全 文 ： 技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
Ecotilling,一种检测基因多样性的新方法
刘芳 余四斌
(作物遗传改良国家重点实验室,华中农业大学,武汉 430070)
摘 要: 定向诱导基因组局部突变 ( T ILL ING: Ta rgeting Induced Local Lesions In Genomes)检测技术是将随机
化学诱变与 PCR方法结合, 对目的基因区域进行鉴定筛选的一种低投入、高通量的反向遗传学方法。 E co tilling
是利用该技术检测自然群体中存在的基因多样性的新方法。目前, T ILL ING及 E co tilling已被应用于多个物种的基
因多样性的研究。本文系统介绍了 T ILL ING及 Ecotilling的定义、技术流程与特点、应用概况、常用工具, 并展望了
该技术的应用前景。
关键词: T ILL ING E co tilling 突变 多态性
Ecotilling, A Technology to Identify Gene Polymorphisms
L iu Fang Yu Sibin
(NationalK ey Laboratory of C rop G enetic Imp rovem ent,
Huazhong Agriculture University, Wuhan 430070)
Abstrac:t T ILL ING, Targe ting Induced Loca l Lesions In Genom es, is a lowcost, h igh throughpu t reverse genetic
m ethod that comb ines chem ica l random m utagenesis w ith PCRbased screen ing o f gene reg ions o f interest. E co tilling is a
new techniquew hich can identify a ser ies o f alle lic var iation in natural popu la tion by using this m ethod. A t present, T ILL
ING and Ecotilling are be ing applied in research of gene va riation in m any o rganism s. Th is pape r g ives an ove rv iew of the
development, technica l procedure and characte ristics, ana lysis too ls and applica tion o f ( Eco) T ILL ING. Som e perspec tives
about its applica tion are d iscussed.
Key words: T ILL ING Ecotilling Muta tion Po lym orphism s
作者简介:刘芳 ( 1979) ,女,在读博士,研究方向:水稻磷高效基因功能研究
自然界存在着广泛的生物多样性。这种多样性
体现出物种、种群或个体间的形态、生理、环境适应
以及遗传等多方面的丰富变异。自然变异是生物适
应进化和人工选择的基础。随着基因组测序技术以
及基因组学的飞速发展, 研究基因的结构和功能差
异,了解自然变异产生的根本原因成为现实。目前,
几种模式生物如拟南芥、水稻等的基因组测序工作
已经完成。丰富的序列信息对鉴定基因的功能和特
征、了解自然变异存在的遗传基础、阐明物种进化或
驯化的机制和推动遗传育种的进步均具有十分重要
的作用。例如举世闻名的小麦 绿色革命 基因就
是株高的一个等位变异基因,矮秆基因与高秆基因
的差异仅在于编码区的一个碱基 [ 1] , 虽然该等位基
因只存在一个碱基的差异, 但发现或利用它却带来
了作物育种的一场 飞跃 ; 野生番茄与栽培番茄的
果实大小差异主要也是由一个等位基因 fw 2. 2引起
的,二者的差异在于启动子区 8个碱基中的一个或
几个碱基的变化 [ 2]。然而, 现有的大量基因组序列
只来源于模式生物的一个或少数个体, 目前,针对一
个或少数物种的个体基因组进行测序还十分昂贵,
而我们需要获得群体中更多个体的序列信息, 才能
充分发现自然发生的基因变异, 进而深入分析其功
能特征。因此,经济、快速地检测自然存在的基因多
态性的方法显得尤为重要。
基因多态性的检测在 20世纪 80年代主要用
RFLP( R estrict ion Fragmen t Length Polymorphism )方
