全 文 ：转反义磷脂酶 DC基因白三叶草的获得
赵志文1 赵强2 崔德才1*
( 1山东农业大学生命科学学院,泰安 271018; 2山东农业大学应用化学学院,泰安 271018)
摘 要: 利用根癌农杆菌介导法将反义磷脂酶 DC基因( PLDC)转入白三叶草。建立了白三叶草的继代及高
频再生系统,对传统农杆菌侵染方法进行了改良, 通过抗生素筛选获得大量抗性植株。对抗性植株进行了 PCR 和
PCR-Southern 杂交鉴定,证实 PLDC基因已整合入白三叶草核基因组中。
关键词: 白三叶草 根癌农杆菌 转化 PLDC基因 转基因三叶草
Transformation of White Clover With PLDCGene
Zhao Zhiwen1 Zhao Qiang2 Cui Decai1*
(1 Coll ege of Lif e Science , Shandong Agricultural University , Taian 271018;
2College of L if e Sci ence, Shandong Agricultural University, Taian 271018)
Abstract : Antisense phospholipase DC( PLDC) genewas introduced into white clover mediated by Agrobactrium tumef aciens .
In this study, the high frequency regeneration system of white clover has been established and we have developed the traditional
transgenic method by Agrobactrium tumef aciens. PCR and PCR-Southern tests showed that ant-i PLDCgene has been integrated in-
towhite clover genome.
Key words: White clover Agrobacterium tumefaciens Transformation Antisense phospholipase DC Ransgenic clover
白三叶草属于豆科牧草,主要用作反刍动物的饲草饲料, 具有品质优良, 营养丰富, 适口性好等特点[ 1]。
而且白三叶草有固氮能力,可提高土壤肥力、增加地面覆盖、控制杂草生长、保持土壤温度、减少土壤侵蚀,防
风固沙,是土壤改良的重要作物[ 2]。白三叶草在世界上分布很广,在南北纬 25o~ 63o之间的广大陆地部分,
即整个亚热带、温带及亚寒带, 年降水量超过 600mm 的地区均有其自然分布, 是世界上最重要的牧草之
一[ 3]。但是 , 随着世界人口增长迅速, 可利用土地资源日益减少。开发利用面积广阔的盐碱地 , 通过生物
技术手段获得新的耐盐碱品种的工作已迫在眉睫。仅我国海岸带、滩涂就有盐碱地约 670万 hm2,如果有三
分之一被开发利用, 那将会产生巨大的经济效益、社会效益和生态效益。
利用植物转基因技术选育耐盐白三叶草无性系最大的优点就是可以克服物种间杂交的障碍, 将来自其
他生物的耐盐基因转到白三叶草中。磷脂酶是调节细胞膜透性,影响细胞渗透压平衡和细胞反应的一类酶,
根据其水解磷脂分子部位的不同可将磷脂酶分为 A、B、C、D4种,分别被不同的基因所编码[ 4~ 6]。磷脂酶 D
(PLD)是植物中广泛存在的一种酶, 它可以水解磷脂产生磷脂酸、乙酸乙酯等。近年的研究还表明, PLD不
仅可以水解磷脂,改变细胞膜的稳定性和透性,而且水解产物中的磷脂酸、胆碱和乙醇胺等还是信号分子,参
与细胞对外界环境刺激的应答过程和细胞内的信号传递,从而影响和调节细胞内一系列基因的表达[ 5, 7]。
在自然状态下 ,当植物受到逆境如病虫害、干旱、水淹、盐害、寒冷和高温等胁迫时,磷脂酶活性会在短时间
内急剧变化,使膜的透性改变,从而引起植物的应答反应或伤害[ 5, 6, 8, 9]。如果能在一定范围内抑制PLD的活
性,则有可能改变植物对逆境的反应,减少伤害。本实验室曾利用转 PLDC反义基因获得的拟南芥和烟草
