全 文 ：高羊茅植株再生体系的研究与建立
梁蕊芳1, 2
黄丛林1
于荣3
张秀海1
田自华2
吴忠义1*
( 1北京农业生物技术研究中心, 北京
100089; 2内蒙古农业大学农学院,呼和浩特
010018;
3 首都师范大学生命科学学院,北京
100037)
摘
要:
利用幼苗下胚轴建立了高羊茅( Festuca arundinacea Schreb. )植株再生体系。当高羊茅种子以次氯
酸钠为主要消毒剂时,其最适的浓度和时间分别为次氯酸钠 50% ( V/ V )处理 20 m in, 种子发芽率为 80% , 污染率
为 0%。研究发现用高羊茅下胚轴诱导愈伤组织时,下胚轴的不同的切法对愈伤组织诱导有影响, 从一端切的下胚
轴诱导愈伤率 74. 7%高于从两端切 55. 8%。以下胚轴为外植体, 2, 4-D的浓度为 9 mg
L-1时, 愈伤组织诱导率最
高。高羊茅愈伤组织的分化再生率可达 80. 7%。
关键词:
高羊茅
愈伤组织诱导
再生体系建立
Study and Establishment of the Plant Regeneration
System of Tall Fescue
Liang Ruifang
1, 2
H uang Cong lin1
Yu Rong3
Zhang Xiuhai1
T ian Zihua2
Wu Zhongy i1
( 1 Bei j ing R esearch Center of A g ro-B iot echnolog y , B ei j ing
100089;
2 Col le ge of A g ronomy , I nner Mong ol ia A gr icul tur al Univ er sit y , H ohhot
010018;
3 Col l eg e of L i f e S ci ence , Cap i tal N or mal Univ e rsi ty , Bei j ing
100037)
Abstract:
The regener ation system of the low er plumular axes from tall fescue young seedling has been estab-
lished in this study . In order to establish a tissue culture system for tall F escue, differ ent way s of seeds treatment
wer e done to investigate their effects on the germinat ion and pollution rates of seeds, and the r esults show ed t hat the
optimum concentration of sodium hypochlo rite w as 50% , and the optima l time fo r tr eatment w as 20 min. The lower
plumular of t all fescue axes f rom tw o species sliced w ith two methods w ere used to induce callus, and the results
show ed callus induction rates sliced from one end incr eased 18. 9% than that fr om two ends befo re plating. The low-
er plumular axes of tall fescue seedling were inoculated on the MS mediums w ith differ ent 2, 4- D concent ration to in-
duce calli, and the results indicat ed that 9 mg
L- 1 2, 4-D was the optimum concentr ation on calli induct ion, and the
regenation rate of calli reached 80. 7% .
Key words:
Tall F escue
Callus induction
Establishment of the regener ation system


高羊茅是世界上一种重要的高营养冷季型饲草,也是一种重要的草坪草[ 1] , 原产西欧、北非,并延伸分布
于西伯利亚、东非及马达加斯加山区。它具有抗干旱、耐瘠薄、抗病、适应性广等特点, 是一种较优良的草
种[ 2]。但同时它又存在叶片粗糙、没有匍匐茎,草坪扩展性差,夏季生长缓慢等缺点[ 3] 。
由于传统育种的局限性日益明显, 通过现代遗传转化技术与传统的育种手段相结合,不仅可以增加植物
的种质库资源, 而且还能改变植物的农艺性状。而建立高效的组织培养体系是植物遗传转化的先决条件[ 4]。
高羊茅组织培养方面的研究开始于 20世纪 80年代, 1979 年, Low e和 Conger 从高羊茅成熟种子胚成功地
诱导愈伤组织并得到再生植株。此后, 人们通过花粉囊培养、幼穗培养、从悬浮培养细胞获得原生质体的培
收稿日期: 2005-01-28
基金项目:北京市科技新星项目( H 020821330130) ;北京市优秀人才项目( 20041D0200504)和留学回国人员择优资助项目