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
法, 90年代用以 PCR为基础的 RFLP、STR ( Short
Tandem Repeat)、SSCP( single- stranded conforma tion
po lymorph ism ) ,以及以测序为基础的多种检测方
法,如 DNA芯片技术对单核苷酸多态性 ( SNP)的检
测等。最近,一种更为普遍适用的、相对经济、快速、
高通量的新检测手段Ecot illing应运而生。本文就
其发展、技术流程与特点、应用概况和分析工具作系
统介绍。
1 TILLING及 Ecotilling的定义
定向诱导基因组局部突变 ( T ILLING: Target ing
Induced Local Lesions In G enomes)检测技术是一种
低投入,高通量的反向遗传学方法。具体是,它将随
机化学诱变与 PCR方法结合起来对目的基因区域
的突变进行筛选 [ 3~ 5] , 利用特异切割单链的内切核
酸酶 sss(如芹菜核酸内切酶 CELⅠ及绿豆核酸内切
酶 MBN)来检测因诱导产生的 DNA变异,从而鉴定
一系列等位基因多样性。通过对比同一基因的结构
差异, 并结合其表型变化, T ILLING技术可为诱导产
生的突变提供直接的功能证据。
Coma i等 ( 2004)在对拟南芥基因进行 T ILLING
试验的过程中偶然发现, 由于突变群体中混有其他
生态类型而在对多个基因进行筛选时重复的在同一
泳道位置上检测到一个或多个条带 [ 6]。这一现象
表明 T ILLING除了可有效检测诱导产生的突变,它
同样可以检测自然存在的基因多态性。
鉴定自然发生的基因多态性在变异分类的本质
上等同于检测诱导所产生的突变,所以, 将 T ILLING
技术稍加改变,也可用于自然发生的变异鉴定及单
倍型分类。所谓单倍型 (H aplotype) ,是指一些染色
体特定区域内等位基因的特殊组合。H en iko ff和
Coma i( 2003)提出用 Ecot illing来指这种用于检测
自然群体中存在的 SNP的新方法 [ 7]。此方法最先
应用于拟南芥生态型的鉴定和单倍型作图。
经济快速地发现自然多态性及对基因型进行分
类可以提供基因功能的许多信息, 也有利于联合作
图以及连锁不平衡分析; 自然变异还可以阐明未能
从诱导突变中鉴定的基因的特征;同时,通过等位基
因的发掘可以研究等位变异在植物基因组中的分
布、地理分布以及研究基因的进化 [ 8]。
2 TILLING技术的产生
几种物种的全基因组测序计划已完成, 还有许
多物种的全基因组测序工作正在进行之中。随着大
规模测序数据的积累, 基因组研究的重点已从确定
基因结构转向研究基因功能, 于是研究者将目光转
向了各种各样的功能基因组的研究工具, 利用它们
来解译成百上千新基因的功能。基因组测序的迅速
发展推动了功能基因组学的发展,其中反向遗传学
是功能基因组学的一个重要组成部分。
在植物中,最常用的反向遗传学方法有后转录
基因沉默 ( posttranscriptional gene silencing, PTGS )
及插入突变等。PTGS耗费人力,得到的结果有时不
够明确,而且无法分离得到导致死亡及不育的突变
体;对于插入突变, 不仅耗时耗力,而且由于每个基
因组的突变频率过低, 所以对任一特定基因突变体
的鉴定需要筛选大量的突变群体,并且突变的等位
基因很可能会导致基因功能的完全丧失, 从而限制
具有决定性意义的基因的研究。
使用化学诱变剂进行诱变, 没有上述方法所具
有的缺点。乙基甲磺酸 ( E thy lmethane su lfonate,
EM S)是植物中最常用的诱变剂,可大量诱导基因组
中的隐性突变 [ 9 ] ,而且 EMS诱导的突变随机分布于
基因组,可得到较高程度的突变而不损伤 DNA。其
它的烷化试剂,例如乙基亚硝基尿 ( ethy ln itrosourea,
ENU )也被有效应用,诱导的点突变可以创造各种各
样的等位基因以供遗传分析。
经化学诱变后,由单碱基改变而造成蛋白编码
区改变的突变类型有三类: 第一类, 无义突变, 它是
由单碱基的改变导致氨基酸编码子变成了终止子;
第二类,错义突变, 即是单碱基的改变导致编码的氨
基酸的改变,这还可进一步分为保守替换及非保守
替换;第三类, 沉默突变, 即碱基改变没有引起所编
码的氨基酸的改变,这类突变经常发生在密码子的
第三个碱基上。EMS主要导致 C到 T的改变,从而
导致 C /G向 T /A的转换, 假设所有的改变均为 C /G
到 T /A的转换, 根据拟南芥密码子的使用频率, 可
