全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第3期
聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 (Two-Dimensional
Electrophoresis,2-DE)是由 O’Farel于 1975年建立
的[1]。经过 30年的发展,目前双向电泳技术已被广
泛应用于生物、医学和农业等领域的研究。目前一
般可以在一块凝胶上分辨出 1800多个蛋白质点
(spot),能同时分析成百上千的基因表达产物,非常
适于平行分析大量的蛋白质系。因此成为目前蛋白
质组研究中最重要的分离手段及支撑技术之一。双
向电泳一般包括样品制备、等电聚焦(Isoelectric
Focusing,IEF)、SDS-聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 电 泳 (SDS-
PAGE)、染色和图像扫描及图像处理分析、蛋白鉴
定等步骤。
1 样品制备
双向电泳成功的关键在于建立一套有效的、可
重复的样品制备方法[2]。样品制备的影响因素包括
蛋白质的溶解性、分子量、电荷数及等电点等。对于
不同的样品性质及研究目的,其方法也不尽相同。
不同的样品性质,可选择具有单一增溶作用的溶
液,也可用含多种离液剂(ChaotropicAgents)、去垢
剂(Detergents)、和还原剂的复杂混合液。同时还可
以通过样品制备方法来从蛋白质混合物中富集各
种亚组分。用于样品处理的缓冲液必须在低离子强
度的基础上,既能保持蛋白质的天然电荷,又能维
持其溶解性。因此,绝大多数样品往往都需要通过
多次实验才能摸索到最适宜的条件。
1.1 样品的溶解
蛋白样品的有效溶解是双向电泳成功分离蛋
白质的最关键因素之一。样品溶解要达到的目标
是:1)样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体
完全破坏,成为各个多肽的溶解液;2)溶解方法必
须去除可能干扰 2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸
等物质;3)溶解方法要保证样品在电泳过程中继续
保持溶解状态。
尽管利用离液剂、去垢剂、两性电解质、缓冲
液、还原剂等化合物,可以使样品中的蛋白质溶解,
但并非所有化合物在化学和电荷等方面都能满足
IPG胶条和等电聚焦技术(IEF)要求。用于等电聚焦
的化合物不能增加溶液中的离子强度,如果用一些
双向凝胶电泳的实验操作及进展
叶妙水 钟克亚 胡新文 郭建春
(中国热带农业科学院 热带生物技术研究所,海口 571101)
摘 要: 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是研究蛋白质组的核心技术,本文重点介绍了双向凝胶电泳的原理、实验操作过
程中的具体步骤以及近年来在实验过程中发展的一些新方法和进展。
关键词: 双向凝胶电泳 蛋白质组 等电聚焦
ProcessofTwo-dimensionalElectrophresisandItsProgress
YeMiaoshuiZhongKeya HuXinwen GuoJianchun
(StateKeyLaboratoryofTropicalCropsBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou571101,China)
Abstract:Two-dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis(2D-PAGE)isakeytechniqueforproteomeresearch.This
articlehavesummarizedthetechnicprinciple,theprocesofexperimentmanipulateandthenewmethodsandprogresinthe
procesofexperimentwhichhaddevelopedrecentlyofTwo-dimensionalelectrophoresis.
