全 文 ：收稿日期:2010 － 07 － 07;修订日期:2010 － 08 － 07
作者简介:张国华(1983 －) ，男，江西上饶人，硕士，研究实习员，主要从事应用微生物研究。
基金项目:江西省科学院青年科技创新基金资助。
* 通讯作者:丁建南(1955 －) ，男，湖南衡东人，博士，研究员，从事应用微生物研究工作。
第 28 卷 第 4 期
2010 年 8 月
江 西 科 学
JIANGXI SCIENCE
Vol． 28 No． 4
Aug． 2010
文章编号:1001 － 3679(2010)04 － 0453 － 06
新疆天山雪莲根际冻土微生物
富集培养的初步研究
张国华1，2，罗会颖3，丁建南1，2
*
，姚 斌3
(1．江西省科学院生物资源研究所，江西 南昌 330029;2． 江西生态产业技术研究中心，江西 南昌 330029;
3．中国农业科学院饲料研究所，北京 100081)
摘要:利用纤维素、豆粕、魔芋粉、木聚糖等为底物对新疆天山雪莲根际冻土微生物进行了低温富集培养与分
离。通过 16S rDNA序列扩增初步鉴定了分离所得微生物，并构建系统发育树。结合选择性培养基进行了产
纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和 β-木聚糖酶等微生物的筛选。结果表明，新疆天山雪莲根际冻土
中蕴含着丰富的产酶微生物，其中以假单孢菌属、黄杆菌属、根瘤菌属和不动杆菌属等属的微生物为优势菌
群。分离得到的 41 株细菌中大部分都能产水解酶类。
关键词:雪莲;根际冻土;低温微生物;富集培养
中图分类号:Q938． 1;Q55 文献标识码:A
Pilot Studies on Microflora by Enrichment Culture in Frozen Soil
at the Root of Saussureae Involucratae Kar． et Kir．
et Maxim from Tianshan，Xinjiang Autonomous Region
ZHANG Guo-hua1，2，LUO Hui-ying3，DING Jian-nan1，2* ，YAO Bin3
(1． Institue of Biological Resources，Jiangxi Academy of Science，Jiangxi Nanchang 330029 PRC;
2． Jiangxi Ecological Industrial Technology Research Center，Jiangxi Nanchang 330029 PRC;
3． Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081 PRC)
Abstract:The microflora in the frozen soil at the root of Saussureae Involucratae Kar． et Kir． et Max-
im from Tianshan in Xinjiang Autonomous Region were isolated by enrichment culture using cellu-
lose，soybean，konjac powder and xylan as substrate，and identified by 16S rDNA sequences amplifi-
cation，the neighbor-joining phylogenetic tree was then constructed． The microflora producing all
kinds of enzymes including Cellulase，α-galactosidase，β-mannanase，β-xylanase ete，was screened by
selective mesa． The results showed that rich enzyme-producing microflora existed in the frozen soil，
while Pseudomonas，Flavobacterium，Rhizobium and Pedobacter are the advantage bacterium groups．
Among 41 bacteria strains isolated，most of them excreted hydrolysis enzyme．
Key words:Saussureae involucratae Kar． et Kir． et Maxim，Frozen soil near root，Cold-adapted mi-