计算得到: 大约 5% 的突变将导致无义突变, 大约
65%的突变将导致错义突变,大约 30%的突变将导
致沉默突变 [ 4]。
尽管 EMS诱变有很多优点,但人们未能将之作
为反向遗传学的主要工具, 主要因为缺乏高通量的
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2006年增刊 刘芳等: Eco tilling,一种检测基因多样性的新方法
技术来检测点突变。以前的一些检测 SNP的技术,
包括基于凝胶电泳的方法, 如单链构像多态性 ( SS
CP)及变性梯度凝胶电泳 ( DGGE )等,无法确定存在
于 DNA片段中的多态性的类型及对多态性位点进
行准确定位 [ 10 ] ;而依赖于变性动力学的检测技术,
可用定量 PCR的方式, 但只适合于小的 DNA片
段 [ 11] ;基于芯片杂交的方法可以发掘基因组之间的
多态性及类型,但将此方法应用于多个个体则太昂
贵,而且只有低于 50%的 SNP能被检测到 [ 12]。
而采用 T ILLING技术可以弥补上述方法的缺
陷,以前此技术是结合 EMS诱导突变以及变性高效
液相色谱 ( DHPLC )来检测野生型和突变型混合模
板的 PCR扩增产物中异源双链的错配处。但 DH
PLC的运行时间限制了此方法的高通量运用。 Co l
bert等 ( 2001)发现了一种更经济快速的 TILLING方
法 [ 3] ,它采用一种对错配碱基 (异源双链位点 )特异
性切割的芹菜核酸酶 CEL I来鉴定 SNP; T ill及其同
事 ( 2004)将这种核酸酶及其它的单链特异的核酸
酶进行了对比分析 [ 13] , 结果表明,只要每种酶的消
化条件适宜, CEL I的活性与 Asp erg illus S1核酸内
切酶或绿豆核酸酶 (MBN)相比没有太大差别, 而且
粗提物与纯化过的核酸酶对于检测 SNP同样有效。
这进一步降低了该技术的使用成本。
3 TILLING及 Ecotilling的流程
以拟南芥为例, T ILLING的主要流程如图 1所
示: EMS处理种子,诱导产生一系列点突变; 将种子
培养, 获得第一代突变个体 (M 1) ; M 1植株自花授
粉,产生第二代植株 (M 2) ; M 2植株抽提 DNA存放
于 96孔板, 并保留 M2代种子; 将 8个 96孔板的样
本合并到 1个 96孔板内 (最多可合并 8个 ); 设计
目标基因 (约 1 kb的区域 )的特异性引物并以两种
荧光染料分别标记 (左引物 5端标记 IRD700,右引
物 5端标记 IRD800) ;用标记的引物扩增混合模板;
将扩增产物加热变性再逐渐降温退火, 野生型和突
变型将形成异源双链核酸分子; 若混合模板中包含
有在目标扩增区域的碱基突变的 DNA, 则产物经
CEL I消化后, 会在双链核酸分子错配 (即异源 )处
切开; 经凝胶电泳,两种荧光染料可在不同远红外光
谱 ( IRD700和 IRD800)频道下检测出, 可得到两种
图象,含突变体的泳道, 理论上在 IRD700和 IRD800
频道中分别检测到一条带, 这两个条带就是 CEL I
核酸酶的酶切产物,两片段大小之和等于野生型扩
增片段的大小。突变位置很容易通过扩增产物的酶
切片段大小来估计 [ 14, 15] ; 当混合样本检测到突变
后,再对混合样本中的每个 DNA样本以同样方法复
筛,得到突变个体;对 PCR产物进行测序验证;最后
进行突变表型鉴定。
Eco tilling的流程如图 2所示, Ecotilling 与
T ILLING的主要差别在于, 将不同生态型个体或品
种 DNA分别与参照品系 DNA等量混合做为模板,
而不是用突变系的 DNA库为模板。其它与 T ILL
ING方法相同。利用该方法可以在大量不同品种间
检测到一定类型的单倍型。将代表每一种单倍型的
样本进行测序, 利用 SEQUENCHER软件对多个序
列进行比对,从而确定碱基的自然突变或改变。
Com ai等 ( 2004)研究结果表明, 所有酶切检测
到的信号均可通过测序证明是真实存在的多态
性 [ 6]。通过与已知序列的片段形成异源双链来检
测一个未知的纯合 DNA,能够揭示多态性位点的数
量和位置。核苷酸的改变 (所有类型的碱基错配 )
及小的插入缺失 ( 1~ 30bp)均可被检测到, 而且还
可以观察到微卫星重复数量的多态性。
4 T ILL ING及 Ecotilling的特点
4. 1 T ILLING的特点
T ILLING技术能快速且自动化检测大量的突变
基因,它相对于其它反向遗传学方法的优势在于:不
受基因组大小、物种繁殖系统或世代时间的限制,可
应用于任何可以化学诱变的物种, 尤其适用于植物,
因为它们可自交, 种子易于保存; T ILLING是一种高
