全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2006年第5期
收稿日期:2006-04-04
基金项目:国家“高新技术发展计划(863)”(2004AA628060),上海市青年科技启明星计划(04QMX1411)和上海高校优秀青年教师后
备人才计划(0303YQHB024)资助
作者简介:刘妍(1981-),女,硕士,主要从事海绵共附生微生物的研究。E-mail:tracy_lau@sjtu.edu.cn
通讯作者:李志勇,男,博士,副教授,研究方向:海洋生物技术,E-mail:zyli@sjtu.edu.cn
放线菌(actinomycetes)是一类高(G+C)%的革兰氏阳性细菌,具有合成独特的次生代谢产物的能力。现
在已发现的数万种微生物来源的生物活性物质中,约有 70%是由放线菌合成的[1]。人们对源于土壤的放线
菌了解比较多[2],而对于海洋放线菌还知之甚少。由于海洋独特的高盐、高压、低营养、低温等环境[3],海洋
放线菌可能具有陆地放线菌不具有的生物活性。越来越多研究表明,一些原本认为是海绵产生的活性物质
其实是由其共附生的微生物产生的[4]。海绵共附生放线菌可能参与海绵的化学防御[5],具有尚没有被认知
的生物功能。
尽管国内外已经对来自海绵的细菌、放线菌开展了一些研究,但大多活性筛选集中在抗菌、抗肿瘤方
面 [6,7],目前国际上关于海绵共附生放线菌酶活性的研究非常少。我们已经从我国南海的贪婪倔海绵
(Dysideaavara)和细薄星芒海绵(Steletatenui)中分离筛选出了多株具有广谱、高效的抗菌活性的细菌
[8,9]。我们尝试从南海海域采集的澳大利亚厚皮海绵(Craniela australiensis)中分离得放线菌,对其蛋白酶、
琼胶酶、纤维素酶、几丁质酶、和酯酶的活性进行筛选,并通过 16SrDNA测序对这些菌株进行分子鉴定,目
的在于发现具有应用价值的海洋放线菌。
1 材料与方法
具有多重酶活性的澳大利亚厚皮海绵共附生放线菌的研究
刘妍 李志勇
(上海交通大学生命科学技术学院海洋生物技术实验室,上海 200240)
摘 要: 从我国南海澳大利亚厚皮海绵分离得到23株放线菌,并对其蛋白酶、琼胶酶、纤维素酶、几丁质酶和酯酶活
性进行了筛选,同时基于16SrDNA序列信息对放线菌进行了分子鉴定。研究发现23株放线菌全部具有较强的生物酶活
性,其中21株放线菌具有至少3种以上的酶活性,17株具有除酯酶活性以外的4种酶活性。通过序列比对与系统发育分析
证实12株放线菌属于链霉菌属(Streptomyces)。这些分离自海绵具有多重生物酶活性的放线菌具有较大的潜在应用价值。
关键词: 澳大利亚厚皮海绵 放线菌 酶活 16SrDNA 系统发育分析
StudyontheMarineSpongeCranielaAustraliensisAssociated
ActinomyceteswithMultipleEnzymicPotentials
LiuYan LiZhiyong
(MarineBiotechologyLaboratory,SchoolofLifeScienseandTechnolgy,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240)
Abstract: 23actinomycetesstrainswereisolatedfrommarinespongeCranielaaustraliensisandtheznzymicpotentials,
protease,agarase,celulase,chitinaseandlipase,werescreened.Meanwhilethesestrainswereidentifiedusing16SrDNAsequence-
basedmethod.Theresultsshowedthatalthe23strainswerewithstrongerenzymicpotentials,amongwhich21strainshavemore
than3diferentenzymicpotentials,17strainshavemorethan4diferentenzymicpotentials.12outof23strainswereidentifiedas
genusStreptomyces.Theseactinomyceteswithmultipleenzymicpotentialsarewithgreatapplicationvalue.
