全 文 ：低温脂肪酶的研究现状与应用前景
陈贵元 魏云林*
(昆明理工大学生物工程技术研究中心, 昆明 650224)
摘 要: 低温脂肪酶在低温下仍保持高酶活, 因此在应用中有着中温脂肪酶无法取代的优越性, 而具有高活
性的低温脂肪酶因其具有理论和应用上的双重意义成为了近年来的研究热点。本文从描述产低温脂肪酶的低温
微生物特征入手,系统阐述了低温脂肪酶的来源、分类、特征、研究方法及最新进展, 并简述了低温脂肪酶在食品、
洗涤、制药以及低温环境修复等工业上的应用前景。
关键词: 低温脂肪酶 低温微生物 特征
The Research Status and Application Prospect of
Cold-Adapted Lipases
Chen Guiyuan Wei Yunlin*
( Biot echnolog y R esearch Center , K u nming Univ er sit y of Sc ie nce and Te chnolog y , K unmin g 650224)
Abstract: Co ld-adapted lipases have more advantag es than their counterpa rter- mesophilic and t hermophilic l-i
pases in applications, because they can r eser ve high activ ity ev en at ver y low temperatures. Because of their signif-i
cant valuable in theo retical r esear ch and applications, cold-adapted lipases have been received mo re attentions re-
cently and became one of r esear ch ho t spot s in the w or ld. In this paper , the or ig ins, characteristics, classificat ions
and structur al properties of co ld-adapted lipases ar e summar ized, and the pr og ress of research methods in this ar ea
also has been intr oduced. At the end, applicat ion pr ospects of co ld-adapted lipases in fo od, pharmacecut ical, low-
temperatur e bior emediation industry are descr ibed.
Key words: Cold-adapted lipase Cold-adapted micro or ganism Characteristics
脂肪酶( L ipase, EC 3. 1. 1. 3)是一类在油-水界
面上催化天然油脂(甘油三脂)降解为甘油和游离脂
肪酸的酶, 广泛存在于植物、动物和微生物中 [ 1]。目
前工业上应用的脂肪酶大多是中温和高温脂肪酶,
它们大多由微生物产生, 且基本上为胞外酶, 产酶的
最适温度多在 30 以上,而酶的最适反应温度一般
在 40 左右或更高,在 0 附近普遍丧失活性 [ 2~ 4]。
目前研究的低温脂肪酶一般由低温微生物分泌产
生,酶的最适反应温度一般均低于 40 ,而在 0 仍
具高酶活。由于它们普遍具有低温下酶活力高、抗
有机溶剂等特点,因而成为了近年来酶学研究的一
个热点。本文针对当前低温脂肪酶的研究现状进行
了总结并对其应用前景作了简要介绍。
1 产低温脂肪酶的微生物特征
地球上的极端环境是普遍存在的, 它们包括了
诸如高温低温、高酸高碱、高盐、高压和高辐射等环
境。即使在这些极为苛刻的环境中仍然生长着很多
微生物,如嗜热嗜冷菌、嗜酸嗜碱菌等。我们把这些
能在极端环境中生长繁殖的微生物称为嗜极微生物
( ex t remophiles) [ 5] 。低温微生物就是能在低温环境
下生长繁殖的微生物, 它们在基础研究和实际应用
方面均有重要价值。1975 年, M orita[ 6] 按生长温度
将这些生活在低温环境中的微生物分为两类:把在
低于 O 能缓慢生长, 最适生长温度不超过 15 ,
最高生长温度不超过 20 的微生物称为嗜冷菌
( psychrophiles)。而把在0 能生长 , 最适生长温
收稿日期: 2006-02-23
作者简介:陈贵元( 1975- ) ,男,云南弥勒人,微生物学硕士。主要从事低温脂肪酶研究
* 通讯作者: E- mail : w eiyunlin@ yahoo. com. cn.
