全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 && 月
生"物"加"工"过"程
*cF/3! 8F3#
8FM3$%&%
DFC"&%37#7 ,^3C11L3$ ?#6!3$%&%3%#3%&%
收稿日期"$%&% ?%# ?%7
基金项目"国家自然科学基金资助项目 $%$6%%%&福建省自然科学基金重点资助项目 $ +`O$%%%&%&福建省自然科学基金资助项目
$*%0&%%%7%&福建省科技平台建设计划项目$$%%#S%%!(%
作者简介"司圣乾$&7!(%#男#河南夏邑人#硕士研究生#研究方向"微生物生化与分子生物学&林"琳$联系人%#教授# Z-J@C/":HL:Fr%%eK@-
;)-(2&8&0,)19=XE D 低温脂肪酶的纯化及酶学特性
司圣乾#陈"彦#刘燕雅#冯蔚宗#林"琳
$福建师范大学 生命科学学院#福州 (%&%!%
摘"要"1-,/%()(2#-12345 & 是从低温环境下分离的低温脂肪酶产生菌#对该菌产生的胞外脂肪酶$=N &%进行
纯化#并对其酶学特性进行初步研究( 1-,/%()(2#-12345 & 的发酵上清液经 #%f$8S
0
%
$
]+
0
沉淀)&$ i&0 %%% 截
留相对分子质量$Q[*+%透析袋透析)]H2<@DHbV 6( 分子筛和超滤浓缩后#得到了电泳纯的 =N &( ]\]-=.VZ
电泳估算其表观相对分子质量为 0g0 p&%0( 对其酶学特性研究表明"=N & 是低温碱性脂肪酶且对有机溶剂的耐
受性较好( &% i0% j内有较好的催化活性#最适作用温度为 &! j&% i(% j该酶的稳定性较好#当温度超过 (% j
时则容易失活&最适作用 2S为 &%3$#且 2S在 7 i&& 时较稳定&该酶对有机溶剂的耐受性较好#&% JJF/,N的*@$k)
)
k
)8@
k和YHk对=N & 的酶活力有促进作用#其中*@$k促进作用最大#提高了 &0#3%6f#而 &% JJF/,N的*G$ k)
*F
$k
)QL
$ k
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$k
)RL
$ k
) @`
$ k和 ./k对酶活力具有不同程度的抑制作用#其中 ./k抑制作用最强#抑制了
7!g((f&=N & 对*链长度小于或等于 &$ 的短链脂肪酸形成的甘油三酯具有较强的水解能力&& JJF/,N的去氧
胆酸盐$DH1FbKA的 ]\]和5_HHL-!%)& JJF/,N的Z\5.和尿素对酶活都有抑制作用#其中Z\5.的抑制作用最大#抑制了 !%f(
关键词"1-,/%()(2#-123&低温脂肪酶&纯化&酶学特性
中图分类号"9!&03&""""文献标志码".""""文章编号"$ ?#6!$$%&%%%# ?%%($ ?%(
S34.7.:5F.2/5/G:-545:F04.1F.:127:26GH5:F.A06.951010:40F0G
JK ;)-(2&8&0,)19=XEHD
]O]$*F/HXHFINCIH]ACHLAH1#YG C^@L 8FEJ@/TLCMHE1CBK#YG;*J1F45:F"1-,/%()(2#-12345-& IFE1HAEHBCLXAF/D-@ABCMH/C2@1H_@11H2@E@BHD CL @/F_BHJ2HE@BGEHHLMC-
EFLJHLB35IEFJAG/BGEH1G2HEL@B@LBBFXH/H/HABEF2]H2<@DHbV-6( XH/IC/BE@BCFL#AF/GJL A=N-& DHBHEJCLHD :K]\]-=.VZ_@10g0 p&%
0
3=N-& _@1@AF/D-@ABCMH@/a@/CLH/C2@1H_CB< @LD 1B@:/HGLDHEBBHJ2HE@BGEH@LD 2S_HEH&! j@LD &%3$#EH12HABCMH/K35JJF/,NFI*@