Keywords:Two-dimensionalelectrophoresis Proteome Isoelectricfocusing
·综述与专论·
收稿日期:2005-12-28
基金项目:海南省教育厅科研基金重点项目(HZKZ200403)、海南省自然科学基金(30406)和中国热带农业科学院(Rky0526)
作者简介:叶妙水(1982-),男,汉族,在读硕士研究生,研究方向:植物基因工程
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
强离子强度的化合物(例如高浓度的 NaCl溶液),
会导致升压过程中电流太大而影响聚焦结果。
1.1.1离液剂 离液剂也叫变性剂(ChaotropicAgents),
其典型代表是尿素和硫脲。尿素是双向电泳样品制
备时最常用的变性剂,硫脲则可以帮助许多难溶的
蛋白质进行溶解。尿素和硫脲能够破坏蛋白质分子
间形成的氢键,从而防止由氢键引起的蛋白质聚集
及蛋白迁移中二级结构的形成。尿素的常用浓度为
8M,过低则达不到完全溶解样品的目的。单用硫脲
在水中的溶解度很低,高浓度尿素溶液能增强其溶
解度,通常选用含 5~8M尿素和 2M硫脲的混合缓
冲液[3]。
1.1.2 表 面 活 性 剂 表面活性 剂也称去垢剂
(Detergents)。经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水
基团后,还需要至少一种表面活性剂来溶解疏水基
团,消除疏水基团之间的相互作用,增强蛋白质在
其等电点 (pI)值处的溶解性。强离子型去垢剂如
SDS会影响蛋白所带的电荷,一般不适合在等电聚
焦中使用,因此使用时尽量选用非离子型或两性离
子表面活性剂,从而保证蛋白质仅依靠其自身的电
荷进行移动。常用的非离子型去垢剂是辛葡糖苷
(octylglucoside),两性去垢剂如 CHAPS及其羟基衍
生物 CHAPSO等,一般使用浓度都是 1%~2%[4]。现
在新出现的一些去垢剂如 SB3-10和 ASB-14[5]也能
用于蛋白质组研究中的样品制备。某些特殊样品只
有在去垢剂浓度达到 4%时才会溶解[6]。
1.1.3 两性电解质 由于有些蛋白质需要在盐离
子的作用下才能保持溶解状态,否则这些蛋白质在
处于其等电点时会发生沉淀。盐离子的存在有助于
样品的溶解,但却使聚焦过程中电流增大而造成升
压过程缓慢、聚焦时间延长;低盐或无盐虽然有利
于升压和缩短聚焦时间,但会使那些依靠盐离子溶
解的蛋白质发生沉淀。解决该问题的方法是在溶液
中加入两性电解质来代替盐离子,因此所有等电聚
焦溶胀缓冲液和样品溶液中都要加入两性电解质
来帮助蛋白质溶解。通常两性电解质在 IPG胶条上
样缓冲液中的浓度不超过 0.2%(w/v),因为高浓度
的载体两性电解质所带电荷较多,可限制因电压的
升高而延长等电聚焦的时间。
1.1.4 还原剂 在变性剂和表面活性剂联用条件
下,再加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完
全,溶解更彻底。还原剂帮助打开蛋白质的二硫键,
使待分析的蛋白质分离成为单一的蛋白亚基,对双
向电泳非常重要。
通常使用的还原剂为自由硫醇试剂如 β-巯基
乙醇或二糖硫苏醇(Dithiothreitol,DTT)以及不带电荷
的三丁基膦(Tributylphosphine,TBP),前者是一种硫
醇还原剂,当其浓度达到 50mM时可促进大多数蛋
白的半胱氨酸残基被还原,但由于 DTT的 pKa约为
8.0,因此 DTT的浓度太高会影响样品的 pH梯度。
TBP是比 DTT更有效的一种还原剂,它不带电荷,
而且在几个 mM浓度下就可以还原胱氨酸[7]。但它
比 DTT更难进行化学处理,目前有一些公司可以提
供较高浓度(200mM)的溶液。
1.2 样品的预分级
降低蛋白样品的复杂度,可以在双向电泳中增
强低丰度蛋白的可见度。降低样品复杂度的方法包
括:顺序抽提法[8]、亚细胞分离、层析法、或是用制备
型等电聚焦设备进行样品制备。
1.2.1 顺序抽提法 顺序抽提即利用蛋白样品在