Keywords:SpongecranielaaustraliensisActinomycetesEnzymepotential16SrDNA Phylogeneticanalysis
生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第5期
1.1 海绵采集与鉴定
采集自海南三亚西岛周边 5~20m深海域,并由中国科学院海洋研究所李锦和研究员鉴定为寻常海绵
纲(Demospongiae)、离海绵目(Choristida)的澳大利亚厚皮海绵(Cranielaaustraliensis)。
1.2 放线菌分离与纯化
采用无水甲醇浸泡澳大利亚厚皮海绵 1个月,取 200ml甲醇浸泡汁,小于 50℃真空浓缩、干燥,用 30ml
无菌水溶解固形物制备海绵浸出汁,4℃冰箱保存备用。基本培养基为人工海水 (ASW)(NaCl26.518g,
MgCl22.447g,MgSO43.305g,CaCl21.141g,KCl0.725g,NaHCO30.202g,NaBr0.083g,蒸馏水 1000mL)。采用添
加海绵浸出汁和终浓度为 50mg/L的重铬酸钾和制霉菌素、18g\L的琼脂制平板,平板上铺展 9mm直径的
灭菌定量滤纸。采用无菌水洗去表明微生物,无菌条件下用无菌手术刀将海绵组织样品切碎成 10mm3碎
块,铺在滤纸的表面,28℃恒温培养 21d进行放线菌的分离培养释放体内微生物。挑取单克隆,采用人工海
水配制的添加重铬酸钾和制霉菌素的高氏一号培养基[10]反复划线直至得到纯的菌株。根据菌落形态挑取
代表性的菌株。
1.3 酶活筛选
纤维素酶筛选培养基:0.5g\LMgSO4,0.5g\LK2HPO4,0.5g\LNaCl,1g\LKNO3,0.1g\L酵母粉,0.1g\L蛋白胨,
滤 纸 条 (长 5cm, 宽 0.8cm); 几 丁 质 酶 筛 选 培 养 基 :100ml/L几 丁 质 胶 体 ,2g\LK2HPO4·3H2O,1g\L
KH2PO4,0.7g\LMgSO4·7H2O,0.1g\LCaCl2,0.5g\L酵母粉,0.05g\LZnSO4,0.05g\LFeSO4·7H2O,20g\L琼脂;蛋白酶
筛选培养基:100g\L脱脂奶粉,20g\L琼脂;琼胶酶筛选培养基:1000ml人工海水,20g\L琼脂;酯酶筛选培
养基:5g\L牛肉膏,10g\L蛋白胨,5g\LNaCl,10g\LTween20,20g\L琼脂。
将待测菌株接种在上述培养基上,28℃培养 7～14d。滤纸条断裂分解说明具有纤维素酶活性;培养基
上出现透明圈说明具有几丁质酶和蛋白酶活性;用 Lugol碘液对琼胶平板染色,能形成透明圈的说明具有
琼胶酶活性;Tween20平板的菌落周围出现丝状花纹说明有酯酶活性。每个待测菌做 3个平行样并重复 3
次。
1.4 菌株的分子鉴定
参照文献[11]提取放线菌总 DNA作为模板,采用引物 27f(5-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和 1492r
(5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)扩增放线菌的 16SrDNA[12]。PCR反应程序如下:94℃(3min)-[94℃(45s)-
57℃(45s)-72℃(2min)](30cycles)-72℃(10min)-4℃。
将 PCR产物送交上海英骏生物公司从 1492r端进行测序。将测得的 16SrDNA序列与 GenBank数据库
中已有序列进行比对,用 ClustalX和 MegaI软件进行多序列比对,采用 Neighbor-Join法进行系统发育树的
构建。
2 结果与讨论
2.1 放线菌的分离纯化
28℃培养 3周后滤纸表面出现菌落,在人工海水配制的高氏一号培养基上反复划线纯化后,根据菌落
形态挑选得到 23株放线菌,编号为 DA01~DA14,DA17~DA25。
陆生放线菌资源已经在医药领域发挥了重要作用[13]。海洋放线菌尤其是与海绵共附生的放线菌资源
由于缺乏有效的分离和研究手段,并未得到很好的开发利用。
海绵共附生放线菌的相对数量较低,并且生长速度缓慢,传统方法很难分离得到。为了尽可能的模拟
