
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
素。另外, 区域与嗜杀酵母的免疫性相关,嗜杀酵
母的免疫决定子涉及到 的中心域和 结构的 N
端。
图 2 酿酒酵母的嗜杀毒素生成、分泌及与受体作用机制 [ 16]
1. 3 嗜杀毒素对敏感细胞的致死作用机制
经对 K1型嗜杀毒素的动力学研究表明 [ 16 ] ,敏
感细胞拥有两个毒素结合位点, 这两个位点与毒素
的亲和力相差很大。嗜杀毒素首先以低亲和力、高
速率方式结合在细胞壁的受体上, 结合过程取决于
pH条件,其结合的最适 pH为 4. 6, 每个细胞平均约
有 1. 1 107个细胞壁受体。接着,嗜杀毒素以高亲
和力、低速率但在提供能量的条件下与细胞膜结合,
这一过程将产生最终的致死效应。
K 1毒素的 、链作用性质是不同的, 亲水的
链结合在敏感细胞细胞壁的受体 ( 1-6)--D葡聚糖
上, 链具有高度疏水性区域,与细胞膜上蛋白质的
性质类似,各疏水区域与细胞膜间形成小的空间,形
成膜上离子输送系统。
在正常情况下,酵母细胞的 ATP在 H+ -ATPase
的作用下水解,同时向外部释放质子,导致 pH差,
酵母细胞累积氨基酸以平衡细胞膜内外的浓度梯度
(在酵母中, 一些氨基酸与质子是协同运输的 )。由
于排出质子,酵母细胞为平衡其膜电位差而要吸收
和累积钾离子。当嗜杀毒素作用于敏感细胞时,嗜
杀毒素抑制质子 -氨基酸的协同运输和泵出质子,
由于抑制质子流出与抑制钾离子流入是相互关联
的,所以就抑制了钾离子的累积。在嗜杀毒素作用
的后期,由于毒素增加了酵母膜的离子渗透性,使细
胞内的 pH值随时间延长而降低 (正常细胞内部 pH
值为 6. 42,外部 pH 值是 4. 6) ,最终破坏了跨膜的
化学质子梯度, 导致 ATP和钾离子的泄漏, 抑制了
大分子加工, 最后导致了细胞的死亡 (见图 3) [ 17]。
K2型嗜杀毒素对敏感细胞的致死作用机制与 K1
型相类似。还有嗜杀毒素的致死作用机制是嗜杀毒
素初始结合在细胞壁的 -1, 3-甘露聚糖残基上, 引
起细胞周期的循环在 G2阶段停止, 导致母细胞与
子细胞不能分离,使母细胞细胞核的 DNA不能分离
给子细胞。
2 嗜杀毒素的生理生化特性
2. 1 嗜杀毒素的性质
作为蛋白质, 嗜杀毒素的活性受到不同环境条
件的影响。一般,嗜杀毒素在偏酸性环境下具有活
性。例如, K1型嗜杀菌株的毒素, 具有活性的最适
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2006年增刊 王贵双等:嗜杀酵母的生物学功能及其应用
图 3 酿酒酵母嗜杀毒素对敏感细胞的致死机制 [ 17]
pH范围一般为 4. 6~ 4. 8; K2型毒素最适 pH值为
4. 2~ 4. 4。
嗜杀毒素具有热敏性特点。在 25 左右, K1型
嗜杀菌株的毒素稳定;在 30 左右, K2型毒素稳定。
搅拌或添加蛋白酶可使毒素失活。在 26 下, K1
型嗜杀菌株的毒素在激烈振荡 25m in, 其活性为零;
K 1型嗜杀毒素中加入蛋白酶并反应一段时间后,其
嗜杀活性丢失,表明嗜杀毒素是一种蛋白质,蛋白酶
可消除其毒素的活性 [ 19 ]。
然而,也有文献报道, 某些嗜杀毒素的活性具有
较宽的 pH 值范围 [ 20 ] , 乳酸克鲁维氏酵母菌
(K luyveromyces lactis)产生的嗜杀毒素的 pH在 4. 0
~ 8. 0之间; 汉逊酵母菌 (H ansenula m rak ii )产生的
