全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 042020
TILLING技术的原理、特点及其在点突变
筛选中的应用
李春寿1 　阮关海1 　张琳琳2 　吴殿星2 3
(11 浙江省农科院作物与核技术研究所 , 浙江 杭州　310021 ; 21 浙江大学核农所 IAEA 合作中心 , 浙江 杭州　310029)
摘　要 :TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) ,是一种全新的反向遗传学研究方
法 ,它提供了一种高通量、低成本规模化高效筛选化学诱变剂 EMS 诱发产生点突变的技术。
本文简要介绍了 TILLING的原理和技术优势 ,并对其在植物功能基因组学、突变分子育种和预
测突变频率中的应用作了初步探讨。
关键词 :TILLING;点突变 ;植物功能基因组学 ;突变分子育种
THE METHODOLOGY AND CHARACTERISTICS OF TILLING AND ITS
APPLICATION IN SCREENING FOR INDUCED POINT MUTATIONS
LI Chun2shou1 　RUAN Guan2hai1 　ZHANGLin2lin2 　WU Dian2xing2
(11 Crop and Nuclear Technique Institute , Zhejiang Academy of Agriculture and Science , Hangzhou , Zhejiang ,310021 ;
21 IAEA Collaborating Center , Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 310029)
Abstract :TILLING ( Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) is a novel reverse genetics technology that
provides a high throughput and low cost strategy for efficient , large2scale screening of point mutations induced by
chemically mutagenic agent2Ethyl Methane Sulfonic acid ( EMS) . In this paper , the methodology and technical
advantages of TILLING were briefly introduced and its applications in plant functional genomics , mutational
molecular breeding and predicting the mutation frequency were tentatively discussed.
Key words :TILLING; point muation ; plant functional genomics ; mutational molecular breeding
收稿日期 :2004209220
基金项目 :863 重大育种专项 (2002AA207001) 、浙江省重大项目 (0406) 、浙江农科种业公司
作者简介 :李春寿 (1964 - ) ,男 ,浙江三门人 ,副研究员 ,主要从事作物遗传育种研究。吴殿星为通讯作者 , Email : dxwu @zju. edu. cn。
遗传学发展史上最重要的突破之一是发现突变可以人工诱发。辐射和化学诱变可引起基因产生高
频率的突变 ,这使得原先仅凭自发突变难以开展的遗传学研究成为可能。以突变体为材料进行基因功
能的研究 ,便于深入认识高等生物的遗传特性。烷化类诱变剂诱发产生的点突变 ,其突变频率高 ,育种
实用性强 ,但点突变鉴定困难限制了其在功能基因组学研究中的应用。
反向遗传学是相对正向遗传学而言的 ,是在已知基因序列的基础上分析研究基因的功能。随基因
序列库的不断扩充 ,反向遗传学方法正逐步替代以表型筛选为主的正向遗传学方法成为功能基因组学
研究的主要方法。反义 RNA 抑制和插入突变是植物中最常用的 2 种反向遗传学的研究方法 ,但 2 种技
术均需耗时的转基因和复杂的组织培养 ,作为常规方法应用仅限于极少数物种。
TILLING技术是美国华盛顿 Fred Hutchinson 癌症研究中心以 Steven Henikoff 为首的科学家发展建立
的[1 ] ,它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与 PCR 筛选技术和高通量检测方法有效结合 ,以发
现分析目标区域点突变 ,是一种全新的高通量、低成本的反向遗传学研究方法。