* 通讯作者: E-mail: w uzh on gyi@yahoo. com

生物技术通报

研究报告
          BIOTECHNOLOGY
BULLETIN







2005年第 3期
养和成熟种子诱导愈伤的培养等都获得了再生植株[ 5]。但利用高羊茅幼苗下胚轴作为外植体来诱导愈伤还
鲜见报道。
许多因素会影响到外植体的愈伤诱导和愈伤的质量以及随后的愈伤分化和再生,如外植体的选择, 培养
基的选择,附加成分的影响等。本实验以高羊茅幼苗的下胚轴为外植体,优化高羊茅愈伤组织诱导的条件,
建立高羊茅的植株再生体系, 以期为进一步利用遗传转化改良品种提供基础。
1
材料和方法
1. 1
材料
本实验所用高羊茅品种羚羊、交战Ⅱ种子由北京草业与环境研究发展中心提供。
1. 2
方法
1. 2. 1
种子的消毒
高羊茅种子用无菌水浸泡筛选成熟度低的种子,用 70%的酒精处理 30 s,无菌水冲洗
5次,然后用 10%~ 50%的次氯酸钠对种子进行不同时间的消毒处理。( 1)用 10%、20%、30%、40%、50%
的次氯酸钠消毒 20 min, 无菌水冲洗 6次。( 2)用 50%的次氯酸钠分别消毒 5 min、10 min、20 m in、30 min、
40 min,无菌水冲洗 6次;然后接种在培养基 MS + 1 mg
L-1BA + 0. 1 mg
L-1 IA A上,每瓶接种 20粒,
每个处理做 5个重复,观察并记录种子发芽和污染情况。
实验中所有的培养基都是蔗糖 30 g
L-1 ,琼脂 5 g
L-1 , 灭菌前将 pH 调到 5. 8, 灭菌条件为 117
, 17
min。培养室温度为( 24~ 26)
。光周期为光照 14 h/黑暗 10 h。
1. 2. 2
下胚轴的获得
待高羊茅幼苗长到 2~ 5 cm 左右时进行接种,每瓶接种 20段,每个处理做 10 个重
复,切其下胚轴,切法分为两种: ( 1)切两端。在无菌苗下部种子近胚部约 1/ 3处切掉种子,往上约 1~ 2 cm
再切掉上面的叶片, 只留下中间的下胚轴部分。( 2)切一端。只切掉无菌苗下部种子近胚部约 1/ 3处的种
子。然后接种在 MS + 10 mg
L-1 2, 4-D的培养基上。观察并记录下胚轴的出愈数。
1. 2. 3
愈伤组织的诱导
高羊茅下胚轴的愈伤组织诱导是高羊茅植株再生的关键,本实验以 MS为基本培
养基,附加不同浓度 2, 4-D( 0, 5, 8, 9, 10 mg
L-1 ) ,配制成愈伤组织的诱导培养基。无菌条件下, 切取高羊
茅幼苗下胚轴(切两端)接种在不同的诱导培养基上, 每瓶接种 5段,每个处理做 10个重复, 黑暗条件下培
养,观察并记录下胚轴的出愈数。筛选出高羊茅幼苗下胚轴愈伤组织诱导的最适培养基。
1. 2. 4
高羊茅的再生
4周后,愈伤组织长到直径为 2~ 3 mm 大小时,转移到继代培养基 MS + 5 mg

L
-1
2, 4-D上进行继代培养,每隔 20天左右更换一次培养基。将结构致密、颗粒状、鲜黄或嫩黄的胚性愈伤
组织转至分化培养基上 MS + 1 mg
L-1BA + 0. 1 mg
L-1 NAA 进行 30~ 35天的分化培养。待根分化
出来时,再将其接种到生根培养基上,一个月后,长成具有根、茎、叶的完整植株。
1. 2. 5
炼苗和移栽
将在生根培养基上生长的高羊茅幼苗进行移栽。移栽前先去掉封口膜在培养室中锻
炼 2~ 3天。移栽分两步进行:第一步, 室内移栽。即把经过炼苗的幼苗基部的残留琼脂洗净, 移栽至小盆
内,移栽基质用蛭石和营养土以 2: 3的比例混匀配制而成。第二步, 移栽至大田。
1. 2. 6
数据处理
将实验中统计的数据进行如下处理:
种子发芽率( % ) = (发芽的种子数/接种的种子数)
100
种子污染率( % ) = (污染的瓶数/接种的瓶数)
100
愈伤组织诱导率( % ) = (产生愈伤组织的下胚轴数/接种的下胚轴数)
100
数据用 SA S软件处理。
2
结果与分析
2. 1
种子表面消毒方法的选择
组织培养中,选择外植体的最适消毒方法是实验成功的基础。用 10% ~ 50%的次氯酸钠对种子进行不
同时间( 5~ 40 min)的消毒处理, 从实验结果得出,随着次氯酸钠浓度的增高,污染率在降低,直到次氯酸钠
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Bullet in







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浓度达到 50%,种子发芽率为 80% ,污染率为 0%;同时随着次氯酸钠处理时间的延长,污染率也在降低,处
理 20 min、30 min、40 min, 污染率都为零,但是次氯酸钠处理时间太长会对种子的贮藏物质造成伤害,从而
影响愈伤的诱导,因此选用 50%的次氯酸钠处理 20 min作为最佳消毒方法。
2. 2
下胚轴的两个品种的不同切法对愈伤组织诱导率的影响
表 1
不同切法对愈伤组织诱导率的影响
切法 愈伤组织诱导率%
切一端 74. 7a
切两端 55. 8b
表 2
品种对愈伤组织诱导率的影响
品种 愈伤组织诱导率%
羚羊 64. 0a
交战Ⅱ 65. 9a