毒素 pH在 4. 0~ 9. 0之间; 拟威尔酵母菌 (W illiop sis
saturnus)产生的毒素 pH在 5. 0~ 8. 0之间。汉逊酵
母菌产生的嗜杀毒素具有较高的温度抗性, 可以耐
100C处理的条件, 拟威尔酵母菌产生的毒素可以
耐受 60 处理。
嗜杀菌株不同,其产生的毒素蛋白活性不同,因
而嗜杀作用条件也不同。秦玉静 [ 18]等的研究表明,
酿酒酵母嗜杀菌株 SK4和 ERR1产生不同类型的嗜
杀毒素,菌株 SK4产生 K 1型毒素, 而菌株 ERR1产
生 K 2型嗜杀毒素。 SK4菌株毒素蛋白的最适作用
pH值为 4. 8,而 ERR1菌株的毒素蛋白最适作用 pH
值为 4. 0。 SK4菌株毒素蛋白的最适作用温度为
16 , 而 ERR1菌株的毒素蛋白最适作用温度为
22 , 且两种毒素蛋白均是热不稳定性的 (见图 4
和图 5)。
图 4 pH 值与嗜杀毒素蛋白活性
图 5 温度与嗜杀毒素蛋白活性 [ 18]
2. 2 对各增殖期敏感酵母的致死作用
当在敏感酵母菌的培养液中加入纯化的毒素蛋
白会抑制其生长繁殖。一般, 进入对数生长期的嗜
杀酵母细胞的嗜杀活性最强, 而处于对数生长期的
敏感细胞对嗜杀毒素也最敏感。显然,毒素蛋白对
处于对数生长期的敏感细胞有显著的致死作用, 而
当敏感酵母细胞进入生长稳定期后,则对毒素的抗
性增强,毒素蛋白对敏感细胞的致死作用效果逐渐
减弱 (见图 6) [ 21]。
2. 3 嗜杀毒素生成条件
培养基的组成、pH值和培养温度等因素都会影
响嗜杀酵母分泌毒素蛋白的生成量 [ 19]。在最适 pH
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
图 6 毒素蛋白对敏感酵母的致死作用
和温度范围内, 毒素蛋白生成量达到最大。当以酵
母膏、牛肉膏或蛋白胨作为氮源时,能够快速提高嗜
杀毒素的生成量;然而研究也表明,添加量过大则不
利于毒素生成。当以胺化物、尿素、氨基酸或酪素作
氮源时,则毒素形成量少, 且形成速度迟缓。这可能
是因氮源不同导致嗜杀酵母细胞增殖量不同所致,
或者是因酵母膏、牛肉膏和蛋白胨等含氮化合物具
有促进嗜杀毒素形成, 保持嗜杀毒素活性的特性所
致。
2. 4 嗜杀酵母的分离
实践中,嗜杀酵母的分离是在培养基中加入美
蓝溶液 (最终浓度为 0. 003% )和已知的敏感菌株
(最终浓度为 105个细胞 /m l)。将培养好的待测菌
株接种到添加美蓝溶液的鉴定培养基中, 培养一定
时间后,若待测菌为嗜杀菌株的话,则在其周围会形
成蓝色的死菌带和抑菌圈 (见图 7) [ 22]。
图 7 嗜杀酵母周围形成的蓝色死菌带 [ 22]
此外,也可利用交叉法区分嗜杀菌株、敏感菌株和中
性菌株。即在加入美兰的培养基上,用标准嗜杀菌
株和敏感菌株分别在平板上划一直线,然后取待测
菌株划线,交叉于嗜杀菌株和敏感菌株的划线上,经
适当条件培养后观察结果。如果待测菌株为嗜杀菌
株,则与敏感菌株划线处呈现断开的蓝色死菌带;如
果待测菌株为敏感菌株, 则与标准嗜杀菌株划线的
交叉处呈现断开的蓝色死菌带; 如果待测菌株为中
性菌株,则与标准嗜杀菌株及敏感菌株的划线处,均
呈现生长。
嗜杀菌株的毒素活性分析常用 Woods和 Be-
van
[ 23]提供的孔穴法 ( w e ll test)技术检测。即在培
养敏感酵母的固体平板上钻取直径 6~ 10mm的孔,
在孔内注入适量分离提纯的嗜杀毒素, 经过培养后,