不同的缓冲液中相对溶解度不同而将其溶解在不
同的溶液中进行 2-DE的方法。顺序抽提可提高样
品蛋白的提取[9]。
用Digitonin/EDTA→Tritonx-100/EDTA→Tween40/
Deoxyoholate顺序抽提可以从一个细胞样品中依次
分离出细胞液、膜结构/细胞器、核和细胞骨架[10]。利
用三种溶解性逐渐增强的溶液:试剂 1用于抽提可
溶性蛋白质(如胞内蛋白),试剂 2抽提中等溶解度
的蛋白质,试剂 3则用于抽提前两种试剂都不溶解
的蛋白质。将生物样品进行分步抽提可得到三组溶
解性不同的样品产物,再分别将它们进行双向电
泳,可以检测出比单用任何一种方法处理的同源
样品更多的蛋白质点,且特定蛋白质的浓度得到增
强[8,11]。
1.2.2 亚细胞分离 亚细胞分离即将样品蛋白质
分离成不同的细胞器进行 2-DE的方法。常用的方
法包括密度梯度、免疫分离细胞和组织、蛋白质的
亲和富集等[12~14],可以得到细胞核组分、线粒体、高
尔基体、溶酶体和吞噬体等。由于研究对象变为细
胞蛋白组的亚群,蛋白质的多样性和复杂性得到降
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2006年第3期 叶妙水等:双向凝胶电泳的实验操作及进展
低,可使低表达蛋白富集并得到分析,同时对进一
步了解蛋白质定位和信号转导具有重要的意义。
1.2.3 蛋白样品的纯化 双向电泳实验对蛋白质
样品的要求非常严格,样品中的任何杂质都会对其
后的等电聚焦过程产生影响。因此,必须通过纯化
尽可能的将样品中的各种去垢剂、盐份、多肽、核
酸、脂类、酚和其它一些小离子(可降低蛋白样品的
导电性),同时对低浓度样品进行浓缩;另外,须将
半胱氨酸形成的二硫键还原,并使之长时间处于还
原状态(一般采取烷基化),保持样品的溶解性。
1.3 预防角蛋白的污染
当使用灵敏度较高的检测方法时,样品的处理
应非常小心,尽量避免角蛋白的污染。银染时常会
在 50~70kD的区域看到人工假点,以及明显的与移
动方向平行的不规则垂直条纹,这是由污染的皮肤
角蛋白降解所引起的(样品溶液中的角蛋白通常聚
焦在 pH5附近)。皮肤角蛋白也是质谱中最常见的
污染物。防止角蛋白污染的方法包括将单体溶液、
样品储液、凝胶缓冲液、以及电泳缓冲液等用硝化
纤维膜过滤后储存与干净容器中,用清洁剂彻底清
洗电泳装置,所有的实验操作都戴手套进行等。
2 第一向分离:等电聚焦
蛋白质是两性分子,在不同的 pH环境中可以
带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说
都有一个特定的 pH,此时蛋白质的静电荷为零,此
pH值即该蛋白质的等电点 (pI)。将蛋白质样品加
载至 pH梯度介质上进行电泳时,它会向与其所带
电荷相反的电极方向移动。在移动过程中,蛋白分
子可能获得或失去质子,并且随着移动的进行,该
蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移
至其等电点 pH位置时,其净电荷数为零,在电场中
不再移动。聚焦是一个与 pH相关的平衡过程:蛋白
质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的 pI
值;在等电聚焦过程中,蛋白质可以从各个方向移
动到它的恒定位点。
2.1 固相 pH梯度胶条的选择
尽管固相 pH梯度胶条(IPG)、或载体两性电解
质管状凝胶,都可以用于蛋白质的等电聚焦分离[15],
但前者比老的管状电泳方法分离有重复性好、操作
方便、可高通量操作等众多优点。IPG是当前等电聚
焦实验的最主流技术。在进行等电聚焦中,保持 pH
梯度的稳定性、线性和可重复性,对实验至关重要,
而 IPG胶条可最大程度的满足这种要求[16]。
2.1.1 pH梯度范围的选择 依据研究的目的,应
选择适当 pH梯度范围的胶条。由于生物体中大部
分蛋白的等电点在 pH4~8之间,线性宽 pH范围的
胶条(pH3~10)尽管可以在同一块凝胶上显示样品
中绝大多数的蛋白质,但大量的蛋白点都集中在胶
