全 文 ： 技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
RNA i技术及其在植物研究中的应用
杨超1 王国春 2 徐碧玉 1 金志强 1*
( 1 中国热带农业科学院生物技术研究所 热带作物生物技术国家
重点实验室,海口 571101; 2海南省琼海市华侨中学,琼海 571400)
摘 要: RNA干扰 ( RNA inter fe rence, RNA i)是利用双链 RNA( dsRNA)特异性地降解相应序列的 mRNA, 从
而特异性地阻断相应基因地表达,且此现象广泛存在于从真菌到植物、无脊椎动物、哺乳动物的各种生物中。介绍
了 RNA干扰的研究历史、RNA干扰的作用机制及此技术在植物中的应用。
关键词: RNA i 基因功能 生长发育 遗传改良
RNAiTechnology and Its Application in P lant
Yang Chao
1 Wang Guochun2 Xu B iyu1 Jin Zhiqiang1
( 1 State K ey Labora tory of T rop ical C rop sB iotechnology, Institute of T rop ica l B io science and
B io techno logy, Ch inese A cademy of T rop ical Agricultural Sciences, H aikou 571101;
2 q iong hai hua qiaom idd le school of hainan province, haikou 571400)
Abstrac:t Introduction o f doub le- stranded RNA( dsRNA) into cells can induce spec ific mRNA degrada tion. This
process is ca lled RNA in terference ( RNA i). RNA i ex ists in many eukaryo tic organ ism s, inc luding fung i, p lant, inverte
brate and m amm al. In this article, the ro le mechan ism of RNA i has been summ arized, and the application of RAN i in
p lant func tiona l genom ics has a lso been rev iew ed.
Key words: RNA i Gene function Grow ing deve lopm ent Genetic improvem en t
作者简介:杨超 ( 1980) ,女,四川眉山人,硕士,研究方向:基因工程在育种中的应用
研究发现, RNA干扰 ( RNA i)是指由小双链
RNA有效地作用于同源 RNA序列, 经细胞内核酸
酶作用使同源序列降解的过程。RNA干扰现象是
近十几年来最激动人心的发现之一, 很多生物的基
因都可以通过该技术使其发生沉默, 因此该技术已
经成为后基因组时代基因功能研究的有力工具。
1 RNA i研究的回顾
首次发现双链 RNA能够导致基因沉默的线索
来自于对线虫的研究。 1995年康乃尔大学的
Guo
[ 1]博士在实验中想通过反义 RNA阻断美丽线
虫 ( C. elegans)的 par1基因表达, 同时她还用正义
RNA做了一个对照, 试图观察到对照试验组基因表
达增强的现象,但结果却发现了反义和正义都阻断
了该基因的表达。Guo等人一直不能解释该现象。
直到 1998年华盛顿卡耐基研究院的 Fire[ 2]等才发
现这是由于 Guo博士在试验中污染了双链 RNA而
引起的;他们还证明转录得到的单链 RNA经纯化后
注射线虫所引起的阻断作用十分微弱,而经纯化的
双链 RNA则能高效特异地阻断相应基因的表达, 他
们将此现象称为 RNA干扰 (RNA i)。
RNA i现象的发现使人们注意到多年前在转因
