全 文 ： 生物技术通报
# 研究报告# BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
草地早熟禾悬浮体系的建立及悬浮过程中细胞形态观察
方文娟 韩烈保 张振环 曾会明
(北京林业大学草坪研究所;北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室,北京 100083)
摘 要: 对早熟禾( Mardona)成熟种子灭菌后,接种于 MS2+ BA0. 1诱导培养基, 26 e ,全黑暗培养诱导胚性
愈伤,挑选其中松散的颗粒状胚性愈伤悬浮于 MS2+ BA0. 1液体培养基中 ,在 90~ 110r/ min, 26 e 黑暗培养下, 悬
浮培养 2 个月,建立悬浮体系。在悬浮培养过程中, 对细胞形态进行显微观察, 发现悬浮培养前期, 细胞多为条状、
棒状,且大小不一。培养 20 天后,悬浮培养物开始增殖, 2个月后 ,悬浮体系建立, 细胞大小均匀,颜色嫩白。
关键词: 草地早熟禾 悬浮体系 显微观察
Establishment of Suspension Cell lines and Observation of Cell
Conformation During Suspending Process in Poa p ratensis
Fang Wenjuan Han Liebao Zhang Zhenhuan Zeng Huim ing
( T ur f g rass I nsti tu te of Be ij ing F or estr y Univ er sit y , The K ey L abor atory f or
S i l v icu lture and Con se rvat ion of M ini st ry of E du cation, Bei j ing Forest ry Unive rsi ty , Bei j ing 100083)
Abstract: Sterilized matur e seeds of P oa p ratensis ( M ardona) wer e cultured fo r embryogenic callus induction
on MS2+ BA0. 1 solid medium. , 26 e , full darkness. I ncompact, g raininess callus w ere selected and cult ur ed on MS2
+ BA0. 1 liquid medium. , 90~ 110r/ min, 26 e , full darkness. A fter t wo months, cell suspension culture lines were
established. Dur ing suspension pro cess, take stock of cell fo rms of differ ent times under micro scope. During pr o-
phase, cell forms ar e str ip、stick and dif fer ent sizes. A fter 20 days, suspension cultur e lines beg in to pro lifer ate, two
months, suspension culture lines are established, their sizes were similar , their colors w ere fr esh and tender .
Key words: Poa p ratensis Suspension cultur e lines Microobserv e
草地早熟禾 Poa p r atensi s 是禾本科早熟禾属的一种优质冷季型草坪草,在城市绿化, 运动场建设和高
速公路绿化等方面广泛应用。草地早熟禾为兼性无融合生殖方式, 这给常规育种带来很大的困难[ 1] 。近年
来,在传统育种的基础上,采用现代生物技术,如基因工程已广泛应用于草地早熟禾育种中。建立高效的再
生体系是育种专家一直在追求的目标。在愈伤组织诱导过程中, 按其培养方式可分为液体悬浮培养和固体
培养两种。固体培养方式应用非常普遍,几乎所有材料均可在固体培养基中培养。液体悬浮培养是诱导体
细胞胚胎发生并增加体细胞数量的有效方法。液体悬浮培养不仅可以缩短培养时间, 还可增加每克愈伤组
织的胚胎发生数,如与细胞同步化、细胞快速冷冻技术相结合,为基因工程育种提供广阔平台。
1 材料与方法
1. 1 外植体的选择
外植体的选择是快速建立悬浮体系的关键因素之一。草地早熟禾可以用胚根、胚轴、幼穗、匍匐茎、茎尖
分生组织、花粉、种子为外植体。其中幼穗的胚性愈伤率在报道中最高, 但其取材受季节限制。为较高的出
愈率和取材方便,本实验采用成熟种子为外植体。
收稿日期: 2005-10-30
基金项目:国家植物转基因专项( J2002- B-006)和国家 863计划( 2001AA244082、2004AA244080)
作者简介:方文娟( 1980- ) ,女,山东潍坊人,在读硕士研究生,研究方向:草坪草育种, f angw enju an0224@ 163. com
通讯作者:韩烈保教授,博士生导师, han1b@ publ ic. bta. n et . cn. 010-62337982
1. 2 外植体消毒
成熟种子置于次氯酸钠原液(有效氯不小于 9% )消毒 50~ 60min,用无菌水冲洗,再磁力去皮。