条的中间,两端的蛋白点较少,从而造成中间的分
辨率较低。
使用窄范围重叠 pH梯度的胶条(pH3~6,pH5~
8,pH7~10)可以大大提高分辨率和灵敏度。如果用
同样长度的 3根窄 pH梯度的胶条代替一根宽 pH
范围的胶条(pH3~10)进行电泳,窄范围 pH胶条自
身的 pH范围很窄,而胶条的长度未变,蛋白点的分
辨率比宽 pH范围胶条要高;又因为对每根胶条来
说超出其 pH范围之外的蛋白质不被聚焦,所以每
根胶条允许有更多的上样量。由于这三种窄范围
pH梯度的胶条有一个 pH的重叠,因此利用双向电
泳图象分析软件可以将重复区域的蛋白质斑点进
行匹配,从而得到一张合成图“cybergel”,该合成
图中能观察到的蛋白点要明显多于单用一根宽范
围的胶条所分离得到的蛋白点。微范围 pH梯度胶
条 (pH3.9~5.1,pH4.7~5.9,pH5.5~6.7,pH6.3~8.3)
能进一步提高凝胶的分辨率,尤其适用于低丰度蛋
白的检测。
2.1.2 凝胶尺寸的选择 商品化的 IPG胶条的长
度有 7、11、17、18、24cm等几种规格,不同长度的胶
条聚焦时的条件不同,用途也有一定的差异。小尺
寸胶条的电泳时间短,可用于优化样品制备等预实
验;而大尺寸胶条的电泳时间长,则用于对复杂样
品进行更为彻底的分析并鉴别出感兴趣蛋白。
有时也可以用小尺寸、重叠窄 pH范围的 IPG
胶条来聚焦感兴趣蛋白。如前所述,利用 3种窄 pH
范围的、有重叠区域的预制 IPG胶条走出来的蛋白
质图谱,经过软件对重叠区进行处理,能使 pI的有
效宽度增加两倍多,可完全取代大尺寸胶条。
2.2 蛋白质的上样
2.2.1 上样量的确定 将样品上样到 IPG胶条中
的量变化范围较大,可从几微克到 1毫克以上。决
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
定具体上样量的因素有很多,其中最主要的是:
(1)分析的要求:目的蛋白的上样量一定要达
到检测范围。如用 7cm胶条和考马斯亮蓝染色,
100ug的总蛋白上样量,可以检测到复杂样品中表
达中等的蛋白质;同样的上样量,用银染或荧光染
料蛋白质凝胶等更灵敏的染色方法可以检测到许
多低丰度的蛋白质。
(2)样品的复杂性:高度复杂的样品中含有多
种浓度相差很大的蛋白质,这就需要一个相对折衷
的上样量来保证高丰度的蛋白质不影响低丰度蛋
白质的观察。通过预分级富集蛋白的方法,可以使
样品中特定类型的蛋白质浓度增加,这样各种蛋白
质的浓度都可以达到一个比较适合的数值,即使是
低丰度的蛋白质也可以有足够的上样量。
(3)IPG胶条的 pH范围:通常窄 pH范围的胶
条蛋白质上样量大,因为只有 pI值在第一向胶条
pH范围内的蛋白质才会在第二向凝胶中出现。
2.2.2 溶胀上样 蛋白质的上样主要有溶胀加样
和杯上样两种方法。因杯上样法难以操作且人为因
素影响大,所以通常不选择这种方法,现主要介绍
溶胀加样法。
因为商品化的 IPG胶条都是脱水的干胶条,在
使用时需要将它溶胀到 0.5mm厚度。所以若在溶胀
缓冲液中加入预制好的蛋白质样品,样品中的蛋白
质在溶胀过程中将被均匀地吸收进入整个胶条中
[17],此即溶胀上样。
胶条在含有样品的上样溶液中至少需溶胀 11
个小时以上才能进行聚焦,此时胶条被充分泡胀,
其中孔径都扩张至最大,样品中的大分子蛋白有更
充分的时间进入胶条。
溶胀加样的优点有:
(1)样品上样非常简单。
(2)溶胀前上样解决了用样品杯上样时出现的
样品沉淀问题。
(3)在等电聚焦前蛋白质样品已经完全进入胶
条,所以可缩短聚焦时间。
(4)提高蛋白上样量。
2.3 等电聚焦(IEF)
胶条充分溶胀后,用湿润的滤纸小心的吸干胶
条上的多余液体后,将其转移到等电聚焦盘中进行
等电聚焦。
等电聚焦时,胶条的导电性会随时间的改变而
发生变化,尤其在开始的一段时间更为明显。当等
电聚焦开始时,IPG胶条在电场作用下会出现许多
载体电荷,导致胶条中产生非常高的电流。随着聚
焦过程的进行,带有电荷的杂质移动到电极处、蛋
白质移动到与它们的 pI值相同的 pH点,每个蛋白
和载体两性电解质电荷就会减少,电阻逐渐增加,
