全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2006年第3期
1 前言
生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸(DNA
和 RNA)以及多糖等。生命科学的发展给生物大分
子分离技术提出了新的要求。各种生化、分子研究
都要求得到纯的,以及结构和活性完整的生物大分
子样品,这就使得其分离技术在各项研究中起着举
足轻重的作用。对生物大分子分离技术的研究和开
发也就应运而生。而且随着各学科之间的交叉渗
透,材料化学、自动化技术等学科的发展也为生物
大分子分离技术的发展提供了更多的契机。
生物大分子的制备具有如下主要特点:生物材
料的组成极其复杂;许多生物大分子在生物材料中
的含量极微,分离纯化的步骤繁多,流程长;许多生
物大分子一旦离开了生物体内的环境就极易失活
(因此分离过程中如何防止其失活,就是生物大分
子提取制备最困难之处);生物大分子的制备几乎
都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各
种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估
计和判断[1]。这些都要求生物大分子的分离技术以
此为依据,突破这些难点,优化分离程序,以获得符
合要求的生物大分子样品。
2 传统分离方法
常用的传统生物大分子分离方法有沉淀、透
析、超滤和溶剂萃取等。它们都是一些较早就建立
起来的分离方法,至今仍然被广泛应用。
如在蛋白质领域,应用盐析法使蛋白质沉淀出
来已有 80多年的历史。其突出的优点是成本低,不
需要特别昂贵的设备;操作简单、安全;对许多生物
生物大分子分离技术:过去、现状和未来
李洁 何德
(西南林学院资源学院,昆明 650224)
摘 要: 生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸(DNA和RNA)以及多糖等。生物大分子分离技术是生命科学研
究中的关键技术之一。当前,各学科之间的交叉渗透为生物大分子分离技术的发展提供了更多的契机。对以沉淀、透析、超
滤和溶剂萃取为代表的传统分离技术,以及色谱,电泳等现代分离技术的发展概况、原理、特点及应用进行了综述。并结合
生命科学的发展现状,展望了生物大分子分离技术的发展前景。
关键词: 生物大分子 传统分离方法 现代分离方法 发展状况 前景
TheTechniquesofBiomacromoleculeSeparation:Past,NowandFuture
LIJie HeDe
(FacultyofResources,SouthwestForestryColege,Kunming650224)
Abstract: Biomacromolecule include polypeptide,enzyme,protein,nucleic acid (DNA and RNA)and
polysaccharideetc.Thetechniquesofbiomacromoleculeseparationiscrucialinlifescience.Crosinfluencesamongmany
subjectspromotethedevelopmentofthetechniquesofbiomacromoleculeseparation.Inthispaper,theprogres,theories,
featuresandapplicationsofthetraditionalseparation techniques (such assedimentation,dialysis,ultrafiltration and
extraction)andthemodernseparationtechniques (suchaschromatographyandelectrophoresis)weresummarized.Atthe
sametime,accordingto thestatusquo ofthedevelopmentoflifescience,theprospectofthetechniquesof
biomacromoleculeseparationwasviewed.