收稿日期: 2004-11-08
作者简介:赵志文( 1979-) ,女(汉族) ,生物化学与分子生物学专业在读硕士
* 通讯联系人 :崔德才, E-mail : cdcai@sdau. edu. cn 电话: 0538-8242656-8308
生物技术通报
#研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 1期
所做的测定表明,转基因植株中的 PLD的活性明显受到抑制, 抗逆性有了明显改变[ 10, 11]。并且通过转 PLDC
反义基因, 选育出了耐盐性明显提高的三倍体毛白杨[ 12]。鉴于这种思考,本研究的主要目的通过转 PLDC反
义基因选育耐盐性、抗逆性明显提高的白三叶草。
1 材料与方法
1. 1 菌种和质粒
本研究所用材料为天然生长的白三叶草,采自山东农业大学校园。PLDC反义基因表达载体为 Pkylx7质
粒(其结构见图 1) , 已被转移到农杆菌菌株 EHA105之中, PLDC反义基因由花椰菜花叶病毒的 35S启动子驱
动,由美国堪萨斯州立大学王学敏博士惠赠。
图 1 pKYLX7质粒结构示意图
Ant-i PLDC:反义PLDC基因
rbs 3: 二磷酸核酮糖羧化酶小亚基E9基因 3c末端终止子 NPTÒ :新霉素磷酸转移酶基因
1. 2 方法与步骤
1. 2. 1 白三叶草无菌苗的获得 在 3~ 4月份取刚开始生长的白三叶草,沿茎基部剖开, 用解剖刀切取嫩
芽,经 70%乙醇浸泡 40~ 45秒,再用 0. 1%的升汞浸泡 4~ 5分钟后,用无菌水清洗 4~ 5遍。剥掉嫩芽外面
的几片小叶,接种嫩芽于以L2为基本培养基,附加蔗糖及不同激素配比的培养基上, 置于 25 e 的培养室中,
光照为1 500~ 2 000 lx, 12h光/暗周期, 2~ 3周后观察其生长状况,筛选出最佳的壮苗培养基(表 1)。
表 1 不同培养基对白三叶草壮苗的影响
培养基编号 PIC
(LM # L- 1)
6~ BA
(mg # L-1)
外植体数 成活幼苗数 15天后观察结果
1 0. 2 47. 3 10 0 没有成活植株
2 0. 2 94. 7 10 7 有部分植株存活,植株基部有白色愈伤
3 0. 2 107. 6 10 6 有部分植株存活,植株基部有大量白色愈伤
4 0. 25 64. 6 10 3 较少植株存活
5 0. 25 94. 7 10 10 植株健壮,叶色深,叶片厚
6 0. 3 47. 3 10 1 只有极少数芽存活,有少量愈伤组织存在
7 0. 3 64. 6 10 2 只有极少数芽存活,而且植株不够健壮
8 0. 4 47. 3 10 0 没有成活植株
9 0. 4 64. 6 10 0 没有成活植株
48 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
1. 2. 2 扩繁培养基的筛选 以MS为基本培养基,附加 2种常用的激素: KT、IBA,每种设 3个浓度梯度,设
计正交实验,共产生 9种培养基配方。将大小相近的三叶草组培苗分别转到上述9种培养基上, 在4 d、6 d、8
d、12d、24d后观察生长、分化、生根情况(表2)。
表 2 不同激素浓度对白三叶草扩繁的影响
培养基编号 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9
IBA
( mg # L-1)
0. 1 0. 2 0. 3 0. 1 0. 2 0. 3 0. 1 0. 2 0. 3
KT
( mg # L-1)
0. 6 0. 6 0. 6 0. 8 0. 8 0. 8 1. 2 1. 2 1. 2
出芽情况 不分化叶片发黄
部分植株
生 根, 长
势较慢
部分植株
死亡
部分植株
死亡叶片
发黄
全部植株
生根部分
植株分化
部分植株
生根
部分植株
分化但分
化较慢
全部植株
分化出新
芽长势好
部分植株
分化出新
芽
1. 2. 3 含 PLDC反义基因的农杆菌的活化与培养 取超低温保存的内含 PLDC基因的菌种, 按常规方法进
行培养扩增,待 OD600nm值= 0. 6~ 1. 0时,作为转基因用的菌液备用。