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&$% I@BK@ACD X/KAHECDH13& JJF/,NFIDH1FbKA@LD %g%&f FI5ECBFL P-&%% AFG/D HL<@LAHB5_HHL-!% @LD & JJF/,NFIZ\5.# GEH@AFG/D CLBM0K N24G1"1-,/%()(2#-123&AF/D-@ABCMH/C2@1H&2GECICA@BCFL&A<@E@ABHEC;@ICFL
""脂肪酶被广泛应用在食品加工)新型生物材料
合成)精细化工等诸多领域( 许多微生物$如细菌)
真菌等%能产生胞外脂肪酶#因此纯化方便#且由于
微生物繁殖快)易于培养#已成为工业脂肪酶的主
要来源*& ?$+ (
""在不同领域中需要不同性质的脂肪酶#因此需
要寻找各种特性的脂肪酶来满足生产的需要( 低
温脂肪酶不但在低温具有高催化活性#而且耐有机
溶剂)对热敏感#已引起各国科学家的广泛关注#对
低温脂肪酶的研究成为近几年来酶学领域的一个
研究热点* ?(+ (
""笔者对福建师范大学生命科学学院微生物生
化与分子生物学实验室保藏的 1-,/%()(2#-123
45 &菌种产生的脂肪酶$=N &%进行纯化#并对其
酶学性质进行初步研究(
D?材料与方法
D=D?材料
&3&3&"菌种
假单胞杆菌 1-,/%()(2#-12345 &#笔者所在
实验室保藏菌种(
&3&3$"试剂与药品
5EC1# O`+ .`]O*O8*公司& ]H2<@DHbV 6(#
=<@EJ@AC@公司&0-LCBEF2其他所有药品均为国产分析纯(
&3&3"仪器
8$%%% 色谱数据工作站#浙江大学智能信息工
程研究所&S\ $& !! 紫外检测仪) 5`
&
&%%恒流
泵#上海琪特分析仪器有限公司&U* $实验层析冷
柜#北京博医康实验器材有限公司&超滤装置$超滤
杯及超滤管 %# .JCAFL 公司& 蛋白质电泳仪#
O`+-4.\公司&=` &% 2S计$精度 o%g%%(%#赛多
利斯股份公司& 熔点棒式水银温度计 $精度
o%g& j%#常州市瑞明仪器厂(
&3&30"培养基
扩大培养基$& N%"酵母膏 ( X#蛋白胨&% X#橄
榄油 & JN#)
$
S=+
0
$ X#QX]+
0
%g( X(
""基本产酶培养基$& N%"蔗糖 ( X#蛋白胨 &% X#
橄榄油 & JN#)
$
S=+
0
$ X#QX]+
0
%g( X(
D=B?方法
&3$3&"脂肪酶的纯化
取 &g( JN扩大培养菌液接于装有 (% JN基本
产酶培养基的 $(% JN三角瓶中#$% j)$% E,JCL
摇床培养 $0 <后#&% %%% E,JCL)0 j离心&% JCL#取
上清液( 上清液用 #%f的$8S
0
%
$
]+
0
沉淀 ! < 后#
沉淀用 $% JJF/,N5EC1-S*/缓冲液$2S!g%%溶解并
用 &$ i&0 %%% 截留相对分子质量$Q[*+%透析袋
透析 &$ < 后获得粗酶液( 粗酶液过 ]H2<@DHbV
6( 分子筛# 平衡缓冲液和洗脱缓冲液均为
$% JJF/,N5EC1-S*/$含有 &%% JJF/,N8@*/# 2S
!g%%#流速为 %g# JN,JCL( 分管收集各峰组分#超
滤浓缩后点三丁酸甘油酯检验板#并对有酶活的组
分进行 ]\]-=.VZ电泳鉴定其纯度(
&3$3$"脂肪酶酶活力的测定
脂肪酶酶活力的测定采用平板透明圈法*#+和
分光光度计法*6+ (
&3$3"蛋白质浓度和脂肪酶表观相对分子质量的
测定
蛋白质浓度的测定采用 E`@DIFED 检测法#脂肪
酶表观相对分子质量的测定采用 ]\]-=.VZ法*!+ (
B?结果与讨论
B=D?ST D 的纯化与表观相对分子质量的测定
"" 1-,/%()(2#-12345 & 的发酵上清液经
$8S
0
%
$
]+
0
沉淀和透析后获得粗酶液#经过 ]H2<@-
DHbV 6( 分子筛层析分离出现 $ 个峰 $图 &%#收
集这 $ 个峰的洗脱液超滤浓缩后分别点三丁酸甘油
酯检验板#$% j放置 &$ <#峰 & 的收集液能使三丁
酸甘油酯检验板形成透明圈#具有脂肪酶活性(
]\]-=.VZ电泳结果见图 $( 由图 $ 可知"经超滤浓
缩的粗酶液显示有 $ 个条带#]H2<@DHbV 6( 分子
筛层析峰 & 为单一条带#表观相对分子质量约为