通量的筛选技术, 一旦 DNA及引物准备好之后, 包
括 PCR反应, CEL I酶切及 LICOR分析仪电泳分
析,可以在 8h之内产生结果。LICOR凝胶分析系
统每块胶可上 96个样,每个样针对 1kb的区域进行
检测,每天可检测 2 000个样品, 而且检测较大片段
( 1. 6kb以内 )也是可行的, 这样在一次实验的基础
上增加检测区域可能会进一步降低实验费用。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
图 1 T ILL ING的主要流程
此图举例说明若有一单株在筛选区段产生 G→A的突变,则产生两种 PCR产物,经变性、退火后形成四种双链结合产物,
CEL I酶在错配处切开,其中紫色的交叉符号代表酶切识别位点,红色星号及绿色星号分别代表 IRD700和
IRD800的荧光标记,它们分别在两个不同频道被检测出
4. 2 Ecotilling的特点
Ecotilling可经济快速有效的检测大群体中自然
存在的基因多态性, 而且利用核酸内切酶如 CEL I
酶切的位点信息,可以很容易的鉴定基因多态性及
存在的单倍型,从而将群体中不同基因型作单倍型
分组,再选择代表不同单倍型的基因型测序。其优
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2006年增刊 刘芳等: Eco tilling,一种检测基因多样性的新方法
点是, 针对任意一个基因, 它能大大降低对大量个体
测序的数量,因为每种单倍型只需将一个或两个样
本拿来测序, 即可代表在特定位点上某类样品中
DNA的多态性。在许多情况下, E cotilling相对于全
部测序更具优势,对于鉴定纯合物种群体中的多态
性,单倍型的频率将决定这两种方法中哪种更有利:
如果相对于样本数有很大比例的单倍型数, 则适合
用测序的方法;如果单倍型数远远少于样本数,则适
合用 Eco tilling的方法 [ 6 ]。
而且 Ecotilling适用于任何物种的 DNA多态性
的鉴定,对于自交授粉的物种,例如拟南芥, 大部分
位点呈纯合状态。因为用于 T ILLING的内切酶只
在碱基错配处切开,所以不同被检品种的 DNA需与
标准 (参照 )基因型的 DNA混合; 而对于异花授粉
的物种, 如杨树, 呈高度杂合状态, Ecotilling不仅可
以用来检测基因变异的程度, 也用来检验基因内的
杂合水平。
图 2 Ecotilling的主要流程 ( Com ai et a.l , 2004)
5 TILLING及 Ecotilling的应用概况
5. 1 TILLING的应用概况
2001年, T ill及其同事 [ 16~ 18] 发起了拟南芥
TILLING研究项目计划 ( ATP )。ATP属于西雅图
TILLING项目 ( STP)之一,它是由华盛顿大学 Comai
实验室及西雅图 Fred Hutch inson癌症研究中心的
Hen ikoff实验室联合建立的, 通过筛选 EMS诱变的
拟南芥群体来获得点突变的等位基因突变系。同
时,他们建立了一套公用平台, 能帮助使用者在支付
一定费用的条件下索取到自己感兴趣基因的突变
体。通常,在对包括大约 3 000个拟南芥突变株系
的核心库进行筛选后,每个基因可找到约 10个突变
体;他们在使用者提交申请感兴趣基因的 6个月之
后,会投放公开所检测到的任何突变信息,并提供序
列及突变体的代号,而且由 ATP产生的所有的突变
体的种子均可由拟南芥生物资源中心免费提供。此
项目在第一年内已递交了关于 100多个基因的
1 000多个突变位点的数据, 迄今为止, 此项目已产
生 6 000多个 EMS诱导的突变体。
该计划项目除筛选拟南芥突变体的基因变异
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
外,最近已开始发展高通量的果蝇 (D rosophila mela
nogaster )TILLING 研究, 并启动了水稻 (O ryza Sa ti
va),大豆 ( G lycine max ), 番茄 ( Ly cop ersicon esculen
tum )的 T ILLING项目 (见表 1)。他们还与 Purdue
大学的 C liffW e il合作开展玉米 ( ma ize)的 T ILLING
研究。表 1还列出了国际上其它实验室针对不同生
物 如 果 蝇 [ 19]、斑 马 鱼 ( zebrafish ) [ 20, 21]、老 鼠
( rat)
[ 22]、百脉根 (L otus japon icus ) [ 23 ]、大麦和小麦