表中数据是 10个重复的平均值。方差分析用最小显著极差法( LSR)。同一列中平均值后面的同一字母代表在显著性
水平 P= 0. 05下差异不显著。
用高羊茅两个品种采用两种切法, 获得的下胚轴在同一培养基中进行愈伤诱导,统计出愈率的结果如表
1和表 2所示。从表 1中得出,从一端切下胚轴诱导愈伤率高于从两端切, 且差异显著, 从一端切愈伤组织
诱导率平均为 74. 7% ,而从两端切则为 55. 8%。其可能的原因为从一端切只切去种子的胚乳部分, 而露出
的下胚轴的伤口正好是诱导愈伤起关键作用的分生组织,上面的叶片也能起到提供营养的作用;而从两端切
把上面的叶片也切掉,上面的切口处会继续长出新的叶片,影响下胚轴切口愈伤诱导过程中营养的供给,造
成愈伤组织诱导率降低。其次,由表 2可知, 不同的切法的下胚轴愈伤诱导率与品种没有关系,它们的差异
不显著。
2. 3
不同的 2, 4-D浓度对愈伤组织诱导的影响
表 3
不同浓度 2, 4-D对高羊茅愈伤组织诱导的影响
2, 4- D的浓度( mg
L- 1) 0 5 8 9 10
愈伤组织诱导率% 0. 0c 28. 3b 33. 8b c 53. 8a 41. 3ba


表中数据是 10个重复的平均值。方差分析用最小显著极差法( LSR)。同一列中平均值后面的同一字母代表在显著性
水平 P= 0. 05下差异不显著。
从实验结果来看, 2, 4-D诱导浓度为零时,愈伤的诱导率也为零,由此可见, 2, 4-D在诱导高羊茅愈伤组
织形成中起了重要作用; 随着 2, 4-D浓度的增高, 愈伤组织的诱导率也相应提高, 当 2, 4-D浓度为 9 mg

L-1 , 愈伤组织诱导率达到最高,愈伤组织诱导率平均为 53. 8% ;此后又有所下降, 当 2, 4-D的浓度是 10 mg

L-1时, 愈伤组织诱导率平均为 41. 3% ;浓度 5 mg
L-1和浓度 8 mg
L-1与浓度 9 mg
L-1差异显著, 浓度
9 mg
L-1与浓度 10 mg
L-1差异不显著。利用高羊茅幼苗下胚轴建立植株再生系统过程如图 1所示,愈伤
的分化再生频率可达 80. 7%。
3
讨论与结论
在高羊茅组织培养再生体系的建立过程中,由于高羊茅共生着一种顶孢霉属( A cremonium coenophi-
alum )的真菌[ 3] ,致使用常规消毒方法很难抑制,污染率高, 同时,组织培养过程中高羊茅愈伤组织诱导一直
存在诱导率低, 诱导时间过长的难点。
首先,种子消毒方法的选择。当用高羊茅种子或种子胚作为外植体时,一般用升汞消毒。但是, 用升汞
作为消毒剂时, 由于高羊茅种子较小,而升汞的杀伤力又很强,一旦消毒时间过长, 会杀死部分种子, 且种子
上残留的升汞会对种子产生毒害, 导致种子的发芽率或胚的愈伤组织诱导率偏低。而消毒时间过短,又会增
加污染率。另外升汞对环境的污染和人体的毒害较大,因此消毒剂由升汞改成了次氯酸钠,对其消毒浓度和
时间进行调整摸索出最适的条件。
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梁蕊芳等: 高羊茅植株再生体系的研究与建立
其次,在高羊茅的愈伤组织培养的体系中,外植体的选择很重要,成熟胚或成熟种子、未成熟胚、根尖、花
序在组织培养中都有报道。研究表明, 未成熟胚的愈伤组织诱导率明显高于成熟胚的愈伤组织诱导率, 而且
出愈时间可以从 8周缩短到 4周; 以高羊茅的节和幼穗为诱导外植体,在 MS + 2 mg
L-1 2, 4-D和 MS +
1 mg
L-1 BA + 1 mg
L-1 IBA 可获得 45%的愈伤组织[ 6]。因高羊茅的种子较小,用胚或幼胚为外植体
时,剥胚费时费力,而以下胚轴为外植体, 人们研究的较少, 下胚轴的获得也没有详细的报道, 本实验以 MS
为基本培养基, 加 9 mg
L-1的 2, 4-D, 用切一端的方法,愈伤组织的诱导率可达 74. 7% ,大幅度的提高了愈
伤诱导率。
图 1
高羊茅植株再生过程
a.高羊茅种子
b.高羊茅幼苗
c.从一端切诱导出愈伤组织
d从两端切诱导出愈伤组织
e.在分化培养基上愈伤组织分化成芽
f .再生苗移栽成活
最后,是选择 2, 4-D浓度的问题。自 1979年, Lowe[ 7] 等人用种子成熟胚在 MS + 2, 4-D 9 mg
L-1培
养基上诱导出愈伤组织以来,先后选择的2, 4-D浓度有 2 mg
L-1[ 8, 9]、2. 5 mg
L-1[ 10]、3 mg
L-1[ 11]、6 mg