生物技术通报
综述与专论 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
度在 20 ~ 30 之间,上限生长温度低于 40 的微
生物称为耐冷菌( p sy chr otr ophy s)。嗜冷菌和耐冷
菌在生理生化特征和生态分布上均存在差异, 它们
以其独特的生理功能长期生存在低温环境中, 研究
这些低温微生物不仅具有极其重要的理论意义, 而
且已产生了明显的经济价值[ 7, 8] 。
在长期低温环境下的生长适应过程中, 低温微
生物形成了一些独特的能耐受低温的理化特征。这
些特征主要包括以下几个方面 [ 5] : ( 1)合成更多不饱
和脂肪酸,增加细胞膜上不饱和脂肪酸的含量,以增
强细胞膜的流动性, 保证细胞内外物质的正常交换。
( 2)提高多元醇和海藻糖等细胞质低温防护剂的浓
度[ 9] , 或者过量表达冷适应蛋白和冷激蛋白以保证
细胞在低温下的正常代谢。( 3)表达特异性的具有
低温催化活性的低温酶。在低温条件下, 低温微生
物能特异性地合成分泌具有低温催化活力的酶, 并
利用这些酶在低温下高效地催化合成低温微生物生
命活动所需的物质,保证低温微生物在低温下能够
进行正常的生命活动 [ 7]。
2 低温脂肪酶的来源及分类
植物种子、动物组织以及微生物细胞中都富含
脂肪酶。而作为具有低温活性的低温脂肪酶则大多
是由低温微生物产生, 这些低温微生物主要分布在
南、北两极以及大洋底部等长期处于低温的环境。
目前所发现的产低温脂肪酶的低温微生物大都属于
假单胞菌属 ( P seudomonas )、气单胞菌属 ( A er o-
monas)等 [ 10, 11]。这些低温微生物在低温环境下经
过长期的进化, 形成了适应低温环境的特殊结构及
生理生化机制。
对脂肪酶的分类还没有形成一个完整的共识,
目前主要有两种分类方法: ( 1)按最适酶活 pH 值可
分为酸性脂肪酶和碱性脂肪酶, 一般植物种子和动
物胰脏所含的脂肪酶为酸性脂肪酶,而微生物所产
生的脂肪酶大多为碱性脂肪酶 [ 12~ 16]。( 2)按脂肪酶
家族可将脂肪酶分为八个家族[ 17] [ 、( GDSL)、
、( HSL)、、 、 、 ]。而脂肪酶家族 又
细分为 6 个亚科, 据报道, 假单胞菌属 ( P seud o-
monas)微生物产生的低温脂肪酶是一个显著的代
表,大多数假单胞菌属的脂肪酶可划分到 . 1 至
. 3 亚科。 . 1 亚科的脂肪酶分子量最小 (约
30KD ) ,绿脓杆菌属( Pseudomonas aeruginosa)和
草莓假单胞菌属( P seudomonas f ragi )是这一亚科
的代表。 . 2亚科与 . 1亚科具有 60%的脂肪酶
氨基酸序列相似性,由 320个氨基酸残基组成, 分子
量约为 33KD, 包括荚壳伯克霍尔德菌属 ( Burk-
holder ia glumae)和洋葱伯克氏菌属( Burkholder ia
cepacia)的脂肪酶。这两个亚科的脂肪酶分子都有
一个二硫键,而且需要有助蛋白的帮助才能完成蛋
白质的正确折叠和分泌。 . 3亚科的脂肪酶分子
量要比第一、第二亚科的分子量大的多,假单胞菌属
[ P seudomnas f luorescens SIK W1( 50KD) ]和假单
胞菌属[ Pseudomnas sp . str ain M IS38, ( 65KD) ]以
及沙雷氏菌属[ Ser ratia mar cescens , ( 65KD) ]的脂
肪酶是这一亚科的主要代表。这一亚科的脂肪酶分
子缺失了半胱氨酸残基, 从而失去了形成分子内二
硫键的能力,并且蛋白质的正确折叠不需要任何助
蛋白就能完成[ 10]。
3 低温脂肪酶的研究热点及方法
低温脂肪酶由于在低温下具有良好的催化活性
和低温适应性,引起了各国科学家们的广泛关注,并
投入了极大的热情对低温脂肪酶进行研究。低温脂
肪酶的研究已成为近年来酶学研究的一个热点, 尤
其对于低温脂肪酶是如何适应低温环境以及在低温