("第 # 期 司圣乾等"1-,/%()(2#-12345 & 低温脂肪酶的纯化及酶学特性
0g0 p&%
0
(
B=B?ST D 的最适作用温度和温度稳定性
""在 %)&%)&0)&#)&!)$%)$$)$0)%)0%)(%)#% 和
6% j下用分光光度计法分别测 =N & 的酶活#以
$% j时的酶活为 &%%f#计算各温度下的相对酶活(
""分别在 %)&%)$%)%)0%)(%)#%)6%)!% 和 7% j
水浴处理=N & & < 后#用分光光度计法测定各组
的酶活#以 % j处理的酶活为 &%%f#计算各组的相
对酶活#结果如图 所示(
图 D?ST D 纯化的!09-5G0V % ]R 层析图
Q.;=D?S34.7.:5F.2/JK !09-5G0V %H]R
Q标准蛋白&&粗酶液&$纯化后的酶液
图 B?ST D 的![!HS*%#电泳
Q.;=B?![!HS*%#060:F429-240F.:27STHD
""由图 可知"&% i% j时该酶的相对酶活在
!%f以上#最适作用温度为 &! j( 该低温脂肪酶在
中低温下很稳定#$%)% 和 0% j处理 & < 后的相对
酶活分别为 7g%7f)!(g$%f和 6!g&0f#在 (% j
时处理 & <后相对酶活仍在 #%f以上( 该酶具有耐
高温的特性#!% j处理 & < 后仍保留 !g&6f的残
余酶活( 这种特征与蛋白结构特征相关#低温脂肪
酶由于酶蛋白结构部分或全部柔性增加#降低了反
图 O?ST D 的最适作用温度和温度稳定性
Q.;=O?+9F.I3IF0I9045F3405/GF0I9045F340
1F5J.6.FK 27STHD
应活化能#同时更有利于底物与酶活中心的相互靠
近#从而增加了底物有效浓度#使其在低温下具有
较高的酶活力*7+ (
B=O?ST D 的最适作用9"和9"稳定性
""配制一定 2S的体积分数 &f三丁酸甘油酯检
验板#打孔后加入 !
#
N酶液#$% j放置 &$ <后测量
各检验板水解圈大小(
""酶液按体积比 &l&与不同 2S的缓冲液分别混
合# 0 j下放 7# <后#分光光度计法测各组的酶活(
""结果显示"2S为 &%g$ 时透明圈最大#2S7g% i
&&g% 时透明圈也较大#说明 =N & 是碱性脂肪酶(
以 2S&%g$ 的酶活为 &%%f#计算各 2S下的相对酶
活并作图$图 0%(
图 P?ST D 的最适作用9"及9"稳定性
Q.;=P?+9F.I3I9"5/G9"1F5J.6.FK 27STHD
""由图 0 可知"=N & 在碱性条件下较稳定#2S
值在 7g% i&&g% 之间时#相对酶活在 !%f以上( 2S
适应范围广和在碱性条件下的较高催化活性表明
其在洗涤剂添加剂应用方面具有很大的潜力(
B=P?ST D 的有机溶剂耐受性
""酶液与有机溶剂 l&混合后#0 j放置 $0 <#分
光光度法测定各组的酶活#以酶液与重蒸水混合的
0( 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
处理组为对照#结果如图 ( 所示(
图 R?ST D 的有机溶剂耐受性
Q.;=R?+4;5/.:126A0/FF26045/:027STHD
""由图 ( 可知"经正己烷和三氯甲烷处理后的酶
液的相对酶活分别为 &(0g&&f和 &%0g$$f&经甲
醇)乙醇)异丙醇)甘油处理后的相对酶活分别为
!&g&%f)66g!0f)#6g7%f和 !&g6#f#说明 =N &
对有机溶剂的耐受性较好( 有机溶剂对脂肪酶的
影响是一个非常复杂的过程#现在还没有很好的理
论来解释这一机制( 近年来#脂肪酶在生物能源领
域和生物制药工业的重要地位#使人们对有机溶剂
耐受的低温脂肪酶的研究尤为重视#这种特性的脂
肪酶产生菌株已被不断地筛选出并且基因也被克
隆表达出来*&% ?&&+ (
B=R?表面活性剂和变性剂对ST D 酶活性的影响
""表面活性剂和变性剂溶液分别跟酶液按一定
的比例混合 $ ]\])5ECBFL P-&%% 的终质量分数为
%g%&f#5_HHL-!% 的终体积分数为 %g%&f#Z\5.)