L-1[ 12] 、8 mg
L-1[ 2]、9 mg
L-1[ 3] 。而在本实验结果是2, 4-D最佳诱导浓度为 9 mg
L-1。但是, 王铖等[ 11]报
道,当 2, 4-D浓度超过 10 mg
L-1时,愈伤组织的诱导率反而会下降,且愈伤组织的质量也不高。太高的 2,
4-D浓度不利于愈伤组织的分化,在本研究中也得到了证实。
本实验建立起的用高羊茅下胚轴的植株再生体系,出愈率达 74. 7% ,愈伤分化再生率可达 80. 7%, 可用
作进一步的遗传转化研究。当然, 在高羊茅的再生体系中, 还存在一些问题,如体系完成植株再生周期较长,
有待于人们进一步深入地研究。
参 考 文 献
1
韩烈宝,杨碚,邓菊芬.草坪草种及其品种.北京:中国林业出版社, 1999, 88~ 99.
2
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3
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40







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蹲
住苗;再生根系密集而粗壮,极大地提高了再生植株移栽的成功率。这一点与师素恩 [ 4]〕等的研究结果
是一致的,再次证实了在生根培养基中加入适宜多效唑可增强根系的活力,提高试管苗的根/冠比值,增强植
物的抗性,提高试管苗对环境条件的适宜能力和移栽成活率这一结论[ 5]。需要注意的是,在使用多效唑时,
一定要控制用量 [ 5]。本次试验中使用的为分析纯制剂,经试验发现用量应控制在( 0. 0004~ 0. 0016mg/ L ) ,
量过大时,试管苗的生长受到影响,叶片颜色变成黄绿至淡绿,生长迟缓,基部愈伤组织产生过多, 影响生根
质量。
另外,对第一次生根未成功的苗,再行诱导生根时,应转至不含多效唑的培养基上进行生根,因为在研究
中发现,再生苗在含多效唑的培养基上培养时间过长, 会在试管中提早成熟,甚至开花,但不能结实。这主要
是多效唑的
促进生殖生长
作用所致。
3. 3
为基因转化初步创造良好的受体系统
本试验中研制的直接分化培养基及生根培养基配方的有效结合, 大大提高了亚麻组培的绿苗诱导率和
移栽成活率,同时极大地缩短了培养周期,为亚麻的遗传转化初步创造了良好的受体系统。相信, 经过不断
地探索研究,我们会将这一系统加以完善,以期对亚麻转基因育种工作有所助益。
参 考 文 献
1
孙洪涛,等.科学通报, 1985, 30( 2) : 1332~ 1334.
2
王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术(第一版) ,北京:科学出版社, 1998, 179~ 185.
3
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4
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5
赵成章,等.植物学报, 1991, 32( 5) : 407~ 409。
(上接第 40页)
4
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5
张万军,李天红,王涛,等.农业生物技术学报, 2004, 12( 2) : 157~ 161.
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何阳鹏,于海涛.安徽农业科学, 2003, 31( 3) : 371~ 374.
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陈文品,吴琴生,刘大钧.中国草地, 1991, ( 3) : 75~ 76.
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支月娥,何亚丽,田龚.上海农学院报, 1998, 16( 1) : 46~ 48.
10
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Garcia A, Dalton SJ, H umphr eys MO . H eredity, 1994, 73: 356~ 362.
12
王铖,李青,辛燕.北京林业大学学报, 2004, 26( 1) : 66~ 69.

国内信息

犬瘟热和犬冠状病毒联合 RT-PCR检测方法的应用
塔里木农垦大学乔军、解放军大学夏咸柱、东北农业大学何宠彬等对此课题进行了研究。他们利用犬瘟
热( CDV)和犬冠状病毒( CCV)牧异性引物对同一样品中 CDV 和 CCV 的 RNA 模板进行联合 RT-PCR扩
增,并优化其扩增条件,得到两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带,且不扩增犬细小病毒、犬腺病
毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。其敏感性试验表明: 该联合 PCR能检测出 10-4倍稀释的 CDV 模板
( 106. 6 TCID50 / 0. 1mL)。对 7份临床发病犬病科检测,其阳性检出率可高于电镜负染检查。这表明此法有高
度敏感、特异、准确、快速等特点,适用于当前民用和军用兽医临床对 CDV、CCV 的检测和对犬的其他疾病
的鉴别诊断。 秦春圃
46







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