Keywords: Biomacromolecule Traditionalseparationtechniques Modernseparationtechniques Statusquoof
developmentProspect
收稿日期:2005-12-23
基金项目:本工作得到云南省级重点建设专业林学专业资助
作者简介:李洁(1983-),女,在读硕士
通讯作者:何德(1970-),男,博士,副教授,E-mail:heolexiner@yahoo.com.cn
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
活性物质具有稳定作用[2]。该法虽然分辨能力不高,
但在粗级分离中仍然被经常采用。有机溶剂沉淀法
也是较早使用的沉淀方法之一。有机溶剂对于许多
蛋白质、核酸、多糖和小分子生化物质都能产生沉
淀作用。其引起沉淀的主要原因在于改变介质的介
电常数,以及类似盐析的争夺水化水现象[3]。等电点
沉淀法利用具有不同等电点的两性电解质,在达到
电中性时溶解度最低,易发生沉淀,从而实现分离
的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解
质,可以利用此法进行初步的沉淀分离,此法主要
用于在分离纯化流程中去除杂蛋白[2],而不用于沉
淀目的物。非离子型多聚物是 20世纪 60年代发展
起来的一类重要的沉淀剂,它们具有很强的亲水性
和较大的溶解度,在溶液中可通过空间位置排斥作
用使生物大分子、病毒和细菌等聚集沉淀[1]。该法温
和的操作条件和较高的沉淀效能,使得其经常被用
于细菌、病毒、核酸和蛋白质的分离,其中应用最多
的多聚物是聚乙二醇[4,5]。
自 ThomasGraham 1861年发明透析方法至今
已有 140多年,透析已成为生物化学实验中最简便
最常用的分离纯化技术之一,在生物大分子的制备
过程中,除盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓
缩样品等都要用到透析的技术,同时半透膜的材料
也更加多样化、透析方式也更加丰富。
超滤是一种加压膜分离技术,自 20世纪 20年
代问世后,直至 60年代以来其发展迅速,很快由实
验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作
技术[6]。超滤作为一种高效分离技术,广泛用于含有
各种小分子溶质的各种生物大分子的脱盐、浓缩和
分级分离。
溶剂萃取法(是用一种溶剂将产物自另一种溶剂
(如水)中提取出来,以达到浓缩和提纯的目的)是20
世纪40年代兴起的一项化工分离技术,并很快应用
到了生物分子的提取和分离上。最初是用于抗生素、
有机酸、维生素等生物小分子的提取。最近几十年来
随着与其它技术的结合而产生了一系列新的分离技
术,如逆胶束萃取、超临界萃取、液膜萃取等,可以用
于生物大分子如核酸、蛋白质、多肽等的提取和精制。
3 现代分离方法
3.1 色谱方法
1903年俄国植物学家 Tswet,在一填有碳酸钙
的玻璃柱中注入用石油醚萃取的植物色素,在室温
下展层,得到不同的色素区带,后来称之为色谱[7]。
色谱分离又称层析。最初,层析技术并未得到关注。
20世纪 50年代,气液层析得到发展,并在石油、化
工、制药等领域得到应用。到 60年代,由于开发出
适用于生物物质分离纯化的层析固定相,层析技术
才被用于生物物质的分离纯化并得到迅速发展[8]。至
今,已有丰富的色谱技术被用于生物大分子的分离。
液相色谱法是分析化学中发展最快,应用最广
的分析方法,它在许多领域成为必不可少的手段,
其中高效液相色谱 (highperformanceliquidchro-
matography,HPLC)更是以其独特的优点占据突出
地位。HPLC用于生物化学样品分析始于 20世纪 70
年代中期,80年代针对生命科学领域分离和制备而
设计的生物色谱填料为 HPLC在生命科学研究领域
的地位奠定了坚实的基础;90年代,随着生物医药
研究与开发的迅速发展,各种类型的高通量及手性
色谱柱纷纷出现[9]。HPLC是目前最通用、最有力和
最多能的层析形式,在生物大分子的分离分析中,
HPLC分离模式主要有反相色谱 (reversed-phase
chromatography,RPC),空间排阻色谱(stericexclu-
sionchromatography,SEC),离子交换色谱(ion-ex-
changechromatography,IEC),疏水作用色谱(hy-
drophobicinteractionchromatography,HIC),亲和色
谱(afinitychromatography,AC)等。反相液相色谱柱
效高、分离能力强、重复性好、操作简便、保留机理
清楚,是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一
种。它与多数其它形式的层析不同之处在于固定相
基本上是惰性的,固定相与被分离物之间只可能有