1. 2. 4 农杆菌介导法转基因 为了提高转化频率,笔者对常规的农杆菌介导法作了一些改进,具体做法是:
选取在壮苗培养基上生长 2~ 3周的健壮三叶草组培苗的幼芽,取其嫩芽, 放入装有用 5%蔗糖浸泡的滤纸
的培养皿中保湿。将已经培养好的农杆菌菌液用等体积的 5%蔗糖液(内含 0. 02% Silwet L-77)稀释成侵染
液。将叶片转入含侵染液的三角瓶中,不停的轻轻摇动三角瓶 5~ 8min, 将嫩芽取出,放入带滤纸的培养皿
中(滤纸用 5%蔗糖液浸润) , 置于培养室内暗箱中过夜。次日, 用无菌水冲洗 3~ 4次, 将叶片转入内有固体
扩繁培养基的 100ml三角瓶中,置于光下共培养。2~ 3天后,转入含卡那霉素( 15mg/ L)的固体叶分化培养
基上培养至新芽从苗基部上长出。待芽长到一定大小时取其鲜嫩叶片,用作分子检测的材料。
1. 2. 5 PCR鉴定
( 1)引物设计与合成 选用 PLDC基因和 35s启动子中的序列作为模板,设计合成 2个引物。
引物 1 5c-CGC TGA AAT CAC CAG TCT CT-3c
引物 2 5c-TAA CTC GTC TCA CGC ATT CC-3c
( 2)白三叶草核基因组 DNA提取 按 CTAB法提取转基因白三叶草和未转基因白三叶草基因组 DNA,同
时提取农杆菌质粒 DNA(含 PLDC基因)作为阳性对照。
(3) PCR扩增 依据5植物基因工程原理与技术6一书中的方法[ 13] ,采用 50Ll反应体系 94 e 预变性 8min
后,按 94 e 1min, 55 e 1min, 72 e 1min进行 30个循环, 72 e 后延伸 10min。检测分为转基因植株,空白对照,阴
性对照(未转基因植株)和阳性对照(质粒)。
1. 2. 6 PCR-Southern杂交检测 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。按照5分子克隆6一书中介绍的 Southern
印迹法[ 14] ,用毛细管转移法将电泳产物转移到硝酸纤维素膜上, 预杂交后加入32P 标记的 PLDC基因探针进
行杂交,然后进行放射自显影。
2 结果与分析
2. 1 白三叶草外植体消毒方法的确定
由于先前没有详细的三叶草消毒方法的资料,所以本实验先对三叶草的消毒方法进行了摸索。研究发
现70%的乙醇对外值体杀伤力较大,消毒时间应该严格控制在 40~ 45秒, 0. 1%的升汞较为温和, 杀伤力较
小,每次的消毒时间可以在4~ 5分钟之间。消毒完毕后的清洗工作十分关键, 因为未洗干净的外植体上如
果带有残留的消毒剂,这些残留物会继续对外植体起毒害作用, 使其慢慢死亡。
492005年第 1期 赵志文等:转反义磷脂酶 DC基因白三叶草的获得
2. 2 白三叶草继代及高频再生体系的建立
幼苗继代及高频再生体系的建立, 是利用农杆菌介导法基因转化的基础。结果表明,白三叶草在不同的
培养基中生长情况也不同。X5培养基上的小苗易生根, X8上的易于芽的分化, X7上的大部分植株分化出
芽,但是长势不好。当生长素与细胞分裂素浓度比大于 1B4时,诱导生根;当浓度比小于 1B6时,利于芽的分
化。
经实验表明琼脂浓度对幼苗生长影响也较大。在琼脂浓度为5. 2g # L-1的培养基上组培苗叶片小, 生长
缓慢, 但是利于生根。当琼脂浓度为 4. 8g # L- 1时, 培养基偏软, 培养容器内湿度大,植株生长快, 分化也快。
当琼脂浓度在 4. 5 g# L-1以下时,培养基呈半固体或流体状,难以支持植株在其上生长,并且植株基部会产生
大量愈伤组织团块, 植株矮小。
实验中还发现, 白三叶草喜微酸的基质, pH值较小时, 培养基稀软,苗子基部发黑; pH 值较大时, 培养基
较硬,苗子不长高,长势较慢。笔者掌握 pH 值在5. 78~ 5. 82左右。
2. 2. 1 农杆菌介导法的改良 农杆菌介导法转基因是双子叶植物转化最常用的的方法, 由于客观上某些未
知因素的存在使转化频率一直不能令人满意,且随着植物种类的不同转化频率差别明显。为了保证有较高
的转化频率,笔者对传统的转化方法进行了改良和优化。主要做法是: ( 1)当含有目的基因的农杆菌达到对
数生长期时,采用 5%蔗糖附加一定浓度的表面活性剂来稀释菌液, 这样即增加了侵染液中蔗糖的浓度。过
