全 文 ：农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究进展
刘丽霞 李德全*
(山东农业大学生命科学学院,山东省作物生物学重点实验室,泰安 271018)
摘 要: 玉米( Zea may s L . )是世界上三大主要粮食作物之一, 至今其遗传转化仍比较困难, 目前报道有多
种成功的方法,其中农杆菌( Ag robactier ium tumef aciens )介导法是当前玉米遗传转化的主要方法。本文综述了农
杆菌介导的玉米遗传转化研究的发展历史、存在问题和影响因素等,并对未来发展趋势进行展望。
关键词: 玉米 遗传转化 农杆菌
Genetic Transformation System of Maize Mediated by
Agrobactierium tumef aciens : A Review
Liu Lix ia Li Dequan*
( Col l eg e of L if e S cie nces , S hand ong A gr icul tur al Univ er sit y ,
Sh andong K ey L abor atory of Cr op Biolog y , Tanan 271018 )
Abstract: Maize (Zea may s L. ) is one o f the three main crops o f the w or ld. Maize genet ic tr ansformation is
st ill somewhat difficult at pr esent. Many successful methods have been repo rted, of w hich the genetic tr ansfo rma
tion mediat ed by Ag robacterium is a major appro ach. In this review , recent pro g resses in genet ic transformation o f
maize mediated by Agrobacter ium, its pr oblems, and influent facto rs et al. w ere discussed, and its future advances
were also pro spected.
Key words: Maize (Zea may s L. ) Genetic t ransfo rmation Agrobactierium tumefaciens
植物遗传转化是应用重组 DNA 技术、细胞组
织培养或系统转化技术, 有目的地将外源基因或
DNA 片段插入到受体植物基因组中,并在其后代植
株中得以表达的过程。以 Potrykus等为代表,在国
际权威杂志 Biotechno logy 和 N ature都发表其悲观
论点:单子叶植物尤其是禾本科作物不是农杆菌的
天然宿主,不易被农杆菌感染[ 1, 2] ,这在一定程度上
阻碍了农杆菌转化单子叶植物的应用与发展。但由
于农杆菌介导法具有操作方便、费用低廉和安全稳
定等独特魅力, 吸引着各国学者在该领域的探索, 特
别是利用根癌农杆菌转化重要禾谷类作物如水稻、
小麦、玉米的方法。直到 20世纪 90年代以后,由农
杆菌介导转化这三大粮食作物才取得成功, 并逐步
发展成熟,大量的研究结果证明农杆菌可以转化单
子叶植物,目前已有多例禾谷类转基因植物已进入
田间试验阶段或应用于田间推广。
1 农杆菌介导的玉米遗传转化的研究历史
农杆菌 T i质粒介导的基因转化系统是一种天
然有效的遗传工程系统,由于 Ti质粒上有一段能够
进行高频率的转移 TDNA 区段, 而且在其左右边
界之间可插入大到 50Kb 的外源基因。在农杆菌浸
染植物细胞时, 信号物质激活 Vir 基因表达多种小
分子蛋白,这些小分子蛋白可以对 TDNA 左右边
界准确切割并形成 T复合体以及通道复合体将 T
DNA 准确转移并整合到感受态细胞的染色体中,完
成了转化过程, 但整合的详细机理仍不清楚。
Graves 等( 1986)试图通过在玉米幼苗中注射农杆
菌悬浮液对玉米进行遗传转化, 但没有成功[ 3]。同
收稿日期: 20050819
基金项目:国家自然科学基金(编号: 30471052)
作者简介:刘丽霞,女,汉族,在读硕士,研究方向:植物抗性及分子机制
* 通讯作者:李德全, Email: dqli@ sdau. edu . cn; T el: 05388249137