疏水作用。它吸引人的地方在于流动相的小小变
化,例如加入盐,改变 pH或有机溶剂的量就能成功
地影响分离特性[3]。它在 20世纪 50年代就已用于
许多有机小分子的分离和分析,80年代后逐步应用
于生物大分子如蛋白质、多肽、核酸的鉴定,并用于
制备规模的分离[10]。半个世纪前,随着交联聚苯乙
烯的出现和发展,离子交换色谱成为一种重要的分
离工具。离子交换色谱的填料及含盐的缓冲流动相
系统类似于蛋白质稳定存在的生理条件,有利于保
持生物分子的活性和构象。因此,它在解决生物学
中许多难于分离的问题上起到了重大作用[9]。随着
HPLC的飞速发展,以及各种新型离子交换材料的
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出现,离子交换色谱在氨基酸、蛋白质、核酸、有机
酸、糖类及药物等方面的应用越来越广[11]。空间排
阻色谱所用的固定相是具有一定孔径范围的多孔
性物质凝胶,是按溶质分子大小进行分离的色谱技
术,又称尺寸排阻色谱或凝胶色谱。按流动相类型
不同分为凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱。十多年来
该法在凝胶制备,仪器技术性能,数据处理和理论
研究上取得的进展,促进了该技术在许多领域的应
用。亲和层析是 60年代发展起来的一种高效、快速
的分离纯化技术[8]。它是一种利用生物大分子能够
通过范德华力、疏水力、空间和静电相互作用,与配
体特异、可逆地结合在一起的生物学特性, 从复杂
的生物样品中分离得到目标产物的液相色谱技术
[12]。亲和层析容量大,选择性强,分离效率高,且对
目标产物的生物活性起到一定的保护作用,最先被
用于酶的纯化,现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免
疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整细胞的纯化[3]。
科学的发展使得分离分析的对象越来越复杂,
从而提高了对分离分析技术的要求,促进了各种新
技术的发展。二维液相分离方法,二维液相分离/质
谱分析方法等多种自动化二维系统均得到了开发
利用,如 Lundel和 Markides[13]采用离子交换和反相
色谱二维液相模式分离了复杂生物样品中的肽;
Bushey和 Jorgenson[14]设计了用阳离子交换和体积
排除分离模式的自动化二维系统等。HPLC与光谱
或波谱技术的在线联用也成为了解决复杂样品体
系的有力手段[15]。目前最常用最有效的是高效液相
色谱-质谱(massspectroscopy,MS)联用技术,高效
液相色谱-核磁共振 (nuclearmagneticresonance
spectroscopy,NMR)等也在研究开发中。与此同时,
快速分离技术也得到了迅猛发展,在 20世纪 70和
80年代需要 1h分离的样品现在可能只要几分钟甚
至几秒钟即可完成,有关快速 HPLC及其应用也多
有报道,如 Unger等[16]最早采用缓冲溶液盐浓度梯
度,以 4mL/min流速在 2.5min内分离了 8种蛋白
质。
近年来,随着生物技术和医药工业的发展,传
统的分离手段已经不能满足对大量样品高纯度分
离的要求,液相制备色谱的发展研究为解决实际应
用中出现的问题带来希望。20世纪 70年代初开发
出的模拟移动床色谱具备分离能力强,设备体积小,
投资成本低,便于实现自动控制并特别有利于分离
热敏性及难以分离的物系等优点,在制备色谱技术
中最适含用于进行连续性大规模工业化生产,其应
用范围也不断扩大,已出现采用该技术分离氨基
酸、单克隆抗体和蛋白质的研究[17]。
超临界流体色谱(supercriticalfluidchromatog-
raphy,SFC)是以超临界流体(supercriticalfluid,SF)
作为流动相的一种新颖的色谱技术,具有分析速度
快、选择性好、分离效率高、分析条件温和等优点,可
分析气相色谱不宜分析的高沸点、高分子量、低挥
发性和热不稳定试样,又比高效液相色谱有更快的
分析速度和更高的柱效 [18]。自 60年代起逐渐出现
一些有关该技术的研究报道。超临界流体色谱应用
领域十分广泛,可用于分离分析热敏性物质、非挥
发性高分子、生物大分子、极性物质和手性对映体
等。目前,SFC与 MS、FT-IR(fouriertransform in-
fraredspectrometer,傅里叶变换红外光谱仪)、NMR
等联用技术也逐渐得到开发。
3.2 电泳技术及其它
电泳现象于 1808年被发现,在 1937年由瑞典
科学家 TiseliusA 首次将其作为一种分离技术所
应用[19]。随着电泳支持物的改进,电泳条件的完善,
区带电泳、等电聚焦电泳、双向电泳等技术逐渐建
立起来。同时,在电泳模式上也有了极大的发展,先
后出现了圆盘电泳、垂直板电泳、脉冲电泳等,电泳
分辨率也随之得到提高。
1956年 Smithies和 Poulik[20]最早引入双向电泳
技术,他们将纸电泳和淀粉凝胶电泳结合起来分离