植物中出现的类似现象。早在 1990年, 人们对烟草
植物进行基因转化实验时, 偶然发现将全长或部分
基因导入植物细胞后, 某些内源性基因在植物体内
不能表达,由此推测植物细胞的某种防御机制导致
了上述现象的产生,但这在当时并未受到科学界的
足够重视 [ 3]。同年, Napo li等 [ 4]把查尔酮合成酶基
因 ( CHS)置于强启动子后,导入矮牵牛花中,试图加
深牵牛花的颜色,结果却发现花的颜色全部或部分
变白。进一步分析发现, 这些转入的基因不但自身
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没有表达为蛋白质, 而且还抑制了牵牛花中与其同
源的色素相关基因的表达。由于导入的基因和牵牛
花内源的着色基因都被抑制 ,所以他们当时把这种
现象称为 共抑制 ( cosuppression )。 1994年,
M acino和 Cogon i在真菌中也发现此类现象, 他们将
合成类胡萝卜素所需的基因导入粗糙红色链孢霉
中,导致 30%的转化细胞中霉菌本身的基因失活,
并将其称为基因的静息作用 ( que lling ) [ 5, 6]。在
1999年短短的一年里, 人们就发现 RNA干扰现象
广泛存在于植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、鼠、
猴、人类等所有的真核生物细胞中 [ 3]。 2000年, 人
们又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也同样
存在 RNA干扰现象 [ 7, 8 ]。
2 RNA i的作用机制
随着对 RNA干扰作用机制的深入研究, 人们发
现 RNA干扰在一些低等生物、植物、果蝇和哺乳动
物中的作用原理基本相似。 RNA干扰发生的主要
过程可分为下面三个阶段 [ 9] (如图 1)。
图 1 RNA干扰过程
2. 1 dsRNA的形成
外源的 DNA、RNA序列都可使细胞内产生相应
的 dsRNA,但产生的方式不同。单链 RNA在 RNA
依赖 RNA聚合酶 ( RdRP)的作用下合成其互补链并
且与之形成 dsRNA; 重组基因、转基因等 DNA序列
在细胞转录出 RNA后经 RdRP也可形成 dsRNA;转
座子由于其本身具有反向重复序列, 细胞可以通过
它直接产生 dsRNA;正义和反义 RNA的同时转录也
可以产生 dsRNA。 dsRNA可以是两个 RNA分子互
补形成的分子间双链,也可是一个 RNA分子回折形
成分子内双链 [ 10 ]。
2. 2 siRNA的形成
当细胞内双链 RNA达到一定量的时候, 会被一
种特异核酸内切酶 ( D icer)所识别。该酶属 dsRNA
专一内切酶 RN aseⅢ家族,具有 1个解旋酶结构域,
1个 PAZ结构域, 1个 dsRNA结合结构域和 2个
RN aseⅢ结构域 [ 11 ]。D icer与 dsRNA 结合, 形成
酶 dsRNA复合体,在 ATP的作用下, D icer先将
dsRNA解旋,接着将其切割成长度为 21~ 23nt的小
干涉 RNA ( small interfering RNA , siRNA )。该 siR
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2006年增刊 杨超等: RNA i技术及其在植物研究中的应用
NA 5端为磷酸基, 3端为羟基, 且 3端有 2个 nt的
突出。
2. 3 RNA i的形成
首先,生成的 siRNA与细胞中的内切核酸酶及
其他蛋白质结合, 形成 RNA诱导的沉默复合物
( RNA induced silenc ing complex, R ISC ) , R ISC的核
酸部分起靶向性的作用,蛋白质部分起降解 mRNA
的作用。具有序列特异性的核酸内切酶活性,能特
异性地降解与 siRNA同源的目标 mRNA[ 12]。
然后激活 R ISC, 这是一个依赖 ATP将 siRNA
解双链的过程, 也是 RNA i作用过程中消耗的第 2
个 ATP[ 12]。S iRNA作为引导序列引导 R ISC与同源
性的 mRNA结合, 解旋酶催化 mRNA与 SiRNA的正