713　核 农 学 报　2005 ,19 (4) :317～321Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
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1 　TILLING技术的原理
111 　TILLING技术的操作流程
TILLING技术先用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变 ,再用设计的特异性引物进行 PCR 放大 ,而
后将 PCR 扩增产物变性退火形成变异源双链核酸分子 ,再用一种特异切割错配的内切酶酶切 ,最后变
性处理采用双色聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析。Colbert 等[2 ] 和吴海滨等[3 ] 所描述的 TILLING技术主要
操作流程见图 1。
图 1 　植物 TILLING技术操作流程示意图
1 :甲基磺酸乙酯 ( EMS)诱变干种子 ,诱导产生一系列的点突变 ;2 :按单株种植诱变一代 M1 植株 ;3 :M1 植株自交 ,产生诱变二代 M2 种
子 ;4 :按单株提取 M2 植株的 DNA ,存放于 96 孔微滴定板 ,建库 ,收获并保存 M3 种子 ,形成种子库 ;5 - 8 :倍库混合 DNA 以增加工作通
量构建 DNA 池 ;6 :按目标基因设计特异性引物 ,分别标记 700nm 和 800nm 荧光染料 ,PCR 扩增大量的目标分析区域 ;7 :PCR 扩增产物
变性、退火 ,获得野生型和突变型发生错配的异源双链核酸分子 ;8 :用特异性识别并切割发生碱基错配的内切酶 CELI 酶切异源双链
核酸分子 ;9 :酶切产物变性 ;10 :采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (DPAGE)检测 ; 11 :图象处理发现突变子 ;12 :采取相同的方法在 8 倍库
中锁定突变单株
最初的 TILLING是利用变性高效液相色谱 (DHPLC)检测DNA 池中的突变[1 ] 。为满足规模化筛选的
需求 ,Colbert 等对 TILLING作了进一步改进 ,即先用特异性识别碱基错配的内切酶酶切异源双链核酸分
子 ,再用 DPAGE检测点突变存在与否。包括 S1 核酸酶和 T4 核酸内切酶 Ⅶ在内的几种酶已用于碱基错
配的特异性识别和切割 ,其中应用较多的是 S1 核酸内切酶家族中的 CEL I 酶[5～7 ] 。CEL I 酶不仅能识别
错配碱基并切割发生错配碱基的 3′端 ,也能将超过 1kb 的 PCR 扩增产物的点突变限定在几个碱基对以
内。因此 ,改进后的 TILLING有机结合了 CEL I酶和凝胶电泳技术 ,是一个低成本、高通量的突变基因筛
选技术。
112 　TILLING技术中引物的设计
按目标基因序列设计引物 ,是 TILLING中一个重要步骤 ,设计的好坏直接影响 TILLING的筛选效
果。Nick Taybr 和 Elizabeth A Greene 专门为拟南芥 TILLING项目研究开发了 CODDLE 程序[ 8 ] 。CODDLE
不仅能识别各种形式的序列信息 ,按输入的碱基序列产生基因模型和蛋白质保守区域模型 ,也能列出
EMS 诱导植株产生有害突变的可能范围 ,当 1kb 左右的区段被选中后 ,系统将会根据最有可能突变成为
终止密码子的区域或进化保守区域设计引物[3 ] 。设计完成后 ,研究人员可用 Primer3 程序对 CODDLE 列
出的候选引物加以选择[9 ] 。
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113 　TILLING技术中点突变的检测
点突变通常存在检测困难的问题 ,这也是 TILLING应用上的关键障碍。要得到好的结果 ,要求检测
仪器不仅灵敏度高 ,也能识别假阳性位点。Collbert 等[2 ]将双色红外荧光扫描系统引入 TILLING中 ,大大
提高了筛选效率[10 ] 。由于杂质、干扰分子在红外光区几乎不发光 ,用红外荧光检测的背景非常低 ,灵敏
度高 ,能够对由 8 个 DNA 样品组成的 DNA 池中检测出 100 attomoles 的 CELI 酶切产物。加上双通道检
测 ,2 个通道检测波长相距 110nm ,几乎无光谱重叠的干扰 ,保证 TILLING分析中每个突变碱基的准确识
别及整个检测的灵敏度。在 2 个通道的电泳图上相同泳道都可以检测到新的条带。用 UNIX 程序
“grab”(见 http :ΠΠwww. imagemagick. org) 可将LI2COR 扫描仪上的图像文件处理成适合于 Adobe Photoshop
分析的 J PEG压缩文件 ,并进行存档。
图 2 　双色红外荧光检测的特征性电泳图谱