(Triticum aestivum 和 T. durum ) [ 24]等作物 [ 25]建立
T ILLING研究平台的情况。
Slade等 ( 2004)利用 TILLING技术筛选 1 920
个小麦异源六倍体及异源四倍体个体, 鉴定了 246
个蜡质等位基因,这些等位基因编码一系列从野生
的到无效的蜡质相关酶, 它们所代表的遗传变异比
以前 25年发现的变异还要多 [ 24]。这些结果表明
T ILLING技术可创造和鉴定遗传变异, 是作物改良
的重要工具。
表 1 T ILL ING及 E co tilling的应用概况
方法 物种 文献或网页
T ILING 拟南芥 ( Arab idops is) C om aiet a.l , 2004; T illet a.l , 2003, 2004;
H en ikoffet a.l , 2003, 2004
T ILING 果蝇 (Drosoph ila m elanogaster ) ht tp: / / till ing. fh crc. org: 9366 / f ly /
T ILING 水稻 (Oryza Sa tiva ) ht tp: / / till ing. fh crc. org: 9366 /
T ILING 大豆 (G lycine max ) ht tp: / / till ing. fh crc. org: 9366 /
T ILING 番茄 (L ycopersicon escu len tum ) ht tp: / / till ing. fh crc. org: 9366 /
T ILING 玉米 (m aize) ht tp: / / genom e. pu rdu e. edu /m aizet illing /
T ILING 果蝇 (Drosoph ila m elanogaster ) W ink leret a.l , 2005
T ILING 斑马鱼 ( zebraf ish ) D raperet a.l , 2004; W ienholdset a.l , 2003
T ILING 老鼠 ( rat) Sm its et a.l , 2004
T ILING 百脉根 (L otu s japonicus) Perryet a.l , 2003
T ILING 大麦 ( b arley) ht tp: / /b io in.f scr.i sar.i ac. uk /d is till ing/d istill ing. h tm l
T ILING 小麦 (Tri ticum ae stivum 和 T. du rum ) S lad e et a.l , 2005
T ILING 其他作物 S lad e and Knau,f 2005
T ILING 卷心菜 (B ra ssica oleracea ) G ilchrist et a.l ,未发表
E cot illing 拟南芥 (Arabidopsis) C om aiet a.l , 2004
E cot illing 无果杨 (P opu lu s trichoca rpa ) G ilchrist et a.l ,未发表
E cot illing 白菜 (B ra ssica rapa ) W uet a.l , 2005
5. 2 Eco tilling的应用概况
Coma i等 ( 2004)对 150个拟南芥品系的 5个目
标基因进行筛选,发现了 55个单倍型, 涉及到单核
苷酸多态性的序列差异及以代表复杂的单倍型的序
列差异,所检测到的多态性包括单个碱基对的改变,
小的插入和缺失,微卫星重复数量的多态性 [ 6]。
W u等 ( 2005)采用绿豆核酸酶 (M BN ) ,利用巢
式引物扩增目标基因, 并在基因特异引物 5端加
M13接头,同时将 M13引物分别标记不同荧光, 从
而降低试验成本,而且分别标记不同荧光的 M 13引
物可通用于不同基因的研究 [ 26]。通过对白菜
( Brassica rapa) ZIP同源基因的研究表明, 此方法对
于鉴定白菜自然群体中的基因多态性是可行的。
6 T ILL ING及 Ecotilling的常用工具
在美国国家科学基金会 ( NSF)生物基础设施部
门的赞助下, ATP研究人员已开发了基于网络软件
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2006年增刊 刘芳等: Eco tilling,一种检测基因多样性的新方法
来分析诱导或自然存在的基因多态性。CODDLE
( CodonsOpt im ized to DetectDe leteriousLesions)是一
种基于网络的免费分析工具 ( http: / /www. prow ed.