血清蛋白,随后双向电泳技术得到很快的发展。目
前所应用的双向电泳体系由 O’Farel等于 1975年
发明[21],第一向为等电聚焦电泳,第二向为变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳。这是目前唯一能将数千种蛋白
质同时分离与展示的分离技术。该技术的应用与发
展对开展“蛋白质组”的研究具有重要意义。同时,
针对双向电泳技术的某些缺陷,相应的改进技术也
得以应用,如窄范围 pH胶条的使用[22],胶上差示电
泳(diferentialin-gelelectrophoresis,DIGE)技术[23]。
然而,由于蛋白质二维凝胶分离、染色体转移等环
节操作困难,且十分费时,已被公认为是蛋白质组
研究的技术“瓶颈”。因此,发展快速、高效、高通量、
在线的分离监督方法已成为蛋白质组学研究的重
李洁等:生物大分子分离技术:过去、现状和未来 51
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
大科学问题之一。谁率先取得突破,谁将占据蛋白
质组学研究的有利地位。
毛细管电泳(capilaryelectrophoresis,CE)是 20
世纪 80年代初期迅速发展起来的一种新型分离分
析技术,是经典电泳技术和现代微柱分离有机结合
的产物。与传统的分离方法相比,CE具有分离效率
高、分析速度快、样品及试剂用量少等特点,使其成
为极为有效的分离技术,广泛应用于分离蛋白质、
糖类、核酸等多种物质[24]。目前,不同分离模式的毛
细管电泳技术已成为最重要的生物样品分离分析
手段,如毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛
细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管等电聚焦
等。近来,许多有关多维毛细管电泳分离技术的设
想已被提出,有些还得到了初步的尝试,其分离的
优势也得到人们的关注[9]。
毛细管电色谱 (capilaryelectrochromatography,
CEC)是利用电渗流或电渗流结合压力来推动流动
相移动的一种液相色谱分离法[25]。它集 CE和 HPLC
的优势与一身,既有 CE水平的高柱效,同时还具有
HPLC的高选择性。近年来其应用已引起广泛关注。
目前,毛细管电色谱的研究主要侧重于方法本身的
完善和发展,以及与质谱等定性分析技术联用的研
究开发[26]。
微流控芯片于 20世纪 90年代初由瑞士的
Manz和 Widmer提出[27],它是通过微细加工技术将
微通道、微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件
窗口和连接器等功能元件像集成电路一样,使它们
集成在芯片材料上的微全分析系统[28]。近 10年来,
随着微制造技术和电子技术的不断进步,微流控芯
片得到了迅速的发展,并成为生物样品分离分析的
重要手段和研究热点,先后出现了毛细管电泳芯
片、毛细管电色谱芯片、样品制备和分离的集成系
统等。
4 展望
生命科学的发展决定了追求高效、快速、高通
量、集成化的生物样品分离分析方法必将成为未来
的发展方向。分子生物学中一个众所周知的事实是
蛋白质生物活性和功能多是在溶液中显现的,因此
液相色谱的强大功能使得其在生命科学及其它领
域的重要地位不会动摇,面对复杂体系的分离任
务,它仍在不断完善发展。芯片系统将不断发展建
立更多的实用体系,开发更广泛的应用价值。多通
道毛细管电色谱仪器也将被开发。对超临界流体性
质的认识深入,将推动超临界流体色谱技术的发展
和应用。各种分离模式相结合构成的多维分离方法
也将得到进一步的研究开发,以实现将一根色谱柱
上未分开的组分在另一根柱上用不同的分离原理
加以完全分离。各种分离设备将与光谱、波谱这类
提供结构信息的仪器进行在线连接,建立起更多的
联用方式,以实现分离,定性定量分析一体化。
随着生物技术成果的不断积累和生物技术产
业化进程的不断推进,生物制品的分离与纯化技术
已成为实现生物高技术产业化的关键,在理论和技
术研究上都得到了长足的发展。发展层析柱和凝胶
过滤柱的放大技术,大规模分离过程的自动控制,
下游工程的集成优化技术等成为工业化生产中的
关键[29]。液相色谱是工业生产上常用的有效方法,
而模拟移动床色谱和径向色谱等将在生物工程领
域发挥越来越重要的作用。在研究和完善一些适用
于生化工程的新型分离技术的同时,进行各种分离
技术的高效集成化,可以达到提高产品收率、降低
过程能耗和增加生产效益的目标。
在这个各学科快速发展,并相互影响的时代,
生物大分子分离技术必将不断的推陈出新,以更加
方便、高效、快捷的方式应用于科研和生产领域。
参 考 文 献
1 陈毓荃.生物化学试验方法和技术.北京:科学出版社,2002,46~
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2 苏拔贤.生物化学制备技术.北京:科学出版社,1986,51~52.