1. 3 适合悬浮培养的愈伤组织的诱导与改良
消毒处理过的种子接种于诱导培养基 MS2+ BA0. 1, 26 e ,黑暗培养, 20~ 40天继代一次, 培养三个月
左右,诱导出的愈伤组织可分为三类,Ⅰ为质地坚硬、块状、颜色淡黄的胚性愈伤组织, 即通常所说的胚性愈
伤组织(图 1)。Ⅱ为质地疏松、易分散、不分泌黏液的颗粒状胚性愈伤组织(图 2)。Ⅲ为柔软、水渍、形状不
规则、颜色淡白的非胚性愈伤组织(图 3)。挑选其中的Ⅱ型愈伤作为悬浮材料。[ 2] 在愈伤改良过程中, 在培
养基中添加 NH 4NO 3 ,使高水平的氮素营养有利于形成生长迅速, 松脆的Ⅱ型愈伤组织 [ 3]。在培养基中加
入一定浓度的 NaCl可筛选出生活力强、分裂旺盛的愈伤组织[ 4]。也可采用缩短继代周期的方法,快速获得
Ⅱ型愈伤组织[ 5] 。
1. 4 悬浮体系的建立
将挑选的Ⅱ型悬浮培养于 MS2+ BA0. 1液体培养基中, 90~ 110r/ min, 28 e 黑暗培养下, 进行悬浮震荡
培养。悬浮培养初期,每 3~ 4天继代一次,继代时条件培养基与新鲜培养基的比例为 1B 3。悬浮体系建立
后,根据初始接种量确定培养周期。
1. 5 显微观察
将悬浮体系 120目过筛处理后培养 2~ 3天, 在显微镜下观察其细胞形态与细胞团中细胞数目。
1. 6 数据统计
出愈率%= (愈伤数/外植体数) @ 100% ;
胚性愈伤率%= (胚性愈伤数/外植体数) @ 100% ;
2 结果与分析
2. 1 适合悬浮培养的愈伤组织的诱导
接种于 MS2+ BA0. 1的成熟种子,出愈率为 78. 23%。在初期诱导出的愈伤,多为Ⅰ型和Ⅲ型, Ⅰ型愈
伤诱导率为 30. 07%。愈伤继代周期一般为 20~ 40天, 为获得Ⅱ型愈伤,缩短继代周期,每 20天左右继代
一次,继代过程中尽量挑选Ⅱ型愈伤,改良Ⅰ型愈伤, 弃除Ⅲ型愈伤。继代时将愈伤尽量夹碎。待培养的Ⅱ
型愈伤增殖到一定量后, 进行悬浮。
2. 2 悬浮体系的建立
将 3~ 8gⅡ型愈伤接种于 250ml锥形瓶中( 30~ 80g / L ) ,置于悬浮震荡摇床, 90~ 110 r/ min, 黑暗培养。
初期, 3~ 4天继代一次,培养初期,瓶壁上有残留物, 为非胚性愈伤及细胞碎片。两周左右,悬浮物中逐渐有
大量细胞散出, 。三周左右,散出的细胞聚集,形成小块的新鲜愈伤。但此时细胞大小不一,形状各异,多为
畸行(条状、棒状)。随着培养时间的延长,圆形细胞逐渐增多,细胞内含物越来越丰富,细胞壁在培养后期变
厚。悬浮培养液逐渐变清,瓶壁上残留物减少, 培养 2个月,体系建立(图 8)。培养物颜色淡黄, 大小均一,
生长较快。有的悬浮系在悬浮过程中一直未见增殖,没有细胞散出, 两周之后, 褐化,不适合悬浮, 弃掉。
2. 3 显微观察
悬浮培养物经 120目筛子过筛, 培养 2~ 3 天后, 用移液枪吸取置于载玻片上,在显微镜下观察(目镜
180,物镜 40) ,发现液体中悬浮着不同大小的细胞团,每团的细胞数目为 1~ 15个之间,细胞形状不一, 管状
的、肾形的、圆球形等。培养前期, 多为长形细胞, 细胞壁厚,大液泡, 细胞是空的。随着继代的延长, 圆形细
胞逐渐增多,但长细胞仍占多数。细胞内含物逐渐增多。悬浮体系建立后,细胞大小均一、细胞质浓厚、多为
圆形或椭圆形(图 4~ 7)。
3 讨论
在悬浮体系过程中发现, 早熟禾初期诱导的愈伤多为致密型的Ⅰ型愈伤,颜色较白。这种愈伤在悬浮培
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养过程中很长时间难以建立悬浮体系, 需要通过调整继代培养基来对愈伤组织进行改良,以获得易于悬浮的
松脆愈伤组织。本实验采用缩短继代周期的方法,可以加速愈伤生长,快速获得松散的颗粒状Ⅱ型愈伤。在
悬浮培养中,如果只有长细胞散出这个阶段, 没有致密小细胞团出现,这样建立起来的悬浮系往往颗粒大小
不够均一。此时缩短继代周期比较有效。培养初期有细胞散出是建立悬浮体系的良好征兆。超过 2周没有
细胞散出,或 3~ 4周后没有致密小细胞团,说明建立优质胚性悬浮体系的几率不大。另外建立优质悬浮体
系的关键因素之一是合适的继代周期和转速,植物细胞的细胞壁主要由纤维素组成,这些使得植物细胞对剪
切力的敏感性要高于微生物。一般转速控制在 90~ 120r/ min [ 6]。悬浮体系建立初期, 要 3~ 4天继代一次,
每次继代时条件培养基与新鲜培养基比例为 1B 3,因为经过短时间细胞培养的条件培养基具有促进细胞分
裂的功效。悬浮体系建立后, 根据接种密度确定继代周期。接种量较少时, 继代周期课适当延长, 接种量超
过 100g/ L ,继代周期应小于 4天。培养时间过长,悬浮培养物变褐、死亡。
参 考 文 献
1 H anna WW. Bashaw EC. C rop Scien ce, 1987, ( 27) : 113~ 119.
2 袁力勇,李绍清.云南大学学报, 2003, 25( 4) : 373~ 376.
3 王海波,方仁,王培,等.作物杂志, 1989: 3~ 26.
4 孙世孟,赛吉庆,谢友菊.作物学报, 1994, 20( 2) : 168.
5 余瞬武,朱永生,等.华中农业大学学报, 2001, 20( 4) : 325~ 328.
6 Wa-i Leng, Lee, La-i Keng, Ch an. T issue an d Organ Cu lture, 0167-6857; 200408, 78( 2) : 101~ 106.
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