(左 800nm ,右 700nm)
图 2 是一张典型的双色红外荧光检测电泳图
谱。由于 2 个剪切片段采用不同的荧光染料标
记 ,发生突变的泳道 ,在 700nm 的图上可在野生型
条带下方见到 1 条带 ,同时在 800nm 的图上相同
泳道也会有 1 条带 (如示意图中右边与左边的 3、
5、9、12 泳道) ,这 2 个条带就是 CELI 核酸酶的剪
切产物 ,2 个条带片段大小之和等于扩增片段的大
小 ,从而很易检测突变扩增产物。Photoshop 图像
处理工具也能确定发生突变的泳道和突变条带的
迁移距离。
114 　TILLING技术中突变体及表型的鉴定
一旦从 1 个 DNA 池中检测到 1 个突变 ,那么
就需对该 DNA 池中每个单株的 DNA 样品进行筛
选。单株 DNA 样品可排列在 1 个 8 ×8 的微量滴定板中 ,每个 DNA 池对应一排 8 个 DNA 样品。用有 8
个吸头的移液器将阳性 DNA 池对应的 8 个 DNA 样品转移至一个新的微量滴定板 (8 ×12)中。因此每板
可以对 12 个阳性 DNA 池中的所有单株进行筛选。利用 UNIX程序 (pick) 可方便地将筛选的每块 96 孔
板的每一行与阳性 DNA 池对应 ,并以表格的形式将结果输出。为能检测突变 ,每个单株的 DNA 样品中
等量混入野生型 DNA 样品 ,然后按与筛选 DNA 池同样的方法筛选突变单株。通过 2 次的筛选 ,筛选
1kb 左右的目标片段 ,每块胶约可筛选 750kb 的基因组序列 (1kb ×8 个单株 DNA ×96 孔) 。每 96 孔 DNA
池相当于 768 个单株 ,平均可筛选 7 个点突变。
虽然 TILLING技术大幅度减少了突变筛选的工作量 ,但是后期突变表型的确认仍需很多工作。一
般的做法是通过异型杂交 ,产生多样性后代以确认突变表型。一种快速的方法是鉴定 2 个独立有害突
变位点的个体 ,将二者杂交 ,分析后代的基因型。在每个含有非等位基因的个体中 ,均会发现 1 个属于
2 个亲本之一的突变表型 ,而将不等位的突变单独归类[4 ] 。
2 　TILLING技术的特点
211 　一种全新的反向遗传学研究方法
反义 RNA 抑制和插入突变是现有利用基因敲除策略开展反向遗传学研究的 2 种主要方法[11 ] 。但
是 ,要获得并分析基因组中每个基因的敲除突变体 ,事实上难以实现 ,因为 : (1) 某些必需基因控制基本
的生物功能 ,插入突变将导致个体致死 ,因此无法获得该类突变以分析它们的功能 ; (2)有些基因本身很
小 ,有待插入的目标区域也就很小 ,难以获得刚好敲除该基因的突变 ; (3)很多基因具有多个拷贝或是相
似的复等位基因 ,要获得同时对一个基因不同的拷贝或复等位基因的所有位点均敲除的突变可能性很
小 ,导致无法分析该基因的功能。目前 ,对 RNA 干扰 (RNA interference , RNAi) 抑制的研究十分热门[12 ] ,
然而 RNAi 抑制的功效仍旧不明朗 ,表现在后代表型的多样性及不可预见性[13 ] 。与此同时 ,由于上述技
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术均依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统 ,需耗时的转基因和复杂的组织培养 ,作为常规方法加以应
用目前仅限于极少数物种[4 ] 。
传统的化学诱变方法 ,能诱发产生高密度的点突变 ,不仅便于农作物诱变育种的实际所需 ,也有助
于基因的精细定位和了解蛋白质的功能 ,在基因功能的分析方面具有独特的技术优势。尽管传统化学
诱变方法在表型选择方面依旧被广泛利用 ,但点突变鉴定困难限制了其在功能基因组学研究中的应用。
与其它基因敲除的突变方法相比较 ,TILLING技术的基本点是诱发突变和突变的高效筛选 ,即有效
结合高频率点突变和 PCR 筛选技术 ,可发现错义突变、基因截短型损伤等突变类型 ,表现了 3 方面的技
术优势 : (1)可获得大量的等位基因系列 ,对一些表型分析时可能涉及的亚致死必需基因、长度很小基
因、复等位基因等具有独特的技术优势 ; (2)可诱导产生高频率的点突变 ,筛选目的基因需要较小的突变
群体 ; (3)不依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统 ,无需耗时的转基因和复杂的组织培养。
212 　高通量、低成本 ,可自动化操作
由于集成了高通量的电泳检测设备、优秀的图像处理系统和分析软件及一种能够给 96 孔微量滴定
板自动加样设备等多种技术 ,TILLING可自动化操作[14 ] 。目前 ,在拟南芥研究中 TILLING已实现完全自
动化[15 ] 。
对突变体的规模化筛选 ,TILLING无需借助先进的仪器设备 ,是一种高通量且相对廉价的实用技