去氧胆酸盐 $ DH1FbKA& JJF/,N%#0 j放置 & <后分光光度计法测各组的
酶活$此过程中保证反应体系中的表面活性剂和变
性剂的浓度与前期处理时的浓度保持一致%#以未
处理的酶液作对照#结果如图 # 所示(
""由图 # 可知" & JJF/,N的 DH1FbKA%g%&f的 5ECBFL P-&%% 对酶活具有提高作用#分别
提高了 %g60f和 &&g!f&%g%&f的 ]\]和5_HHL-
!%)& JJF/,N的 Z\5.和尿素对酶活都有抑制作
用#其中Z\5.的抑制作用最大#抑制了 !%f(
B=@?金属离子对ST D 酶活性的影响
""将酶液)&%% JJF/,N的各金属离子溶液和 $%
JJF/,N5EC1-S*/缓冲液$2S!g%%按 &l&l!的比例
混合#0 j放置 & < 后分光光度计法测各组的酶活
$此过程中保证反应体系中的金属离子浓度与前期
图 @?表面活性剂和变性剂对ST D 酶活性的影响
Q.;=@?#70:F127G0F04;0/F15/G5:F.A05;0/F1
2/STHD 5:F.A.FK
处理时的浓度保持一致%#以没加金属离子的稀释
同样倍数的酶液作对照#结果如图 6 所示(
图 ]?金属离子对ST D 酶活性的影响
Q.;=]?#70:F127.2/12/STHD 5:F.A.FK
""由图 6 可知" &% JJF/,N*@$k对 =N & 的酶活
力有较大提高#提高了 &0#g%6f#主要由于 *@$k的
配位作用( 低温脂肪酶氨基酸序列的 *端有
VPPVP\重复序列形成的环# $ 个环结合 & 个
*@
$k
#6 i! 个环形成 & 个
%
滚环结构( 这种结构
使底物与酶的活性部位更容易结合#从而提高了酶
活力*&$ ?&+ ( )k)8@k和 YHk使酶活性分别提高了
$0g$&f)&!g0f和 &%g%f&而*G$ k) *F$k)QL$ k)
QX
$k
)RL
$ k
) @`
$ k和 ./k对酶活性具有不同程度的
抑制作用#其中./k)*G$ k和RL$ k的抑制作用较强#
分别抑制了 7!g((f)7#g&$f和 70g7f(
B=]?ST D 的天然底物特异性
""分别以三丁酸甘油酯 $*0%)三辛酸甘油酯
$*!%)三月桂酸甘油酯 $*&$ %)三油酸甘油酯
$*&!%)橄榄油和大豆油为底物#配制 &f的检验板(
分别点上 &%
#
N纯化后的=N &#$% j放置 &$ <#测
量水解圈的大小( 结果如表 & 所示(
""表 & 表明=N & 对 *链长度小于或等于 &$ 的
(("第 # 期 司圣乾等"1-,/%()(2#-12345 & 低温脂肪酶的纯化及酶学特性
"""
表 D?ST D 的底物特异性
E5J60D?!3J1F45F0190:.7.:.FK 27STHD
天然底物 水解圈情况 水解圈直径,JJ
三丁酸甘油酯 清晰 &&g$
三辛酸甘油酯 清晰 &%g0
三月桂酸甘油酯 清晰 #g7
三油酸甘油酯 较清晰 #g$
橄榄油 模糊 (g
大豆油 模糊 (g$
短链脂肪酸形成的甘油三酯具有较强的水解能力#
而对长链脂肪酸形成的甘油三酯的水解能力相对
较弱( 利用这一特性可以在低温下催化奶制品中
的油脂释放出 * i*&% 的有特殊香味的短链脂肪
酸#这样不仅有增香的作用#还可以避免奶制品在
长时间高温加工时对质量和风味的影响*(+ (
O?结?论
""发酵液经过 #%f$8S
0
%
$
]+
0
沉淀)透析)]H2<@-
DHbV 6( 分子筛凝胶过滤可以得到电泳纯的
=N &#其表观相对分子质量为 0g0 p&%0(
对其酶学特性研究表明"=N & 是低温碱性脂
肪酶#&% i0% j内有较好的催化活性#最适作用温
度在 &! j&% i(% j该酶的稳定性较好#当温度超
过 (% j时则容易失活&最适作用 2S为 &%g$#且 2S