croflora，Enrichment culture
DOI:10.13990/j.issn1001-3679.2010.04.026
0 引言
极端微生物是生长在极端自然环境中微生物
的总称，这些极端微生物界定了生物圈的边界，揭
示着生命的起源，也丰富了自然界的生物多样
性［1］。生物圈中超过 80%的地方温度低于 5 ℃，
因而在生态学上低温环境比高温环境的影响范围
更广。包括嗜冷菌和耐冷菌在内的低温微生物广
泛分布于自然界中［2］。在低温环境下，低温微生
物能够生存主要是由于其酶能在低温下有效地发
挥催化作用。研究低温微生物，对低温酶、特殊药
物等的开发具有重要的意义［3］。
本研究选择与饲料工业紧密相关的若干种
酶，分别选用纤维素、豆粕、魔芋粉、木聚糖等为底
物从新疆天山雪莲根际冻土定向富集培养产生纤
维素酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶、β-木聚糖
酶的微生物。研究雪莲根际冻土的微生物分布情
况，以期为这一独特环境来源的特殊微生物及功
能基因资源库的开发奠定基础［4］。
1 材料和方法
1． 1 实验材料及培养基
1． 1． 1 土样 采自新疆天山雪莲根际冻土，4 ℃
保存备用。
1． 1． 2 培养基 CMC液体培养基:硫酸锌 0． 003‰、
硫酸亚铁0． 01‰、硫酸铜0． 001‰、氯化钙0． 01‰、磷
酸氢二钾 0． 1%、氯化钾 0． 05%、硝酸钠 0． 05%、
硫酸镁 0． 05%、羧甲基纤维素 1%，pH 7． 5。用于
产纤维素酶菌株的富集培养。CMC 固体培养基
为 CMC液体培养基中加入 1． 5%琼脂。
DB液体培养基:硫酸锌 0． 003‰、硫酸亚铁
0． 01‰、硫酸铜 0． 001‰、氯化钙 0． 01‰、磷酸氢
二钾 0． 1%、氯化钾 0． 05%、硝酸钠 0． 05%、硫酸
镁 0． 05%、豆粕 3%，pH 7． 5。用于产 α-半乳糖苷
酶菌株的富集培养。DP 固体培养基为 DP 液体
培养基中加入 1． 5%琼脂。
MY液体培养基:硫酸锌 0． 003‰、硫酸亚铁
0． 01‰、硫酸铜 0． 001‰、氯化钙 0． 01‰、磷酸氢
二钾 0． 1%、氯化钾 0． 05%、硝酸钠 0． 05%、硫酸
镁 0． 05%、魔芋粉 0． 4%，pH 7． 5。用于产 β-甘露
聚糖酶菌株的富集培养。MY 固体培养基为 MY
液体培养基中加入 1． 5%琼脂。
MJ液体培养基:硫酸锌 0． 003‰、硫酸亚铁
0． 01‰、硫酸铜 0． 001‰、氯化钙 0． 01‰、磷酸氢
二钾 0． 1%、氯化钾 0． 05%、硝酸钠 0． 05%、硫酸
镁 0． 05%、木聚糖 1%，pH 7． 5。用于产木聚糖酶
菌株的富集培养。MJ 固体培养基为 MJ 液体培
养基中加入 1． 5%琼脂。
产酶筛选培养基平板包括:蛋白胨 1%、酵母
提取物 0． 5%、氯化钠 1%、琼脂粉 1． 5%，pH 7． 2。
各添加 1%可溶性纤维素、豆粕、魔芋粉、木聚糖
等，分别用于纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-甘露聚
糖酶及木聚糖酶的筛选［5 ～ 8］。
以上培养基均采用 121 ℃高压灭菌 20 min。
1． 2 菌液制备
无菌条件下，取 5 g土样材料(要尽量做到均
匀取样)置于 50 mL 无菌蒸馏水中，每隔 20 min
振荡 1 次，振荡数次充分摇匀后，静置 0． 5 h，取出
上清液，备用。
1． 3 微生物的富集培养及鉴定
按 10%接种量，分别在 50 mL CMC液体培养
基、DB液体培养基、MJ液体培养基和 MY液体培
养基中加入上清液，于 10 ℃摇床低温富集培养 6
～7 d。此时培养基浊度增加，颜色变深，取出富
集培养菌液，分别用无菌蒸馏水进行梯度稀释，分
别得到 10 －4、10 －5、10 －6和 10 －7倍数稀释液。各
梯度稀释菌液分别对应涂布在 CMC 培养基、DB
培养基、MJ 培养基和 MY 培养基固体平板上，10
℃培养 3 ～ 4 d。从培养基平板上挑取形态差异的
菌落(主要是通过观察菌落的大小、颜色、菌落表
面皱褶等形态) ，用相应的液体培养基振荡培养，
再通过稀释涂板、菌落划线等方法得到单一纯化
菌种［9，10］。
培养各纯化菌种，离心收集菌体，用细菌基因
组提取试剂盒(Tiangen Biotech Co． LTD．)提取细
菌基因组 DNA［11］。扩增各菌种 16S rDNA 基因
序列，对分离纯化的微生物进行初步鉴定。所用