电流会逐渐降低。
胶条的 pH范围、长短、及所加载的电场都会对
等电聚焦的结果产生影响。理论及实验数据表明,
相邻两蛋白点的分辨率与 pH梯度的平方根成正
比,与电压梯度的平方根成反比[15,18]。因此选用相对
窄范围的 pH胶条、采用高电压就可以得到较好的
聚焦结果。而要想得到最好的结果,就必须使用窄
范围的 IPG胶条,同时加以高电压。
要得到稳定、重复性好的等电聚焦结果,就必
须维持伏特小时数(volt-hours)的一致。用分步升压
的方法来达到设定的最终聚焦电压,对等电聚焦结
果非常重要。升压过程能够从 IPG胶条中清除样品
中所有的离子成分,同时又能减少胶条因电流而产
生的热量。样品聚焦所需要完成的伏特小时数主要
由样品复杂性决定,样品越复杂,聚焦的伏特小时
数相应增加。
因为 IPG凝胶的 pH梯度是固定的,聚焦后的
蛋白质在它们的 pI值处比常规的 IEF凝胶稳定。聚
焦后的 IPG胶条可在-20℃长期保存,而不会影响最
终的双向电泳图象。
3 第二向分离:SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳
双向电泳的第二向是将 IPG胶条中经过第一
向分离的蛋白转移到第二向 SDS-PAGE凝胶上,根
据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相
垂直的分离。
蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负
电荷的蛋白质-SDS复合物,由于 SDS是一种强阴离
子去垢剂,所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有
的电荷量,能消除不同分子之间原有的电荷差异,
从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电
荷的影响,而主要取决于蛋白质分子的质量大小,
其迁移率与分子量的对数呈线性关系[15,18]。在蛋白
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2006年第3期
质组研究中,需要在同样的条件下同时走多块胶,
这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。
3.1 IPG胶条的平衡
胶条由第一向转移到第二向之前,需要先进行
平衡。这一过程包括蛋白质二硫键的还原、半胱氨
酸残基的烷基化,以及样品与 SDS结合为第二向根
据分子量(MW)的分离做准备。平衡步骤:将胶条放
入槽中,胶面朝上,首先在 DTT平衡液中轻微摇荡
10分钟,然后弃掉平衡液,再重新注入碘乙酰胺平
衡液 10分钟。平衡过后,取出 IPG胶条,进行包埋。
平衡母液为:6M Urea尿素;2% SDS;0.05M
Tris/Hcl;20%甘油。
DTT缓冲液则在母液中加入 DTT使终浓度为
2%。
碘乙酰胺平衡液则在母液中加入碘乙酰胺使
终浓度为 2.5%。
3.2 胶条的转移及包埋
将第二向凝胶稍微向后倾斜放置 (约 30度
角)。将带有塑胶支撑的 IPG胶条置于凝胶的上方
的玻璃板上,塑料膜背贴玻璃板。用压舌板轻轻的
向下推动胶条,注意不能损坏胶条。确保 IPG胶条
正好位于第二向凝胶的上方,与凝胶完全接触,然
后再覆盖上 0.5%~1.0%熔融的用 SDS-PAGE电泳缓
冲液配制的琼脂糖 (在琼脂糖中加入少量的溴酚
兰,可以观察到电泳的进程)。琼脂糖的温度不能太
高,热的琼脂糖会加速平衡缓冲液中尿素的分解。
当用琼脂糖覆盖胶条时,常会在胶条的下面或背面
形成气泡。这些气泡会干扰蛋白质的迁移,所以必
须去除。通常在刚加入琼脂糖后,赶快用压舌板轻
压胶条塑胶支撑膜的上方,驱赶气泡。
3.3 电泳及分子量大小计算
SDS-PAGE中多肽的移动速度与分子量的对数
成反比。多肽分子量越大,它在凝胶中的移动速度
越慢,蛋白质分子量的对数与它的移动距离成线性
函数。在 SDS-PAGE中,可以通过未知蛋白质点与
已知标准蛋白质位置的比较来确定蛋白质的分子