下如何保持高催化活性等问题更是研究的重点。此
外,为克服低温脂肪酶研究中普遍存在着的一些问
题,诸如酶的表达量低、难纯化以及热稳定性差等问
题,各国科学家也正开展着深入的研究。
随着现代生物技术和计算机技术的快速发展,
对低温脂肪酶的研究得到了不断深入, 研究方法和
手段也有了飞速提高。利用现代计算机技术对低温
脂肪酶的分子结构进行 3D建模模拟分析, 已经解
释了部分低温脂肪酶的低温适应机制和低温催化特
性[ 1 8]。而要进一步解释清楚低温脂肪酶的理化和
结构特征与低温适应性的关系, 无疑 DNA 芯片,蛋
白质芯片以及晶体结构分析技术将是今后研究方法
发展的方向。同样,针对低温脂肪酶的表达量低、难
纯化以及热稳定性差等问题也建立起了一些相应的
研究方法。比如: 利用基因工程手段对低温脂肪酶
分子进行克隆和异源表达使低温脂肪酶的产量提
高,在纯化低温脂肪酶时对传统的蛋白质纯化方法
30 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
进行改进,利用酶的固定化技术改变低温脂肪酶的
热稳定性等,运用这些方法已在低温脂肪酶的分离
和纯化以及相关研究中取得了一定成效 [ 15, 18~ 21]。
4 低温脂肪酶的理化特征和结构特征
根据 Mar gsin 等人的定义[ 22] , 可以把最适酶活
温度在 30 左右,在 0 左右仍有一定催化活性的
脂肪酶称为低温脂肪酶。研究表明,低温脂肪酶不
仅具有其它低温酶的共同特征[ 18 , 22] ,而且还有自己
的一些独特的理化特征, 归纳起来大致有以下 3点:
( 1)有机溶剂耐受性。在一定浓度的有机溶剂中低
温脂肪酶不仅不失活,酶活反而有所提高 [ 10, 11, 13, 15] ,
这一特性为低温脂肪酶今后在化学工业中的应用奠
定了基础。( 2)与大部分酯酶较偏好短链酯类不同,
大部分低温脂肪酶对含有 C3 ~ C10这一链长的甘油
脂具有更好的催化效率 [ 10, 11, 18]。( 3)相对于高温和
中温脂肪酶而言, 低温脂肪酶有更宽的 pH 适应范
围,这进一步拓宽了它的工业应用范围[ 13~ 16] 。
一般来说, 酶的理化特性是由其结构决定的, 但
对于如何从结构上解释低温脂肪酶的独特理化特
性,根据现有的研究结果还未能给出一个很好的解
释,需要作进一步的研究。
同理化特征一样,低温脂肪酶也具有其它低温
酶的一些共同结构特征, 但同时它们还具备了一些
独特的结构特征,综合起来主要有: ( 1)以丝氨酸为
催化中心, 具有以丝氨酸( Ser)残基为中心的催化三
联体结构( Ser-Asp-H is) [ 18]。( 2)一级结构中存在
大量亲水性精氨酸( Ar g) , 且大多暴露在蛋白质分
子表面。研究表明,亲水性基团的暴露对酶和溶剂
分子的相互作用的增强比较有利。( 3)钙离子配位
作用,钙离子配位作用使低温脂肪酶的热稳定性和
酶的催化效率得到显著提高[ 10, 18] 。
在低温脂肪酶的研究中, 结构研究得较清楚的
是从草莓假单胞菌属( P seudomnas f r agi )菌株 IFO
3458 克隆到的低温脂肪酶蛋白质 ( P seud omnas
f r agi lipase, PFL) [ 18]。在对 PFL 进行研究时发现
与同源的中温绿脓杆菌( Pseudomnas aeruginosa l-i
pase, PAL)和洋葱伯克氏菌脂肪酶( Bur kholderia
cep acia lipase, BCL)一样, PFL 的催化活性中心也
是一个以丝氨酸( Ser )残基为中心的催化三联体。
研究表明,精氨酸( Arg )和脯氨酸( P ro)的位置、二
硫键( disulphide bridge)的数目以及疏水中心之间
的相互作用决定着酶分子的柔韧性 ( flexibility )和
在不同温度下的催化活性 [ 23]。在对 PFL 进一步研
究发现,它与同源的中温脂肪酶 PAL 以及 BCL 的
不同之处在于精氨酸残基的数目, 三者分别为 24,