PCR引物、反应体系及程序如下:根据 16S rDNA
保守序列设计合成引物:27f (5’-AGAGTTT-
GATCMTGGCTCAG-3’)和 1492r ( 5’-TACG-
GHTACCTTACGACTT-3’)。反应体系共 50 μL，
包括模板基因组 DNA 1． 0 μL，2 种引物各 1． 0
μL，10 倍反应缓冲液 5． 0 μL，2． 5 mmol /L dNTP
4． 0 μL，Taq DNA polymerase 0． 5 μL，ddH20 37． 5
μL。反应程序为:94 ℃ 30s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1． 5
min，30 个循环。
对获得的 PCR 产物进行序列分析，通过
BLAST程序对所获得序列进行比对，结合 Clust-
·454· 江 西 科 学 2010 年第 28 卷
alX1． 83 与 Tree-View1． 6． 6 软件构建新疆天山雪
莲根际冻土微生物的系统发育树［12，13］。
1． 4 分离微生物的产酶研究
将纯化保存的菌液点种于产酶筛选平板上，
10 ℃低温培养 3 ～ 4 d后，观察水解圈情况。产纤
维素酶、产 α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和 β-木
聚糖酶菌株的水解圈，需要将 0． 5%刚果红倒人
平板中染色 30 min，然后用 5%氯化钠浸泡脱色 1
h，出现透明圈者为阳性。
2 结果与分析
2． 1 微生物分离及鉴定
利用不同培养基，经过富集培养、梯度稀释平
板涂布、单斑分离等方法，共分离纯化得到 41 株
细菌(见表 1)。
表 1 新疆天山雪莲根际冻土富集分离微生物及产酶情况
菌株
编号
鉴定种属及
NCBI登录号
相似性
/%
纤维
素酶
半乳糖
苷酶
甘露
聚糖酶
木聚
糖酶
DB1 Pseudomonas sp．(FJ652605． 1) 97 － √ － √
DB2 Brevundimonas mediterranea(EF088675． 2) 99 － － － √
DB3 Pseudomonas sp．(FJ652605． 1) 98 － √ － √
DB4 Brevundimonas sp．(EF088675． 2) 99 － － － －
DB5 B． tyrofermentans(NR_026272． 1) 98 － √ － －
DB6 Kaistia granuli(EU723082． 1) 98 √ √ － －
DB7 Devosia sp．(AJ786801． 1) 99 － √ － √
DB8 Rhodococcus erythropolis(EF362636． 1) 98 － √ √ －
DB9 Pseudomonas collierea(EU680994． 1) 99 － √ － √
DB10 Sinorhizobium sp．(AY505135． 1) 97 √ √ － －
DB12 Enterobacter sp．(EU099377． 1) 92 √ √ √ √
DB13 Pseudomonas trivialis(DQ885949． 1) 99 － √ － √
DB14 Pseudomonas collierea(AM421016． 2) 99 － － － √
DB15 Arthrobacter sp．(FN377717． 1) 99 － √ √ －
DB16 Pedobacter steynii(AM491372． 1) 100 √ √ － √
DB17 Pseudomonas brenneri(EU169172． 1) 100 － √ － √
DB18 Variovorax sp．(FJ006917． 1) 99 － √ － √
DB19 Arthrobacter sulfurous(AB046358． 1) 99 － － － －
MJ1 Rhizobium sp．(AJ864848． 1) 99 √ √ － √
MJ2 Rhizobium sp．(AJ864848． 1) 99 √ √ － √
MJ3 Pseudomonas sp．(AF184219． 1) 99 － － － －
MJ4 Antarctic bacterium(AJ440983． 1) 99 √ － √ √
MJ5 Acidovorax sp．(AJ864847． 1) 99 － － － －
MJ7 Flavobacterium sp．(FJ889628． 1) 97 √ － － √
MJ8 Janthinobacterium lividum(AM748811． 1) 99 － － － －