测定孔周围形成的抑菌圈大小,嗜杀毒素浓度越高,
则抑菌圈越宽,活性越强。
3 嗜杀酵母的应用前景
3. 1 防止野生型酵母污染
果酒工业化发酵中,常有野生型酵母污染,导致
发酵迟滞或停止, 使得最终产品质量差。为了克服
这一问题,使用工业嗜杀酵母作为起始菌株,可以有
效预防污染野生酵母菌的污染。此外,如果通过遗
传育种技术,将野生嗜杀酵母中的嗜杀基因转移到
优良生产用酵母中去,也可以使其获得嗜杀活性,这
样发酵菌株就具有杀死污染的野生酵母的作用, 达
到净化发酵体系,确保发酵正常进行的作用。
3. 2 酵母种内特征鉴定 (指纹识别 )
具有医疗和工业价值的酵母菌株都属于特定的
酵母种,但它们对来源不同的嗜杀毒素会表现出不
同的敏感性,因此, 可以利用酵母的这一特性来进行
特定酵母菌株的鉴定 (或称为指纹识别 )。目前, 这
种识别技术已被建议用来做为其他酵母生物型鉴定
过程的补充方法,它有助于识别从临床标本中分离
出的菌株的来源。在工业发酵中,这种方法可用来
鉴定专门的菌株 [ 20]。
3. 3 嗜杀毒素可作为一种新型的抗真菌剂
随着研究的不断深入, 人们发现嗜杀酵母的毒
素对很多原核及真核微生物也具有嗜杀性。因此,
人们期望能将嗜杀毒素作为一种抗真菌剂, 抵制病
原酵母和类酵母微生物的浸染。目前,已利用纯化
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2006年增刊 王贵双等:嗜杀酵母的生物学功能及其应用
的嗜杀毒素来治疗皮肤的真菌感染问题。当然,这
种新型抗真菌剂所面临的问题是当毒素超过其稳定
的 pH ( 5. 0~ 5. 5)和温度 ( 25~ 30 )范围时, 就会
失去活性和稳定性, 这是因为嗜杀毒素的稳定 pH
值和温度范围与人体皮肤环境是不同的。
然而,因自然环境中可以分离数量众多的嗜杀
酵母菌,故利用自然界微生物的生物多样性,人们有
理由相信,未来分离选育出对病原酵母菌具有更加
广泛嗜杀活力的嗜杀菌株的可能性是非常高的,使
其具有更加广泛的 pH 值和温度范围, 满足医疗应
用。近年来,利用适当的选育方法已经分离出新的
嗜杀毒素,表现出更加广泛的 pH值和温度范围。
4 嗜杀酵母的研究进展
在酿造过程中, 防止野生酵母和细菌的侵染是
至关重要的。在国外, 人们已在清酒 [ 24]、葡萄
酒 [ 25]、酒精发酵 [ 26]、啤酒 [ 27]生产中使用了嗜杀菌
株。国内近年来也开展了嗜杀酵母方面的研究工
作。鲍小明 [ 28 ]利用电融合构建嗜杀啤酒酵母, 经过
混合发酵试验证明可有效防止野生酵母的污染,具
有开发利用的潜在价值。杜连祥和王昌禄 [ 29 ]利用
核融合缺陷细胞融合技术,将嗜杀质粒转移到受体
菌酿酒酵母中,获得了优良性状的融合子,该融合子
具有与亲株同样的酿造性能,能抑制野生酵母菌污
染,对于保证啤酒纯种酿造及提高成品啤酒的生物
稳定性具有明显效果。曾少敏 [ 30]等利用嗜杀葡萄
酒酵母对芒果酒发酵进行试验, 与一般酿酒用的高
活性酵母进行对比实验显示,采用嗜杀酵母能净化
发酵体系, 缩短发酵周期, 提高出酒率, 稳定酒质。
杜金华 [ 31]等采用核融合缺陷原生质体融合技术,将
供体菌中的嗜杀质粒转移到受体菌苹果酒酵母中
去,筛选出了遗传性状稳定的嗜杀苹果酒酵母。显
然,嗜杀酵母的研究工作对于提高酒的酿造工艺技
术水平有重要的应用前景。
参 考 文 献
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