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
年, Hodge 等在相同的培养条件下观察到 A188 的
再生能力明显高于其它品系, 以其作为亲本的杂交
后代也表现出较高的再生频率 [ 4]。
1989年以前是农杆菌转化玉米探索的初级阶
段,瑞士科学家 Grimsley 等 ( 1987、1988) 将带有
MSV (玉米条斑病毒, M aize St reak Virus )基因的
根癌农杆菌 C58注入发芽 3d 的玉米种子幼苗分生
组织或靠近生长点的部位, 发现 7~ 14d 后 98% 的
玉米叶片上出现病毒感染的症状,并且生长点的部
位最易被农杆菌感染, 而玉米条斑病毒单独与玉米
共培养时不能感染玉米, 这说明通过农杆菌的介导,
病毒进入玉米细胞, 且在细胞核中复制,但不能证明
病毒 DNA 整合入玉米的基因组 [ 5]。Gould 等
( 1991)用 GU S 报告基因和 Npt 基因通过农杆菌
介导法转化玉米 Funk s G90 的芽尖, 得到的再生
植株及其子一代基因组中带有标记基因, 从而为玉
米建立高效的农杆菌介导的转化体系奠定了基
础[ 6]。Schlappi等( 1992)用带有玉米条斑病毒基因
感染玉米幼胚和胚芽鞘, 通过农杆菌对玉米幼胚亲
和性的研究,证明感受态的细胞是农杆菌转化所必
需的,只有那些再生和整合能力强的感受态细胞才
能得到转化植株,但大多数基因型玉米缺乏感受态
的细胞[ 7]。
Ishida 等( 1996)以玉米自交系 A188的幼胚为
材料建立了一套农杆菌介导的高效转化体系, 转化
效率高达 30%, 被誉为玉米转化史上的里程碑 [ 8]。
但如此高的转化效率仅仅针对于 A188,该自交系抗
虫抗病能力非常差, 雌雄不同期,在育种及推广方面
应用价值很小, 只能作为一种玉米转化的模式植物。
近年来,国内以齐319、18599(红、白)、综31等基因
型为材料进行农杆菌介导的遗传转化, 也获得了相
对较高的转化频率。随后, Lupot to 等 ( 1998)和黄
璐 等( 1999)也相继成功地实现了农杆菌介导的玉
米遗传转化[ 9, 10]。Zhang W 等( 2003)利用 Cre/ lo x
系统和一个由瞬间高温诱导的启动子(杂交和自动
切除策略)自动切除转基因玉米中的选择标记基因,
以达到重复利用选择标记基因及纯化基因组的目
的[ 11] ; Huang S 等( 2004)成功通过调控农杆菌转化
载体的左右两个边界转化再生出不含标记基因的玉
米[ 12] ; 这些方法解决了转基因玉米在食品安全方面
的顾虑。
2 农杆菌介导的玉米遗传转化中存在的问
题及相应对策
玉米是一种典型的单子叶植物,转化频率低是
玉米遗传转化中的主要问题,基因型、外植体选择以
及培养条件等都是影响玉米遗传转化的重要因素。
2. 1 农杆菌介导的单子叶植物遗传转化频率低
学术界普遍认为单子叶植物能否利用农杆菌转
化的关键因素是农杆菌能否吸附在植物细胞表面,
植物细胞能否产生激活 Vir 基因的信号分子, 以及
TDNA是否能够整合到植物基因组中 [ 13]。早期研
究认为,单子叶植物细胞缺乏农杆菌的附着位点,不
能被吸附[ 14]。许东辉 等( 1992)还从水稻中分离出
一种高效抑制农杆菌生长及抑制其在水稻细胞表面
附着的信号分子[ 15] 。Roberta 等( 1995)发现玉米等
单子叶植物完全能够被农杆菌吸附, 而且在转化过
程中加入外源酚类物质通常会提高转化频率。在玉
米遗传转化中应用的主要是根癌农杆菌, 根癌农杆
菌 T i质粒上 Vir 区基因的诱导是影响玉米遗传转
化的主要因素[ 16] ,主要是由于单子叶植物与双子叶
植物的创伤反应不同, 单子叶植物的伤口附近往往
发生木质化或栓质化, 且没有明显的细胞分裂发生,
细胞伤流液中不含有或含有极少 Vir 基因诱导物。
目前发现有 7种酚类化合物与诱导 Vir 基因表达有
关,其中 AS (乙酰丁香酮, A ceto syr ingone )和 OH
AS (羟基乙酰丁香酮, Hydroxyaceto sy ringone)最
为有效。Vir A 基因的产物是一种细胞膜内蛋白,是
植物细胞释放的酚类化合物的感受器, 农杆菌侵染
玉米的能力主要是由 Vir A 位点决定的[ 17] 。单子叶
植物和双子叶植物的细胞核输入途径存在潜在的选
择性, 农杆菌 TDNA 进入玉米细胞核主要是由
VirD 2和 VirE 2 产生的特殊细菌蛋白介导的[ 18]。
Hansen 等证明在 VirE2 蛋白存在时, 能使玉米转