MJ10 Variovorax sp．(AB196432． 1) 99 － － － －
Mj11 Flavobacterium sp．(DQ339585． 1) 99 √ √ － √
MJ13 Pedobacter nyackensis(EU030686． 1) 98 － － － √
MJ14 Flavobacterium sp．(AM177628． 1) 95 √ － － －
MY2 Flavobacterium frigidimaris(AB183888． 1) 99 √ － √ √
MY4 Pseudomonas mandelii(AY179326． 1) 99 － － √ √
MY5 Pseudomonas sp．(GQ477175． 1) 99 － － － －
MY8 Flavobacterium frigidimaris(AB183888． 1) 99 √ － √ √
MY9 Flavobacterium frigidimaris(AB183888． 1) 97 √ － √ －
MY10 Flavobacterium frigidimaris(AB183888． 1) 99 － － √ √
CMC1 Rhizobium sp．(AJ864848． 1) 99 √ － － √
CMC2 Flavobacterium sp．(DQ339585． 1) 100 √ － － √
CMC3 Oxalobacteraceae bacterium(EU057877． 1) 98 － － － －
CMC4 Pedobacter cryoconitis(NR_025534． 1) 98 √ － √ －
CMC5 Pseudomonas sp．(AF184219． 1) 99 √ － － －
CMC6 Pseudomonas mandelii(AY179326． 1) 99 √ － － √
注:“√”表示产酶;“－”表示未检测到产酶。
·554·第 4 期 张国华等:新疆天山雪莲根际冻土微生物富集培养的初步研究
提取 41 株细菌基因组 DNA，扩增其
16SrDNA序列，并用 BLAST与 NCBI数据库比较，
结果表明，这 41 株微生物分布在 17 个属中，其中
以假单孢菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Fla-
vobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、不动杆菌属
(Pedobacter)等属的微生物为主。分离得到 11 株
假单孢菌属细菌，占分离微生物总数的 26． 8%;8
株黄杆菌属细菌，占分离微生物总数的 19． 5%;
同时分离得到 3 株根瘤菌属和 3 株不动杆菌属细
菌，分别占分离微生物总数的 7． 3%。值得关注
的是，从雪莲根际冻土中分离得到了 1 株南极细
菌属(Antarctic)细菌 MJ4，南极菌是目前研究较多
的嗜冷微生物，具有继续研究的价值。
系列相似性大于等于 99% 的菌株共有 28
株，其中 DB16、DB17 和 CMC2 等 3 株细菌的 16S
rDNA序列与 GenBank库中数据序列相似性最高
为 100%。7 株细菌 16S rDNA序列与数据库序列
表现了 98%的相似性。DB1、DB10、DB12、MJ7、
MJ14、MY9 等 6 株细菌 16S rDNA 序列与 Gen-
Bank库中数据序列相似性低于 97%，为潜在的新
种，具有深入研究的价值。
构建的分离微生物的系统进化树表明(见图
1) ，假单孢菌属、黄杆菌属和不动杆菌属分居在
系统发育树的两端，显示出与其他分离微生物较
远的遗传距离。黄杆菌属支和不动杆菌属支上各
微生物之间的距离较远，表明分离的黄杆菌属和
不动杆菌属细菌之间的遗传关系较远。假单孢菌
属支上各微生物之间的距离较近，表明分离的假
单孢菌属细菌之间的遗传关系较近。
图 1 新疆天山雪莲根际冻土富集分离微生物系统发育树
·654· 江 西 科 学 2010 年第 28 卷
2． 2 微生物产酶分析
分离得到的 41 株细菌中，大部分都能产生水
解酶类。诱导产生纤维素酶的有 18 株细菌，诱导
产生 α-半乳糖苷酶的有 17 株细菌、诱导产 β-甘
露聚糖酶的有 10 株细菌，诱导产 β-木聚糖酶的
有 24 株细菌。其中 DB12 能诱导产生上面 4 种
水解酶，7 株细菌能诱导产生 3 种水解酶，19 株细
菌能诱导产生 2 种水解酶，6 株细菌能诱导产生 1
种水解酶，8 株细菌不能诱导产生上面 4 种水解
酶类，这可能与产酶诱导条件的不合适及菌群生
长环境的改变有关。
3 讨论
目前，极端微生物已成为国际研究的热门领