海绵共附生放线菌原位的生长环境,更好地分离放线菌,我们采用寡营养的海水作为分离培养基,并且加
入海绵浸出汁提供放线菌生长所需的营养因子取得了比较好的分离效果。
2.2 放线菌的酶活筛选
对这 23株放线菌进行酶活筛选,发现全部具有生物酶活性(表 1),其中 21株放线菌具有至少 3种以
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2006年第5期 刘妍等:具有多重酶活性的澳大利亚厚皮海绵共附生放线菌的研究
上酶的活性,17株具有除酯酶活性以外的 4种酶的活性。相比较而言,DA08和 DA09菌株的酶活性相对较
少、较弱,除这两株放线菌外,其他菌株都具有蛋白酶和琼胶酶的活性,但是只有 DA08具有酯酶活性。滤
纸的使用使我们分离得到的大多数放线菌都具有纤维素降解能力。
纤维素是植物的重要组成成分,是地球上数量最大的可再生性资源。微生物对纤维素的降解促进了地
球生物圈的碳循环。纤维素降解旺盛的环境往往缺乏氮源,具有几丁质分解能力的微生物能够为物质循环
提供氮源[14]。链霉菌属(Streptomyces)的放线菌不仅能够降解纤维素[15],还具有分泌胞外几丁质酶的能力
[16]。链霉菌的这种特性使之在环境中具有生存优势[17]。海洋几丁质的产量据估计约为 1011吨/年,如此大量
的几丁质主要依靠海洋微生物来分解,海洋放线菌具有极强的几丁质降解能力[18]。此外,海洋细菌产生的
蛋白酶、琼胶酶和酯酶往往具有低温酶的特性,在食品、分子生物学领域已得到广泛应用[19,20]。
国内外很少有研究报道揭示一菌株的蛋白酶、琼胶酶、纤维素酶和几丁质酶等多种酶活性。海绵共附
生放线菌具有的多种水解酶活性可能在海绵的营养转化、污染降解、化学防御等过程中发挥作用。本文从
澳大利亚厚皮海绵中分离得到的具有多重生物酶活性的 23株放线菌在医药、环保和食品工业领域具有潜
在的应用价值。
表1 23株澳大利亚厚皮海绵共附生放线菌的酶活
(-)Noactivity,(+)weakactivity,(++)moderatactivity,(+++)excelentactivity
2.3 放线菌的序列比对与系统发育学分析
将得到的 23个菌株的 16SrDNA序列提交 GenBank得到注册号 DQ180118-140,与基因库菌株进行序
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2006年第5期
列比对结果见表 2。同源性分析结果证实这 23株菌均为放线菌,并大致分为 3个类群:GroupI:Actino-
mycetalesbacterium H07(DA01,DA02,DA10,DA12,DA13,DA14,DA19,DA20,DA21,DA22,DA24)11株;
GroupI:Streptomycessp.FXJ23(DA03,DA04,DA05,DA06,DA7,DA11,DA17,DA18,DA23,DA25)10株;
GroupII:Streptomycessp.VA26256_03(DA08,DA09)2株,相对丰度分别为 47.8%,43.5%和 8.7%。
构建的系统发育树如图 1。DA08和 DA09这两株菌与其他菌的亲缘关系较远,这一结果与我们前面得
到的这两株菌与其他菌的酶活差异比较大的结果相一致。尽管不同菌株产生水解酶的种类与酶活强弱都
有所差异,在系统树上同源性高的菌株的酶活特性也比较相似。
表2 澳大利亚厚皮海绵共附生放线菌的序列比对结果
3 结论
采用模拟海绵体内环境的培养基从澳大利亚厚皮海绵分离得到 23株放线菌,研究发现该 23株放线
菌全部具有较强和多重的生物酶活性,其中 21株放线菌具有至少 3种以上的酶活性,17株具有除酯酶活
性以外的 4种酶活性。通过序列比对与系统发育分析证实分离到的这 23株放线菌有 12株属于链霉菌属
(Streptomycessp)。
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图 1 依据澳大利亚厚皮海绵共附生放线菌 16SrDNA序列的系统发育树
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