术。筛选每块 96 孔微量滴定板相当于筛选了 768 个 M2 单株 (8 ×96) ,每个目标筛选区段大约为 1kb ,那
么每块胶大约可以检测 750kb 的基因组序列。在 Colbert 等的研究中 ,仅需 1 个技术员 ,1d 就能完成 4 轮
筛选 ,可检测 3000 个突变株 ,相当于检测了 300 万个碱基对。对于突变频率高的群体 ,1d 可筛选 20 个
突变 ,至少鉴定 1 个基因。
213 　适用于大量或少量的筛选
在适用于高通量筛选的同时 ,TILLING也适合少量筛选 ,因为高频率的点突变只需相对较小的突变
群体。在拟南芥研究中 ,TILLING筛选基因一般只需原来一半大小的突变群体。Till 等[15 ] 采用 1 对引物
就从拟南芥 6912 个突变单株筛选出预期的突变基因。如果使用多对引物筛选 1 个基因 ,所需的突变群
体将更小。McCallum 等[4 ]研究报道 ,1000 个突变单株即可达实际所需。
214 　能有效排除假阳性
TILLING采用了双色红外荧光检测 CEL I酶切产物 ,能够有效排除假阳性条带。假阳性通常存在 2
种情况 :一是 1 个通道的电泳图中多个泳道出现阳性条带 ;二是 2 个电泳图相同泳道在相同位置出现阳
性条带。因为 2 个单株出现相同点突变的可能性很低 ,推测发生第 1 种情况的可能是由于某种同源双
链对 CEL I酶特别敏感 ,能被其酶切 ,使得同样条带出现在一张电泳图的不同泳道上 ;发生第 2 种情况的
可能是由于错误导致产生大量的相同大小的双末端标记产物。在扩增循环中 ,小的产物比大的产物具
有一定的选择优势。Colbert 等[2 ]研究发现 ,当 1 对引物分别用 700nm 和 800nm 的荧光染料标记时 ,PCR
产物的产量比较低且不稳定 ;当把标记的引物和非标记的引物混合后扩增 ,PCR 产物则会相当稳定。
3 　TILLING技术的应用
311 　广泛用于植物功能基因组学研究
以美国为首的北美实验室借助 TILLING技术 ,直接推动了拟南芥功能基因组学项目的建立。该项
目在立项后 1 年内就为拟南芥的研究者提供了超过 100 个基因的 1000 多个突变位点。Fred Hutchinson
癌症研究中心 ,借助高通量的 TILLING技术 ,利用 6 台自动加样的LI2COR 凝胶分析系统 ,每 8h 进行 2 轮
筛选 ,达到每天可检测大约 10000 拟南芥单株、筛选 3 个基因的惊人水平。此外 ,国际上不少研究单位
以 TILLING为技术平台 ,开展了各种生物的功能基因组学研究。
312 　有机结合诱变技术和生物技术 ,作为分子育种的特例用于农作物突变分子育种
EMS 是一个高效稳定的烷化类诱变剂 ,能诱发产生高密度的系列等位基因点突变 ,不但为农作物诱
变育种的选择提供空间 ,而且有利于基因的精细定位和了解蛋白质的功能。尽管 EMS 在表型选择方面
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依旧被广泛利用 ,但存在 EMS 诱发产生的点突变难以鉴定的问题。TILLING技术 ,实现了高频率点突变
与现代分析技术有效结合 ,不仅可获得点突变的等位基因系列 ,而且仅需较小的突变群体就可筛选到目
标基因的突变体。因此 ,按目的基因序列设计特异性引物 ,TILLING提供了从分子水平上定向规模化筛
选突变体的技术平台 ,尤其对品质和营养成分等无法从植株表型上加以选择或耐逆、恢复性、不育性等
难以快速评价的性状筛选尤为有利。相对于转基因和分子标记辅助选择等分子育种 ,基于 TILLING的
诱变技术 ,将是一种高效定向性的育种技术 ,即它不但继承了诱变育种稳定快、与原亲本相仿只改变单
个目标性状的传统优点 ,而且无须耗时的转基因和连续的杂交、回交过程。
313 　估算突变的概率 ,指导突变群体的构建
众所周知 ,EMS 主要诱发产生 3 种类型的点突变 :第 1 种诱导密码子变为终止子 ,使翻译的蛋白质
失去功能 ,形成无义突变 ;第 2 种诱导突变发生在编码区以外或以内 ,但不改变氨基酸编码顺序 ,形成沉
默突变 ;第 3 种诱导突变引起氨基酸编码顺序的改变 ,形成错义突变。EMS 主要诱导碱基从 C到 T的突
变 ,从而引起碱基从 CΠG到 TΠA 的转换突变。根据不同作物的氨基酸编码特性 ,可大概估计 3 种突变的
发生比例。如在拟南芥中 ,可知大约 5 %的突变是无义突变 ,35 %是沉默突变 ,65 %是错义突变[1 ] 。因
此 ,利用 TILLING技术可预先估算突变的概率 ,指导突变群体的构建。
作为一种高通量、低成本的反向遗传学研究方法 ,TILLING技术无需先进的生物学仪器设备 ,基因
组序列信息为其提供了良好的研究素材。有理由相信 ,随着基因组学的不断发展 ,TILLING技术将会得
到更加广泛的应用。
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