域，日本、美国、欧洲等国都已经启动了极端微生
物的研究计划。主要研究工作包括: (1)新物种
的发现;(2)新产物的研究与生产; (3)极端酶的
结构与功能分析;(4)极端酶基因的克隆与表达;
(5)极端酶适应机理的分子基础及遗传原理;(6)
基因组分析等［1］。
本研究通过富集培养方法从新疆天山雪莲根
际冻土中分离得到 17 属 41 株微生物，表明新疆
天山雪莲根际冻土中微生物的丰富多样性。其中
以假单孢菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Fla-
vobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、不动杆菌属
(Pedobacter)等属的微生物为优势菌群。分离微
生物 16S rDNA序列与 GenBank 库中数据序列比
较结果显示，新疆天山雪莲根际冻土中存在着许
多新颖的微生物有待人们去开发利用［14，15］。
根据生长温度特性低温微生物可分为两类，
一类是必须生活在低温下且其最高生长温度不超
过 20 ℃，最适温度在 15 ℃，在 0 ℃或以下可生长
繁殖的微生物嗜冷菌。另一类其最高生长温度高
于 20 ℃，最适温度高于 15 ℃，在 0 ～ 5 ℃可生长
繁殖的微生物称为耐冷菌［16］。本研究分离得到
的微生物在 10 ℃培养，但是其生长温度范围很
宽，可以在 4 ～ 20 ℃生长，大部分为耐冷菌，但是
也分离得到嗜冷菌，如 MJ4 属于南极细菌属(Ant-
arctic) ，其可以在 0 ℃生长，可能为嗜冷菌，有待
进一步研究鉴定。
在低温环境下，低温微生物能够生存主要是
由于其酶能在低温下有效地发挥催化作用。研究
低温微生物，对低温酶、特殊药物等的开发就有重
要的意义。本研究选择与饲料工业紧密相关的若
干酶，分别选用纤维素、豆粕、魔芋粉、木聚糖为底
物定向富集培养产生纤维素酶、α-半乳糖苷酶、β-
甘露聚糖酶、β-木聚糖酶的微生物。试验结果表
明，在低温条件下从新疆天山雪莲根际冻土中分
离的微生物大多都能诱导产生水解酶类，说明新
疆天山雪莲根际冻土微生物产酶基因的多样
性［17］。
参考文献:
［1］ 何康生，眭光华．极端微生物的研究及其应用［J］．
广东化学，2009，7(36) :109 － 111．
［2］ Takami H，Kobata K，Nagahama T，et al． Biodiversity in
deep-sea sites located near the south part of Japan［J］．
Ex － tremophiles，1999，3(2) :97 － 102．
［3］ Niehaus F，Bertoldo C． Extremophiles as a source of
novel enzymes for industrial application［J］． Appl Mi-
crobiol Biotechnol，1999，51:711 － 729．
［4］ Smalas A O，Leiros H K，Os V，et al． Cold adapted en-
zymes，Biotechnol［J］． Annu． Rev．，2000，6:1 － 57．
［5］ 张淑红，刘秀花，梁 峰，等．低温纤维素降解菌的
筛选及其酶学性质初步研究［J］． 微生物学杂志，
2009，29(3) :97 － 100．
［6］ 密士军，柏映国，孟 昆，等．一种来源于青霉的新
的 α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质［J］．微
生物学报，2007，47(1) :156 － 160．
［7］ 刘世利，汪天虹，秦 楠，等．产适冷木聚糖酶的海
洋产青霉的筛选和诱变［J］． 菌物系统，2003，22
(2) :272 － 276．
［8］ 陈一平，龙健儿，廖连华，等． β-甘露聚糖酶产生菌
的筛选和发酵条件的初步研究［J］． 天然产物研究
与开发，1997，10(3) :24 － 28．
［9］ Akila G，Chandra T S． A novel cold-tolerant clostridium
strain PXYL1 isolated from a psychrophilic cattle ma-
nure digester that secretes thermolabile xylanase and
cellulose［J］． FEMS Microbiol Lett，2003，2199(1) :63
－ 67．
［10］刘 军，张帅帅，杨 娜，等．北极海泥菌群的分离