义 RNA链相互交换,反义 RNA链与同源的 mRNA
结合后,核酸酶在 mRNA与反义 RNA所形成的双
链区的 5起始端下游 7~ 10个核苷酸处切断 mR
NA,降解的 mRNA被释放。经过多次这样的重复过
程后, 一条完整的 mRNA就被切割成多个小片段
RNA,从而就使得相关基因的表达受到抑制。
3 RNA i技术在植物研究中的应用
3. 1 在植物功能基因组研究中的应用
在 RNA干扰现象被发现之前, 人们就利用 T
DNA和转座子基因转导技术、化学诱变剂或辐射诱
变方法、反义 RNA技术、基因剔除等策略来产生功
能缺失的突变体而从表型的变化来推测基因的功
能,这些都是植物功能基因组研究中比较直接的方
法。而今 RNA i技术作为高通量的植物功能基因组
研究的工具正在被广泛的应用,到目前为止,已经利
用 RNA i技术鉴定了线虫绝大部分基因的功能。在
果蝇、昆虫、真菌、植物、哺乳动物中也相继鉴定了一
大批新基因的功能 [ 13~ 15] ,其中研究最深入的是拟南
芥功能基因组的研究。目前, CAMTA ( Comp leteA ra
b idops transcriptiom em icroarray)计划已开始实施, 以
获得覆盖拟南芥全基因组的高质量的基因序列标签
( genesequentag, GST )
[ 16]
, 为了分析 CATMA中每一
个 GST的功能 He lliw ell及同事利用 Inv itrogen公司
的 Gatew ay重组克隆技术, 构建高通量基因沉默的
载体系列 pHELLSGATE [ 17] ,用以构建包括全部拟南
芥基因组的 ihpRNA转基因系。借鉴这种思路, 澳
大利亚的一个公司也构建出多种适用于禾本科植物
的 RNA i载体 pH ann ibal和 pKann ibal质粒载体
系列 [ 18] ,并利用这种技术开发出抗大麦黄色侏儒病
毒的大麦品种;适用于组成型或诱导异常表达及表
达 GU S或 GFP融合蛋白的双元载体 [ 19] , 以烟草花
叶病毒为基础构建的高通量 V ICS载体系列 [ 20]都是
根据同一思路,以分析植物功能基因组为目的而构
建的载体系列, 这系列 RNA i载体将为日后植物功
能基因组的研究提供更多有价值的信息。
利用 RNA i技术不仅可以鉴定新基因的功能,
还可以对已知基因的功能进行验证。目前, 已经在
水稻、芸薹属和油菜以及烟草上做了一些基因功能
验证的相关研究 [ 21]。
3. 2 在植物生长发育研究中的应用
在研究生物体早期发育时通常以抑制特定基因
的表达来研究该基因在生物体生长发育中的作用。
如果能在一定时期内把细胞内目标基因去除, 会得
到更有价值的研究信息。传统的基因剔除技术在生
物研究中占有重要的地位, 但是所要求的技术条件
和实验费用较高, 应用范围也有一定的局限性。而
RNA i技术相对操作简单、费用低, 无疑是一种快速
有效的 基因去除方法。
在拟南芥花的发育中有四个基因起着重要作
用: AG基因控制雄蕊和心皮的发育, CLV3扩大花
器官的分生组织, PAN的功能是决定特异数目及花
器官原基的位置, AP1在决定花的分生组织特性及
在萼片和花瓣等花器官的正常发育中起作用 [ 22, 23]。
Chuang 等 [ 24] , 用 RNA i技术进一步证实了 AG,
CLV3, API, PAN基因在拟南芥花的发育过程中所起
的作用。 Senth ilkumar等 [ 25]通过 RNA i技术发现两
个 V HAc基因, V HAc1和 V HA c 2在拟南芥生
长中通过主动胞外分泌向细胞供给 V APTase, 支持
扩增细胞的生长。V arsha等 [ 26 ]发现利用拟南芥抑
制开花的基因 FLC 1为目的基因的 RNA i转基因后
代与野生型比较, 转基因的拟南芥开花早, 叶数少。
FLC1基因与花期之间的关系更进一步证实了 ihpR
NA结构的 RNA i可以有很高的基因沉默率,而且作
用也很强。
此外 Byzova等 [ 21]通过 RNA i技术成功地对拟
南芥和甘蓝型油菜的花器官进行了改造, 培育出了
没有花瓣但是其它功能完整的花。在花器官中起作