去的报道指出, 当用农杆菌侵染时, 在侵染液中附加一定量的乙酰丁香酮等物质可提高转化率,本研究在侵
染液中附加一定量的蔗糖,可能既可以调节渗透压又可起到与乙酰丁香酮等相同的作用,比只用液体培养基
稀释菌液转化率更高些。( 2)常规的侵染方法是将植物材料在农杆菌侵染液中浸泡几分钟至几十分钟, 冲洗
干净,然后接种到无抗生素的培养基上共培养,本研究则是将农杆菌侵染后的叶片不经冲洗而直接转到预先
用5%蔗糖溶液浸湿的滤纸上过夜,这样既延长了农杆菌侵染时间又不致因叶片在菌液中浸泡时间过长而
坏死,使之有了更多的基因转移的机会。实验证明,转基因频率有了明显提高。
2. 2. 2 选择压的确定 由于所构建的表达载体携带有新霉素磷酸转移酶基因,因此以 Km为筛选试剂选择
转化细胞。为了确定白叶草对Km的本底抗性,将生长一致的未转基因试管苗分别接种于Km为0, 5, 10, 15,
20mg/ L的继代培养基上, 2周后观察其生长状况,见表 3。据此选择 15mg/ L Km作为选择压。
表 3 卡那霉素浓度对白三叶草芽再生的影响
Kan浓度(mg/ L) 叶片生长情况 芽再生率( % )
5 大部分植株分化出新的小芽,叶色深绿,长势较好 80
10 部分植株分化出新的小芽,长势缓慢 41. 1
15 极少数植株分化出小芽,叶片发黄,长势不好 11. 7
20 几乎所有植株叶片发黄,逐渐死亡 0
2. 3 转基因植株的分子生物学鉴定
取经抗生素初步筛选的转化苗的叶片用作核基因组总 DNA,进行 PCR分析,结果表明,阴性对照和空白
对照都没有PLDC反义基因特异的扩增条带,而转基因植株含有 PLDC反义基因特异的430bp扩增条带, 在经
抗生素筛选的 4转基因植株中, 3个呈PCR阳性(图 2)。对 PCR阳性植株再进行 PCR-Southern杂交检测,在
检测过的 3个转基因植株中,全部呈阳性(图 3)。
上述结果表明 PLDC反义基因已整合到转化植株的基因组中。
3 讨论
磷脂酶对细胞膜的稳定性、膜的生理功能,以及信号传递均具有重要作用, 这已是一种共识,但它在植物
抗性方面的作用还报道尚少。笔者利用转反义磷脂酶 D基因,选育耐盐白三叶草新种质是基于在毛白杨上
50 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2005年第 1期
图 2 转反义 PLDC基因 PCR检测
1为 DNA Marker DL2000, 2为阳性对照(质粒DNA) , 3为阴性
对照(非转化植株) , 8为空白对照, 其余为转化植株, 其中 3
个有与质粒相同的大约 430bp的特异带。
的初步实验结果而确定的。虽然现在还不能从理论上完全
解释为什么转反义磷脂酶 D基因可以提高白三叶草的耐盐
性 ,但在拟南芥和杨树上都获得了同样的结果。因此初步
认为这可能是反义基因改变了磷脂酶的活性,影响到质膜的
透性,同时也影响到信号传递, 进而影响到与耐盐有关的基
因的表达。这种推论是否正确, 还有待于进一步实验来证
实。
白三叶草是多年生草本植物,因此需要对转基因组培苗
进行扩繁,然后移栽,用于大田抗逆性实验。因为基因的表
达受到多方面的调控, 在幼苗期表现出抗性者在成年期未必
就一定抗盐碱, 在幼苗期抗性不明显者在成年期也可能抗盐
碱,所以关于转基因植株的田间抗盐碱性问题,还需要经过
图 3 转反义 PLDC基因 PCR-Southern 检测
5.阳性对照(质粒 DNA) , 4.阴性对照(未转化植株 ) , 1, 2, 3为转
化植株
多年的观察才能下结论。
本实验室曾通过转 PLDC反义基因, 选育出了耐盐性
明显提高的三倍体毛白杨。可以将转基因白三叶草与其
一起种植,一方面可以充分利用土地, 另一方面也可以进
一步研究白三叶草的生草效应。看看其能否起到提高土
壤肥力,改善小气候,抑制杂草生长,保持土壤水分,降低
盐碱的危害等作用。从而改善抗盐三倍体毛白杨的营养
状况,增加木材的产量, 实现更加有效、经济的改善盐碱
地。
参 考 文 献
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512005年第 1期 赵志文等:转反义磷脂酶 DC基因白三叶草的获得