11, 9,并且在 PFL 的 3D结构中,全部的 24个精氨
酸残基中有 20个分布在蛋白质分子的表面,而只有
2个参与形成分子内部的盐桥( salt br idge) , 大量带
电荷的精氨酸残基分布在蛋白质分子的表面,增加
了蛋白质分子的柔韧性以及和溶剂之间的相互作
用,确保了酶在低温下仍能保持良好的催化活性。
相反地,二硫键的存在可增加蛋白质分子的刚性和
热稳定性,降低分子的柔韧性。在 PAL 和 BCL 分
子中普遍存在的二硫键, 在 PFL 分子中却丢失了,
降低了 PFL 的热稳定性,保证了其在低温下的高活
性。作为补充, PFL 分子中的两个芳香族氨基酸残
基( W184和 F244)替代了 BCL 分子中相应位置的
二硫键,形成堆叠反应( stacking inter act ion)而适当
增加了分子的稳定性, 保持了分子的立体结构的完
整性。另外, 在蛋白质分子的环结构和拐角处
( loops and turns)脯氨酸的存在往往可以增加蛋白
质分子的刚性而降低分子的柔韧性。上述三种同源
的脂肪酶分子中都含有 13个脯氨酸残基,其中 8个
分布在蛋白质分子的保守区域上, 其余的 5 个在
PAL 和 BCL 分子中多分布在环结构上, 而 PFL 分
子中仅有一个脯氨酸残基分布在环结构上,从而降
低了 PFL 分子的刚性, 增加了 PFL 的分子柔韧
性[ 1 8]。
5 应用前景
低温脂肪酶由于具有低温高催化活性, 耐有机
溶剂以及对热敏感等特点, 在食品、洗涤、制药、脂类
加工、低温环境修复等工业上有着巨大的应用潜力。
在食品、奶制品工业中,低温脂肪酶能在低温下
催化奶制品中的油脂放出含 C4 ~ C8之间的一些具
有特殊香味的短小碳链脂肪酸, 这对奶制品增香很
重要。同时,低温脂肪酶能在较低的温度下很快脱
去油脂,可避免食品在加工过程中由于长时间的高
温而影响质量和风味。在日常生活及纺织工业中,
目前所用的洗涤剂大都需在中温甚至高温下才能有
效的去除油污,且对织物有一定的破坏作用,而如果
312006年第 2期 陈贵元等:低温脂肪酶的研究现状与应用前景
采用含低温脂肪酶的洗涤剂, 不但能在低温下有效
去除油污,节约能源,而且不会破坏织物。在脂类加
工业中,在生产含有多个不饱和脂肪酸的甘油脂、可
可脂时,通常是采用传统的化学催化法进行生产, 需
在高温下进行, 以碱为催化剂,不仅能耗高, 且会导
致油脂水解。随着非水相酶学的发展, 化学催化正
逐步被酶催化所取代。原因很简单,用低温脂肪酶
催化生产不饱和脂不仅能节约能源,还能保证产品
质量。
尤其值得关注的是由于大多数低温脂肪酶都有
着接近自然环境温度的最适酶活反应温度, 因此它
们在环境修复领域大有用武之地,不仅可用于去除
低温状态下工业废物中的油脂,诸如:脂类加工所产
生的含脂废物和饮食业产生的含油脂废物等, 还可
以处理大量的城市和生活含脂废水和废物。用低温
脂肪酶处理这些含脂废弃物时,所需附加的热能低,
且安全、高效,不会造成二次污染,对环境保护有非
常积极的意义。而由于低温脂肪酶具有极高的选择
性和专一性,它们还可用于药物合成生产,这不仅能
有效提高手性化合物的产率, 而且在一定程度上降
低了产生副作用的几率, 同时减少了合成时所需的
能量,保证了药品质量。另外, 在制革工业中, 随着
人们对皮革的质量和卫生性能要求越来越高, 传统
的皮革脱脂方法由于大多采用碱性材料或有机溶剂
对皮革进行加热脱脂, 使皮革天然状态受到严重破
坏,降低了皮革质量,同时造成了环境污染。而利用
低温脂肪酶进行皮革低温催化脱脂时, 不需加热和
添加其它脱脂剂,不会造成环境污染,也能最大限度
地保持皮革的天然外观, 既节约了能源,又保证了皮
革的质量。
总之,低温脂肪酶由于其在低温下的高催化特
性,在工业上有着越来越广泛的应用前景。近年来,
随着对低温脂肪酶的研究越来越深入, 我们相信在
不久的将来会有更多的低温脂肪酶应用于各种工业
领域。
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