鉴定及生物学特性的初步研究［J］．生物技术通报，
2010，(1) :136 － 141．
［11］ Lee Y K，Kim H W，Liu C L，et al． A simple method
for DNA extraction from marine bacteria that produce
extra-cellular［J］． Microbiol． Methods，2003，52(2) :
245 － 250．
［12］ Petri R，Imhoff J F． Genetic analysis of sea-ice bacteri-
al communities of the Western Baltic Sea using an im-
proved double gradient method［J］． Polar Biol．，2001，
24(4) :252 － 257． (下转第 460 页)
·754·第 4 期 张国华等:新疆天山雪莲根际冻土微生物富集培养的初步研究
(1980)指出的“长期保存有效种群大小应为 500
只”的标准还有不小差距。因此需要加大对桃红
岭梅花鹿种群的保护力度。针对以上问题，认为
应重点做好以下几个方面工作。
(1)应及早实施梅花鹿的生境改良工程，优
化梅花鹿适宜栖息地，以释放梅花鹿的种群增长
空间。
(2)大力发展社区经济，引导农民改变传统
的“靠山吃山”陋习;同时加强宣传教育，努力营
造人与动物和谐发展的社会环境，并加大对非法
贩卖野生动物的执法和打击力度，通过综合治理，
减少人为活动的干扰。
(3)在科学研究的基础上，可以申请捕获适
量的野猪。因为成群野猪一方面对梅花鹿的食物
资源造成威胁;另一方面也对农民的庄稼破坏严
重，容易因此挫伤当地村民保护野生动物的积极
性和激化社区矛盾。
(4)与相关科研院校合作，大力培训保护区
职工的野外工作实践技能，以提高梅花鹿的种群
动态监测水平。
(5)在桃红岭梅花鹿种群达到一定数量时，
考虑选择生境类似地区，实行迁地保护，以减少该
物种濒临灭绝的风险。
参考文献:
［1］ 蔡炳城，梦 梦．桃红岭的野生梅花鹿［J］．大自然，
2009，(3) :64 － 65．
［2］ 江西省桃红岭梅花鹿保护区．江西桃红岭梅花鹿保
护区［M］．中国林业出版社，2000．
［3］ 唐继荣，徐宏发，徐正强．鹿类动物数量调查方法探
讨［M］．兽类学报，2001，21(3) :221 － 230．
［4］ 徐宏发，顾长明． 华南梅花鹿的分布和现状［J］． 生
物多样性，1998，6(2) :87 － 91．
［5］ Franklin I． Evolutionary change in small populations
［C］． In Conservation biology:an Evolutionary-ecologi-
cal Appoach (Soule M and Wilcox B． ed) ，1980，105
檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
－ 150．
(上接第 457 页)
［13］ Junge K，Krembs C，Deming J，et al． A microscopic ap-
proach to investigate bacteria under in situ conditions
in sea － ice samples［J］． Annl． Glaciol．，2001，33:
304 － 310．
［14］ Bowman J P，McCammon S A，Brown M V，et al． Di-
versity and association of psychrophilic bacteria in
Antarctic sea ice［J］． Applied Environment Microbiol-
ogy，1997，63(8) :3068 － 3078．
［15］ Bowman J P，Brown M V，Nichols D S． Biodiversity
and ecophysiology of bacteria associated with Antarc-
tic sea ice［J］． Antarctic Science，1997，9(2) :134 －
142．
［16］ 曾胤新，俞 勇，蔡明宏．低温微生物及其酶类的
研究概况［J］． 徽生物学杂志，2004，24(5) :83 －
88．
［17］ 李子东，戴立华，孟 双，等． 极端微生物:一种新
型的酶资源［J］．微生物学杂志，2004，24(5) :89 －
91．
·064· 江 西 科 学 2010 年第 28 卷