量。SDS-PAGE梯度胶也同样可以用来计算蛋白质
分子量,此时 log MW与 log(%T)成正比,因为是线
性梯度胶,%T又与移动距离成正比,因此 logMW
也与移动距离成正比。
分子量标准曲线是 S形的,因此标准曲线中的
线性部分不能涵盖凝胶中所有蛋白质的分子量范
围。但是,因 logMW的变化相当慢,所以无论是否
在线性范围内,都可以在一个相当宽的范围内相对
精确的计算出分子量[15,18]。
4 凝胶中蛋白的检测
凝胶染色的目的是使其中的蛋白质能够被观
察到。目前还没有通用的染色方法,只能在考虑多
种因素如需要的灵敏度、线性范围、方便程度、费
用、以及成像设备类型等基础上,结合实际进行选
择。有时也可以将蛋白转膜后通过免疫印迹的方法
来进行检测。
4.1 染色法检测蛋白
双向电泳的目的包括分析和制备。实验目的不
同,样品上样量和检测方法也不同。最常用的方法
是通过普通染料或金属染料来检测凝胶中的蛋白
表1 几种主要染色方法比较
染色方法 灵敏度 特点
银染[20] 2～5ng 最敏感的非放射性显影方式,低背景,质谱匹配
考马斯亮蓝 8～40ng 方法简便,定量优于银染,质谱匹配
金属锌负染色[21] 4～8ng 显影敏感度高,定量性差,质谱匹配
荧光标记染色[22] 1～10ng 定量佳,质谱匹配
差异凝胶电泳[23] 1～10ng 应用两种不同的染料荧光标记两个样品
质。因为各种染色方法灵敏度的不同和不同类型的
蛋白质对不同的染色方法有特异性,所以各种染色
方法都各有其优缺点。
如果要检测低丰度的蛋白质,就需要加大蛋白
质的上样量(0.1~1mg/ml),同时采用高灵敏度的染
色方法,比如银染或荧光染色[19]。如果是要制备足
够的样品作为抗原或用来测序,也需要加大蛋白质
上样量,同时要选用的染色方法不会将蛋白质固定
在凝胶中。若需进行蛋白质含量的比较,则需选用
检测线性范围大的染料。染色所能达到的灵敏度由
叶妙水等:双向凝胶电泳的实验操作及进展 9
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第3期
以下因素决定:1)与蛋白质结合的染料数量;2)染
色的强度;3)凝胶上的蛋白质和凝胶背景之间的差
异——即信噪比(表 1)。
4.2 免疫印迹法检测蛋白
某些合成的膜可与蛋白质分子紧密结合,其强
度足以保证可以在膜上作固相的免疫测定、染色、
或其它的固相分析。通常将电泳分离出的蛋白质组
分转移到支撑膜上的方法,称为免疫印迹法。结合
到膜上的蛋白质分子仍保留其天然抗原性且更容
易与抗体反应。现已发展出很多种可直接探测合成
膜上的蛋白质分子的技术。
5 图像采集和分析
成像设备可以摄入图像,对凝胶图像以数字形式
保存,对每块凝胶图像进行平等的比较,在各研究组
之间传递信息,并对大量的数据进行归类分析。目前
应 用 较 为 广 泛 的 图 像 分 析 软 件 有 PDQuest、
ImageMaster2D Elite、Melanie、BioImageInvestigator
等,分辨率较高,功能齐全。尽管如此,仍不可避免约
10%的未检出点和假点,需要手工添加、删除和分割
[11]。图像采集完成后,可以应用各种分析软件进行分
析,可以收集、诠释、比较蛋白质组数据资料等。
6 蛋白鉴定
一旦通过差异分析或其它方法找到感兴趣的
蛋白后,就可以从凝胶中或膜上切取这些目标蛋白
质作鉴定。现在绝大多数蛋白质的鉴定是通过质谱
分析来完成的。
总而言之,目前双向凝胶电泳技术尚未完善,
手工操作较多,经验性强,同时双向电泳存在许多
局限性,如重复性差,疏水蛋白、低表达量蛋白、极
酸和极碱性蛋白、分子量较小和较大蛋白的分离还
较为困难,高通量自动化尚未达到等。尽管如此,双
向电泳仍然是目前分离蛋白质最有效的方法之一,
广泛应用于医学领域的研究工作,如通过寻找差异
蛋白质,发现疾病相关的蛋白质,寻找用于诊断的
疾病相关标记分子,寻找疾病相关的蛋白质药靶,
以用于药物设计,研究疾病的致病机理等。
参 考 文 献
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