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
用的有 A, B, C三类基因: A类基因的作用是形成萼
片, A和 B共同作用形成花瓣, B和 C共同决定雄
蕊,心皮则由 C单独决定. 他们把在拟南芥中已经
克隆到的 B类基因 AP3和 P1作为目的基因构建
RNA i载体, 转化到拟南芥和油菜中, 获得花冠发育
为萼片的拟南芥和萼片状花冠的油菜, 且均为可育
的。
3. 3 在植物遗传改良中的应用
3. 3. 1 作物品质的遗传改良 植物产品是人们的
生产生活必需的物质基础,随着人们生活水平的提
高,对植物产品品质的要求也日益提高。比如油料
作物中的不饱和脂肪酸的含量, 咖啡中的咖啡因的
含量等。传统育种方式很难同时改变作物的多个品
质性状,如营养成分的组成比例等。人们对一些生
化物质代谢途径的充分认识使得利用分子技术培育
优良作物成为可能 [ 27]。
食用油是人们生活的必需品, 是提供人体热能
和必须脂肪酸、促进脂溶性维生素吸收的重要食物。
食用油脂是甘油和各种脂肪酸所组成的甘油三脂的
混合物 可分为三类:饱和、单不饱和和多不饱和脂
肪酸。各种脂肪酸对人体而言都具有重要的生理功
能。但是饱和脂肪酸含量过高会导致血胆固醇浓度
上升; 不饱和脂肪酸可降低胆固醇、预防冠心病等心
血管疾病。从维护人体健康的目的出发, 人们对植
物油的品质要求也越来越高了。棉花籽油中的饱和
脂肪酸相对较高,对降低胆固醇不是十分理想。因
此 L iu等 [ 28]利用 RNA干扰技术对棉花籽油的成份
进行了改良,提高了棉花籽油中硬脂酸与油酸的比
例。L iu等利用导入双链 RNA技术以脂肪酸去饱和
酶关键基因 9去饱和酶编码基因 ghFAD1和 6
去饱和酶编码基因 ghFAD21这 2个基因为目标分
别转化棉花 Coker315, 使该基因在棉花中的表达受
到抑制,且将棉花籽油中硬脂酸含量从 2% ~ 3%提
高到 40% ,油酸从 15%提高到 77%, 分别得到了硬
脂酸和油酸含量较高的转化植株, 然后利用这两种
转化植株进行杂交, 最后获得了含高硬脂酸和高油
酸的棉花植株 。
咖啡是当今世界上消费量最大的一种饮料,但
它所含的咖啡因对于高血压患者来说容易使血压升
高并诱发心脏病,因此全世界对于低咖啡因含量咖
啡的需求日益增多。虽然也可以用一些物理或化学
的方法来降低咖啡中咖啡因的含量,但这不仅会使
成本增加,而且还会使咖啡的部分风味丧失。 Sh in
jiro Og ita等 [ 29 ]利用 RNA i技术对咖啡因合成酶基因
进行抑制, 使植株中的咖啡因含量比原来减少了
50% ~ 70%。
3. 3. 2 作物抗病的遗传改良 RNA干扰现象本身
就是植物天然的病毒防御系统。利用转基因技术将
与病毒同源的 dsDNA的 hpRNA载体整合到植物基
因组,表达后就会引起病毒基因组的特异性降解,阻
止病毒的复制扩散, 获得稳定遗传的抗病毒植物。
水稻黄斑病毒 ( RYMV )感染是非洲水稻的严重病
害, 它可使水稻植株出现黄斑、矮化、叶片变窄、抽
穗少、籽粒不实等症状。将编码该基因的一关键酶
的基因转入水稻,诱发该基因沉默,从而使植物具有
水稻黄斑病毒的抗性, 从而育成了可抗非洲各地的
RYMV的水稻品种, 且能构稳定遗传 3代 [ 30]。马铃
薯病毒 Y( PVY )是马铃薯第二个重要病毒性病害,
它可通过感染的块茎长期存在并由蚜虫非持续性地
传播。W aterhouse PM [ 31 ]将编码马铃薯 Y病毒蛋白
酶基因地正义序列和反义序列同时转化马铃薯, 转
基因植株对该病毒有一定的抗性。
4 展望
RNA i技术已经作为一种新的技术方法, 在各个
生物研究领域内广泛应用并取得了很多重要成果,
因此 RNA i为大规模高效而复杂的功能基因组学研
究提供了一个便捷的平台, 也是植物遗传改良的有
力工具。随着 RNA i机制研究的深入和 RNA干扰
技术的日趋完善,人们将在生物学研究及应用中开
辟一片新天地,该技术将被广泛地用于各个生物研
究领域,具有巨大的科研、经济和社会价值。
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