org / input) ,可用于设计 PCR特异引物, 以扩增所感
兴趣的功能域或可能会对氨基酸的替换非常敏感的
保守区域 [ 17] ; PARSESNA ( Project A ligned R elated
Sequences and E va luate SNPs)也是一种基于网络的
免费工具 ( http: / /www. prow eb. o rg /parsesnp / ), 可
预测突变对蛋白质编码造成的影响, 提供对限制性
酶切位点造成的改变以及其它有助于表型分析的信
息 [ 27]。另外, CODDLE, PARSESNP也适合于位点突
变或多态性检测的其它技术。
GelBuddy是一种帮助凝胶电泳图谱分析的软
件工具 [ 28]。它可利用以末端标记的引物扩增产生
的背景条带,根据标准分子量自动对各泳道进行识
别和校正。 GelBuddy会识别互补条带并产生一个
报告文件,并对自动输入的数据进行分析。该软件
尤其适用于 Ecotilling,因为 Eco tilling能检测出一系
列多态性条带,若依赖手工输入泳道及迁移率,则容
易出错。目前, ATP和其他 T ILL ING和 Eco tilling研
究工作已采用 Ge lBuddy用于凝胶图像的分析。
7 总结展望
基因组测序有利于我们了解变异, 但要获得群
体中大量个体的序列信息则费用昂贵。相对而言,
Ecotilling大大降低了对群体中大量不同个体的同一
基因测序的数量,因为每种单倍型只需将一个或两
个样本拿来测序即可说明在某一特定位点任一样品
中 DNA的多态性。所以,相对于其他发掘新基因的
技术手段,如 DNA芯片技术、差异显示技术等, Eco
t illing技术是一项低投入、高通量和高真实度的基
因检测技术。当然, 该技术随着广泛的应用和深入
研究, 还会得到不断地发展和改进。
Ecotilling的另一突出优点是可以检测大群体中
存在的自然发生的基因多态性, 而且利用核酸内切
酶酶切的位点信息, 可将群体中不同生态型按单倍
型进行分组。不同生态型中等位基因变异的模式有
助于目标基因的功能研究。 Comai等 ( 2004)在拟南
芥中已经检测到基因存在几种变异的模式 [ 6]。有
的基因在一些生态型中为无效等位基因, 这表明至
少在某种遗传背景下, 此基因在自然条件下可能是
非必需的;有的基因的变异大多限于内含子区域,表
明尽管自然界存在变异的单倍型,但大多数是不编
码变异蛋白的;有的基因存在高度变异的单倍型,如
编码一个未知功能的假设蛋白的 PIF2基因, 在
Lezoux0生态型中相对于参照生态型存在 31个序
列改变,这种不寻常的变异可能由于保留了一个古
代等位基因或由种间杂交导致外源染色体区域的渐
渗事件。
目前, T IILL ING及 Ecotilling检测基因变异通常
采用 LICOR4200和 4300系列平板胶分析仪。 LI
COR系统 ( L ICOR B iosciences)是基于 L iCor高灵
敏度双色红外荧光检测技术开发的产品, 它利用敏
感的 LICOR激光探测器来探测标记上的荧光激
团。由于杂质、干扰分子在红外区几乎不发光,用红
外荧光进行检测的背景非常低,而且灵敏度很高,可
检测到低达 15amo les的荧光分子; 加上双通道检
测,两个通道检测波长相距 110nm,相对于通常的可
见四色荧光检测系统来说, 几乎没有光谱重叠的干
扰;另外, 双通道检测能够有效排除假阳性点突变,
准确度很高。当然,毛细管检测系统因其高通量的
特点使其成为平板胶分析仪潜在的替代技术, 但目
前,毛细管检测,相对还是昂贵一些。期望在未来能
有更适用、省时及经济有效的毛细管检测系统。
T ILLING及 Ecotilling是反向遗传学中的重要
工具,可用于任何物种的诱变或自然群体的基因多
样性分析。诚然,至今没有一种反向遗传学方法适
合于所有的研究目的,但 ( Eco) T ILLING技术弥补了
其他技术的一些缺点, 如它所检测的错义突变是阐
述复杂基因功能及基因互作所必不可少的 [ 29] ; 另
外,通过检测非编码区内的保守序列区,它还有助于
研究调节区域 [ 6]。尽管随着测序技术或新的突变
检测技术的发展, ( E co) TILLING技术可能会被其它
技术所取代, 但在当今, ( E co) T ILL ING技术仍然是
许多物种高通量反向遗传学研究的理想选择。
参 考 文 献
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