化效率提高 2 倍[ 19] 。
浸染时农杆菌与受感染植株之间的相互作用产
生的过敏反应导致感染部位褐化或坏死, 从而影响
转化效率,对这种过敏反应的抑制也是提高转化频
率的一个方面。Bronw yn R. Frame( 2002)在共培
养时添加 400mg/ L 半胱氨酸有助于获得稳定的转
化水平,半胱氨酸作为一种抗氧化抑制剂可以提高
26 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
TDNA 转移到具有胚性的愈伤细胞中, GU S 基因
的瞬间表达以及转化频率的相应提高[ 20] 。杨剑波
( 1992)研究了玉米等几种禾谷类作物中酚类化合物
的数量和种类, 发现烟草和胡萝卜要少得多, 其中玉
米仅含没食子酸和间二羟基苯甲酸两种酚类物质,
含量仅为烟草的 1/ 3, 且这两种物质对 Vir 基因的
诱导活化效果较低,因此一些酚类化合物如乙酰丁
香酮( AS)被广泛应用于玉米农杆菌转化中 [ 21]。另
有报道指出一些小分子量的糖类,如半乳糖和葡萄
糖等在 AS浓度很低或没有时,也可极大地促进 Vir
基因的表达, 但在玉米转化上一般都添 AS。Mes
enss 等( 1990)从一粒小麦的培养物中分离到乙基
阿魏酸( EthylFerulate ) ,发现其在低浓度时具有比
AS更强的诱导 Vir 基因活性,所以有人指出单子叶
植物之所以对农杆菌不敏感可能与它们处于进化的
更高级阶段有关[ 22] 。但是农杆菌转化单子叶植物
的障碍不但与 Vir 基因是否充分活化有关, 还可能
发生于其他环节(如农杆菌菌株和表达载体类型)。
2. 2 基因型限制是农杆菌介导玉米遗传转化的普
遍问题
大量研究表明,玉米胚性愈伤组织的诱导明显
受到基因型的限制,能诱导较高频率胚性愈伤组织
的报道目前仅局限在 A188、B73等少数的基因型材
料中,大多数材料还不能诱导出胚性愈伤组织或诱
导率低,有的材料在继代过程中容易丧失胚性。杜
何为等以 A188、5003、综 31、黄早四、中糯 1号等玉
米自交系幼胚为材料研究发现玉米幼胚 型愈伤组
织的产生与外植体的基因型有一定的关系。其中
A188大多数能诱导出 型愈伤组织;综31次之; 其
他基因型 5003、黄早四、中糯 1号等只能诱导出
型愈伤组织,不能诱导出 型愈伤组织[ 23]。原亚萍
等( 1997)用吉林省常规玉米自交系及杂交种共 29
种基因型材料进行培养, 9 个自交系中愈伤诱导率
最高 98. 4% , 最低 26. 8% ; 10 个杂交种中最高达
99. 3%,最低 78. 8% [ 24] ,但用于转化的 型愈伤组
织仅占少数。潘光堂 等以综 31、18599 (红 )、18
599(白)培养力极高的玉米自交系和 A318、R15、
P138 培养力极低的玉米自交系为材料配制完全双
列杂交组合,当代进行幼胚培养,发现重复间差异未
达显著水平,说明胚性愈伤组织诱导受重复影响小;
基因型间差异占总变异的 92. 9% , 为极显著, 说明
幼胚培养产生胚性愈伤组织的能力在基因型间有极
明显的差异,并推论控制高胚性愈伤组织诱导率的
遗传主要为隐性基因 [ 25]。作者在用齐 319、郑 58、
Z674等自交系为材料进行试验,发现齐 319也是诱
导 型愈伤组织较好的一个品种。因此选择培养能
力强、综合性状优良的基因型是成功建立玉米转基
因受体系统的核心。
2. 3 取材部位的时期和发育状态是玉米遗传转化
的关键因素
选择合适的外植体是农杆菌转化玉米的一个关
键因素。研究表明, 玉米幼胚是诱导愈伤组织的优
良外植体[ 26] , 国内外许多学者以幼胚为外植体, 建
立了比较完善的组织培养体系。生长旺盛的玉米幼
胚 型胚性愈伤组织, 分裂旺盛,具有胚性的细胞或
组织(感受态细胞)的存在, 能够被农杆菌侵染, 这与
Vir 基因的诱导活化其实是不可分割的两个环节。
Schlappi和 Hohn ( 1992)用农感法( Agro infect ion)
研究 3个玉米品系幼胚不同发育阶段对农杆菌的感
受性, 发现授粉后 14 ~ 16d 的幼胚感染频率最
高[ 2 7]。Jelsus等在玉米分生细胞的 TDNA 转化中
发现授粉后 10d 前的未成熟胚不能被农杆菌感染,
而 12~ 20d 的未成熟胚转化率逐渐增高[ 27]。由此
可见, Vir 基因的诱导活化和 TDNA 的转移整合
与受体的生理状态密切相关。近几年的研究认为玉
米幼胚的感受态并不与授粉后的天数直接相关, 而
是与幼胚的大小相关, 因为不同基因型的玉米幼胚