在 7 i&& 时较稳定&该酶对有机溶剂的耐受性较好#
&% JJF/,N的*@$k))k)8@k和YHk对=N & 的酶活
力有促进作用#其中 *@$k促进作用最大#提高了
&0#g%6f# 而 &% JJF/,N的 *G$ k) *F$k) QL$ k)
QX
$k
)RL
$ k
) @`
$ k和 ./k对酶活力具有不同程度的
抑制作用# 其中 ./k抑制作用最强# 抑制了
7!g((f( =N & 对*链长度小于或等于 &$ 的短链
脂肪酸形成的甘油三酯具有较强的水解能力(
& JJF/,N的去氧胆酸盐和 %g%&f的 5ECBFL P &%%
对酶活力具有提高作用#分别提高了 %g60f和
&&g!f&%g%&f的 ]\] 和 5_HHL-!%)& JJF/,N的
Z\5.和尿素对酶活都有抑制作用#其中 Z\5.的
抑制作用最大#抑制了 !%f(
参考文献"
*&+"W@HXHE)Z#4HHB;Q53QCAEF:C@//C2@1H1IFEJMHE1@BC/HBFF/1IFE
:CFBHA*$+"张树政3酶制剂工业*Q+3北京"科学出版社#&7!03
*+"Q@EXH1CL 4# ]A_@1BH_@BHEAFLB@JCL@BHD _CB< @LCFLCA1GEI@AB@LB1@LD IGH/FC/*W+3
.22/QCAEF:CF/`CFBHA*0+"岳贤田#高桂枝3低温微生物脂肪酶的研究进展*W+3中国油
脂#$%%!#$6%"00-0!3
UGHPC@LBC@L#V@FVGC;/C2@1HIEFJJCAEFFEX@LC1J*W+3*00-0!3
*(+"陈贵元#魏云林3低温脂肪酶的研究现状与应用前景*W+3生物
技术通报#$%%#$$%"$7-$3
*2EF12HABFIAF/D-@D@2BHD /C2@1H1*W+3`CFBHA$$%"$7-$3
*#+"郑毅#叶海梅#周羉#等3脂肪酶活力测定研究进展*W+3工业微
生物#$%%(#($0%"#-0%3
RDHBHEJCL@BCFL*W+3OLDG1BEC@/QCAEF:CF/FXK#$%%(#($0%"#-0%3
*6+"cFEDHE_C/:HAaH5#)CH1/CA< )#ZEDJ@LLBS3*FJ2@EC1FL FI/C2@1H1
:KDCIHEHLB@11@K1*W+3ZL;KJHQCAEF: 5HA#&-#73
*!+"汪家政#范明3蛋白质技术手册*Q+3北京"科学出版社#$%%%3
*7+"\HJCLXW[3=1KACFL CL QCAEF:CF/FXK#$%%$#($%"%&-%73
*&%+ +XCLFS#8@a@X@_@]#]C;@BCFL FIFEX@LCA1F/MHLB-1B@:/H/C2@1HIEFJFEX@LCA1F/MHLB-BF/HE@LB
1-,/%()(2#-#,&/02(-# N]5-% *W+3WFGEL@/FI` CF-1ACHLAH@LD
C`FHLXCLHHECLX#$%%%#!7$(%"0(&-0(63
*&&+ +XCLFS#8@a@X@_@]#]A<@E@ABHEC;@BCFL FI@/C2@1HXHLH$/C2% IEFJ1-,/%()(2#-#,&/0<
2(-# N]5-% *W+3QF/HAG/@EVHLHBCA1@LD VHLFJCA1#$%%0#$6&
$$%"&!7-&7#3
*&$+ 4@121KAZLMCEFLJHLB@/QCAEF:CF/FXK#$%%&##6$7%"0%#0-0%#73
*&+ 舒正玉#杨江科#徐莉#等3微生物脂肪酶活性构象的形成及激
活过程中的影响因子*W+3生物技术通报#$%%6$$%"#&-##3
]2EFAH11FIBC`FBHA#( 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"