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27 ManzA,GraberN,WidmerHM.SensActuatorsB,1990,B1:
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28 丛辉,王惠民,王跃国.现代检验医学杂志,2005,20(1):88~
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29 徐炎华,欧阳平凯,韦萍.江苏化工,1996,24(3):4~7.
李洁等:生物大分子分离技术:过去、现状和未来
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
肿瘤干细胞的研究进展
中国医学科学院昆明医学生物研究所研究生瞿素在胡云章导师指导下,论述了肿瘤干细胞的研究进展。他们
认为肿瘤是危害人类健康的重大疾病,论其起源有去分化起源和干细胞起源,但大多数倾向于干细胞起源的观
点。因肿瘤细胞能从血液系统恶性肿瘤中分离,也能从乳腺癌实体瘤干细胞中分离。当前可针对细胞特异表面标
记,可以靶向消灭肿瘤干细胞而治疗肿瘤疾病。
有人证实只有部分肿瘤细胞具有致癌性,有人提示肿瘤是通过干细胞的增殖及其分化成组织特异的细胞类
型;有人认为恶性肿瘤的产生发展是干细胞的分化受阻,而不是成熟细胞去分化。恶性肿瘤发生于干细胞或祖细
胞,因它们存活时间长,如皮肤癌通常发生在生命早期,癌变的靶标是表皮干细胞,其癌变靶标来自特定组织肿瘤
表达与胚胎或其他干细胞相关的蛋白。参与干细胞自我更新,多能性维持的信号通路也参与造血系统、结构及乳
腺的癌变,此通路有Notch、Wnt和Sonic hedgehog(shh)通路,Wnt信号通路的下路效应物β-连环蛋白的表达与表
皮干细胞的增殖潜力呈正相关,与表达组成活性的β-连环蛋白的逆转录病毒载体转染表皮干细胞,导致干细胞自
我更新能力增强,而其分化则下调。在表皮干细胞中具有活化的Wnt信号通路的转基因小鼠会发展成表皮癌,这
就是Wnt通路失常所致。与胚胎干细胞或生殖细胞相关的抗原这与睾丸癌,恶性黑素瘤和肺癌相关。有人说卵圆
细胞产生肝癌,因卵圆细胞是肝脏中的一类干细胞。有人用了一组与胆管细胞、卵圆细胞、胎儿成体肝细胞、肝癌
细胞相关的抗原特异性单克隆抗体来分析化学致癌过程中的卵圆细胞、癌前灶、早期肿瘤结节与晚期肝癌之间的
表型关系,发现这三者及原生肝癌细胞都表达卵圆细胞和肝细胞抗原,说明卵圆细胞和肿瘤是前体与产物的关
系。
利用特异的表面标记,从原生癌分离到干细胞,经稀释后移植到没有免疫能力的动物体内,其干细胞仍能形
成癌。白血病由造血干细胞引起恶性肿瘤,是因为白血病特定的染色体易位、缺失、扩增或侧位都发生在造血干细
胞(HSC)阶段。它能形成白血病的细胞具有造血干细胞相似的表型,都表达CD34+CD38-。从乳腺癌分离出干细胞,
推动了实体癌的研究。
肿瘤干细胞分离具有重要的临床意义。干细胞的一定的机制,通过抗凋亡Bclz家族蛋白的高表达,膜转运蛋
白的高表达抵抗化疗。此为当前治疗中容易产生的抗药细胞。通过鉴定肿瘤干细胞的表面标记,可更有效诊断出
恶性生长细胞的存在,通过表面标记纯化肿瘤干细胞,可研究分化基因的表达模式和蛋白表达模式,找到肿瘤发
生过程中必需的功能蛋白,把它作为新药物靶标来治疗肿瘤,还可进行体外功能检测,测试不同药物对肿瘤的作
用,预期药物敏感性和药物的抗性。 秦春圃
·信息交流·
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