生长发育快慢不同,王雷 等( 2001)在对胚龄和 2, 4
D 浓度对玉米自交系幼胚愈伤组织诱导率的影响的
研究中发现,相同胚龄的幼胚大小不同,且自交系间
有差异,幼胚太大( > 2. 0mm)太小( < 1. 0mm )都不
易于培养, 这一点与 Ishida 观点相同, 最佳大小应
为 1. 2~ 2. 0mm 大的幼胚比较适宜,而且幼胚在含
2, 4D( 2. 0mg/ L)的培养基上预培养后形成的新鲜
稳定的初始愈伤组织是更适宜的转化受体,作者认
为其原因正是激素的作用诱发了受体细胞的分裂分
化,也就是诱发了更多的感受态细胞[ 28]。关于这一
点 Gafni( 1995)、刘巧泉( 1998)均有论证, 经过比较
根癌农杆菌转化水稻不同受体的各种影响因素后指
出,水稻幼胚经较高浓度 2, 4D( 2mg/ L )预培养后
272005年第 6期 刘丽霞等: 农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究进展
(预培养4d )处于一种比较理想的生理状态, 从而比
较有利于农杆菌的附着和 TDNA 的转移[ 29] 。幼
胚的放置方式对幼胚的诱导愈伤组织能力也有很大
的影响,正确的做法是让盾片朝上,这样就抑制了胚
芽、胚根的生长,容易诱导出愈伤组织。将 2周左右
的初始愈伤组织用解剖刀分成 2~ 3块,继续培养更
容易诱导出型愈伤组织。
2. 4 培养条件对农杆菌转化玉米有重要影响
浸染后比较重要的影响因素是共培养的温度、
时间、培养基成分、光照等。在浸染前愈伤的诱导一
般以 28 暗培养居多。而浸染后适当降低共培养
温度,可以提高玉米自交系抗性愈伤组织筛选频率,
其原因可能是 28 为农杆菌最适宜的生长条件, 适
当降低共培养温度一方面可以降低材料表面没有转
进去的农杆菌活性, 延长共培养的时间,另一方面又
可以增加目的基因在材料细胞中整合和恢复。Ish
ide曾比较了不同培养基成分对转化的影响,认为玉
米遗传转化的适宜培养基为含有 LS盐的 N6培养
基,实验结果表明以 B5 微量元素组配的培养基抗
性筛选率均高于以 N6和 MS 微量组配的培养基。
作者在实验中还发现用 Gelrite 琼脂代替普通琼脂
在诱导型愈伤组织发生以及减少愈伤组褐化和水
渍化方面也起到一定作用。
3 农杆菌介导的玉米遗传转化的发展趋势
近年来,玉米的遗传转化取得了突破性进展, 在
进一步探索组织培养技术的同时,采用绕开愈伤组
织再生的转化途径很值得深入研究,萌动的胚和花
粉可能会成为理想受体。在众多的转基因技术中,
农杆菌 Ti质粒系统是较理想的转化系统,但转化方
法缺乏统一标准, 转化频率相对较低。在探索农杆
菌介导法转化改善玉米品质的同时,建立一套高效、
稳定、统一的转化体系,仍然是当前玉米转化研究热
点。农杆菌介导的基因转化有可能导致有益基因的
插入失活或本源基因的缺失或重排而造成某些非预
期变化[ 30, 31] ,因此, 对外源基因的定点插入问题有
待进一步研究。
叶绿体遗传转化系统为植物导入外源基因提供
了新途径[ 31] ,它不仅以定点整合方式导入外源基因
从而消除了位置效应及基因沉默,而且还具有超量
表达目的基因、母性遗传防止基因扩散等许多优点,
但其转化方法仍然局限于物理转化, 操作复杂成
本高。
由于普通转化中一般用抗生素作为选择标记,
这对高品质转基因作物的推广应用造成不利影响,
限制其商品化发展, 但另一方面带有标记基因的作
物可以深加工,用做工业原料,例如可以利用其种子
高淀粉含量来发酵制造工业酒精, 作为一种无污染
的工业原料, 是非常有前景的。无标记 ( M arker
Free)转化系统是当前玉米转化的新趋势[ 32, 33] ,即利
用某种特殊的转化系统, 切除阳性植株染色体中外
源选择标记基因的一种转基因安全策略[ 34, 35]。目
前玉米的遗传转化研究主要集中于单基因转化, 且
用于转化的有用基因为数极少, 但是自然界中植物
的许多性状是由多个基因控制的, 因此利用新的高
科技技术寻找更多的有用基因, 探索多基因的共同
转化以及无标记转化是当前研究的方向[ 34, 36]。一
旦无标记转化成为一种成熟的转化玉米的方法, 这
将巨大的促进安全饮食方面优质玉米的多样性发
展。
致谢: 山东大学生命科学学院张举仁教授指导 四川农业
大学玉米研究所潘光堂教授,山东农业大学农学院刘保申老师提供
玉米种子 特此感谢
参 考 文 献
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392005年第 6期 刘妍等:海洋放线菌研究的新进展